每種細胞懸液分成若干小份，各份中加入梯度釋度的Trastuzumab(購買自羅氏制 藥有限公司）、CetUximab (購買自默克雪蘭諾公司）或Rituximab (購買自羅氏制藥有限公 司）；共同孵育一小時后，用PBS洗滌細胞兩遍；用相同體積的PBS重懸細胞后，加入相同濃 度的FITC標記的羊抗人IgGK鏈抗體F(aV )2段（Sigma公司產品）；孵育一小時后，在 流式細胞儀（BD公司FACSCalibur)上測定細胞的平均熒光強度。
[0039] 實驗結果：如圖1所示，上述上述兩種基因工程T細胞均可結合IgG抗體 Trastuzumab、Cetuximab 或 Rituximab，其中 CD64-CART 的結合力明顯強于 CD16A-CART。
[0040] 實施例4.基因工程T細胞的由抗體介導的細胞毒作用和細胞因子產生 [0041 ] 實驗步驟：PBMC獲得方法與與實施例2中所述相同；PBMC作為效應細胞與作為靶 細胞的ΒΤ474 (乳腺癌細胞系，購自ATCC)、ΗΤ29 (結腸癌細胞系，購自ATCC)和Daudi細胞 (Burkitt淋巴瘤細胞系，購自ATCC)(分別高表達腫瘤相關抗原HER2、EGFR和⑶20)分別 混合，效應細胞與靶細胞之比為20 :1 ;另外，上述基因工程T細胞作為效應細胞也分別與 BT474、HT-29和Daudi等靶細胞以20 :1的比例混合；然后在含有BT474、HT-29和Daudi的 混合細胞培養物中分別加入梯度稀釋的Trastuzumab、Cetuximab和Rituximab，共同孵育 4小時；然后用乳酸脫氫酶（LDH)細胞毒檢測試劑盒（Roche公司產品）檢測細胞培養上清 中LDH的活性。
[0042] 絲裂霉素處理過的BT474、HT29和Daudi細胞分別與上述基因工程T細胞以1 : 20的比例混合，然后在細胞培養混合物中分別加入梯度稀釋的Trastuzumab、Cetuximab和 Rituximab，于37°C、5% C02培養箱中共同孵育24小時；然后取細胞培養物上清用酶聯免疫 吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)測定上清中 IL-2 的含量。ELISA法 測定上清中IL-2含量的具體實施步驟如下：大鼠抗人的IL-2捕獲抗體（BD Biosciences 公司產品）用0. 05M碳酸鹽緩沖液（pH9. 6)稀釋成2 μ g/ml，96孔酶標板（Corning公司產 品）每孔添加100 μ 1上述稀釋后的抗體溶液，置于37°C恒溫箱中孵育2小時；用洗滌緩沖 液（含有〇· 05% Tween-20的磷酸鹽緩沖液）洗3次，每次3分鐘；然后加入封閉液（含有 5 %脫脂奶粉的0. 05M碳酸鹽緩沖液，pH 9. 6)，于4°C冰箱內過夜；次日，棄去孔內溶液，用 洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘；將稀釋4倍的100 μ 1上清加于上述已包被的反應孔中， 置37°C孵育1小時；用洗滌緩沖液洗滌后，加濃度1 μ g/ml的生物素化大鼠抗人的IL-2檢 測抗體（BD Biosciences公司產品）于各反應孔中，每孔100 μ 1，37°C孵育1小時；洗滌緩 沖液洗滌后，加濃度1 μg/ml的辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素（Str印tavidin-HRP，BD Biosciences公司產品）于各反應孔中，每孔100 μ 1，37°C孵育1小時；用洗滌緩沖液洗滌 后，于各反應孔中加入臨時配制的TMB底物溶液100 μ 1顯色，37°C放置10~30分鐘；于各 反應孔中加入2M硫酸50 μ 1終止反應；置SpectraMax i3酶標儀（美國Molecular Devices 公司產品）測定450nm波長處吸光值。
[0043] 如圖2和圖3所示，結果表明上述基因工程T細胞與相應抗體組合后可以通過裂 解靶細胞實現殺傷作用，細胞毒性明顯強于PBMC，并且可同時分泌與增強免疫緊密相關的 細胞因子IL-2。
[0044] 實施例5.基因工程T細胞的體內抗腫瘤作用
[0045] 為檢測抗基因工程T細胞的體內抗腫瘤活性，此處采用以重度免疫缺陷N0G小鼠 為宿主的人腫瘤移植模型。由于實驗規模的限制和處于動物保護的考慮，此實施例只選用 CD64-CART進行相關動物實驗。
[0046] 將BT474接種于5-6周齡的雄性N0G小鼠（上海斯萊克實驗動物有限公司）右 側皮下，待接種細胞需要與一定量的Matrigel(BD Bioscience公司產品）預先混合，每只 接種1 X 107個腫瘤細胞，；待腫瘤生長至200_ 3左右時，將小鼠隨機分組，每組8只，各個 實驗組分別向腫瘤內部直接注射Trastuzumab或相應抗體與⑶64-CART細胞的組合，各 個對照組分別注射無關對照蛋白人IgGl或無關對照人IgGl與⑶64-CART細胞的組合， Trastuzumab劑量設置為0. 5和2mg/kg ; -周后再重復給予相同處理一次。
[0047] 將HT-29接種于5-6周齡的雄性NOG小鼠（上海斯萊克實驗動物有限公司）右側 皮下，每只接種5X10 6個腫瘤細胞；待腫瘤生長至200_ 3左右時，將小鼠隨機分組，每組8 只，各個實驗組分別向腫瘤內部直接注射Cetuximab或相應抗體與⑶64-CART細胞的組合， 各個對照組分別注射無關對照蛋白人IgGl或無關對照人IgGl與⑶64-CART細胞的組合， Cetuximab劑量設置為1和4mg/kg ;-周后再重復給予相同處理一次。
[0048] 尾靜脈注射將Daudi接種于5-6周齡的雄性N0G小鼠（上海斯萊克實驗動物有限 公司），每只接種1X 1〇5個腫瘤細胞；第二天將小鼠隨機分組，每組8只，各個實驗組分別向 腫瘤內部直接注射Rituximab或相應抗體與⑶64-CART細胞的組合，各個對照組分別注射 無關對照蛋白人IgGl或無關對照人IgGl與⑶64-CART細胞的組合，Rituximab劑量設置 為0. 5和2mg/kg ;-周后再重復給予相同處理一次。
[0049] 每3天用游標卡尺測量腫瘤直徑的長（a)和寬（b)，用如下公式計算腫瘤體積：V =aXb2/2 ;最后用統計軟件GraphPad Prism 5作圖并分析實驗結果。對接種Daudi細胞 的小鼠，每天統計各組小鼠的死亡情況，最終數據用Kaplan-Meier生存曲線分析。
[0050] 結果表明：如圖4所示，對于免疫缺陷小鼠的BT474移植瘤模型，Trastuzumab和 抗體與CD64-CART細胞的組合均明顯能夠顯著抑制腫瘤的生長，但后者能夠使腫瘤完全消 退并且長時間不再復發；如圖5所示，對于免疫缺陷小鼠的HT29移植瘤模型，Cetuximab 沒有顯著抑制腫瘤的生長，而抗體與CD64-CART細胞的組合能夠使顯著抑制腫瘤生長，在 抗體高劑量時甚至使腫瘤完全消退；如圖6所示，對于免疫缺陷小鼠的Daudi移植瘤模型， Rituximab顯著延長了小鼠的生存率，但抗體與⑶64-CART細胞的組合比Rituximab能夠更 加顯著地延長生存率，在抗體劑量最高時小鼠的生存率也最高。
【主權項】
1. 一種嵌合Fc受體的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO:2 或 SEQ ID NO:4。2. -種編碼權利要求1所述融合蛋白的核苷酸序列，其特征在于，編碼氨基酸序列SEQ ID NO:2的核苷酸序列為SEQ ID NO: 1;編碼氨基酸序列SEQ ID NO:4的核苷酸序列為SEQ ID N0:3〇3. -種表達權利要求1所述融合蛋白的載體，其特征在于，所述載體含有權利要求2所 述的核苷酸序列。4. 一種表達權利要求1所述融合蛋白的工程T細胞，其特征在于，所述工程T細胞含有 權利要求3所述的載體或其基因組中整合有權利要求2所述的核苷酸序列。5. -種藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物含有權利要求1所述的融合蛋白或 表達權利要求1所述融合蛋白的工程T細胞，以及藥學上可接受的載體。6. -種制備權利要求1所述融合蛋白的方法，其特征在于，包括以下步驟：在合適的表 達條件下，培養權利要求4所述的工程T細胞，并表達權利要求1所述的融合蛋白。7. 權利要求1所述融合蛋白或表達權利要求1所述融合蛋白的工程T細胞在制備抗腫 瘤藥物中的應用。
【專利摘要】本發明涉及一種嵌合Fc受體的融合蛋白及其制備方法和應用，所述融合蛋白的氨基酸序列為SEQ？ID？NO:2或SEQ？ID？NO:4。該融合蛋白可以與IgG的Fc結合，尤其是在與IgG的免疫復合物結合后，能夠有效激活嵌合Fc受體細胞內部的信號傳導功能，刺激細胞活化、增殖和分化，最終激活其免疫殺傷功能。
【IPC分類】A61K47/48, C12N5/10, C12N15/62, C12P21/02, C12N15/85, A61P35/00, A61K48/00, C07K19/00
【公開號】CN105601746
【申請號】CN201410674130
【發明人】趙杰, 張成海, 朱玲巧
【申請人】上海中信國健藥業股份有限公司
【公開日】2016年5月25日
【申請日】2014年11月21日