SEQ ID N0:4的核苷酸序列為SEQ ID N0:3。
[0016] 本發明第三方面，提供了一種載體，所述載體含有本發明第二方面所述的核苷酸 序列。
[0017] 本發明的第四方面，提供了一種工程T細胞，所述工程T細胞含有本發明第三方面 所述的載體或其基因組中整合有本發明第二方面所述的核苷酸序列。
[0018] 本發明的第五方面，提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物含有本發明第一方 面所述的融合蛋白或本發明第四方面所述的工程T細胞，以及藥學上可接受的載體。
[0019] 本發明的第六方面，提供了一種制備本發明第一方面所述的融合蛋白的方法，其 步驟包括：在合適的表達條件下，培養本發明第四方面所述的工程T細胞，并表達本發明第 一方面所述的融合蛋白。
[0020] 本發明的第七方面，提供了本發明第一方面所述的融合蛋白或表達所述融合蛋白 的工程T細胞在制備抗腫瘤的藥物的應用。
[0021] 本發明公開的上述嵌合Fc受體的融合蛋白可通過本領域常規方法得到的，例 如：編碼人源FcyRIA(CD64)和FcyRIIIA(CD16A)的cDNA購買自北京義翹神州生物技術 有限公司，其序列分別與國立生物技術信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI)中所提供的參照序列 NM000566. 3、NM001136219. 1 和 NM001127596. 1 相同。嵌合Fc受體，為包含Fc γ R的Fc結合結構域、跨膜區和能誘導T細胞活化的信號轉 導結構域的融合蛋白。其中跨膜區和信號轉導結構域參照專利US 20130309258 Α1。上述 FcyR的Fc結合結構域分別與跨膜區和信號轉導結構域以重疊 PCR法重組后克隆到慢病毒 載體pLVX-IRES-ZsGreenl (Clontech公司產品）中構建成真核表達載體；用脂質體法將上 述表達載體質粒與病毒包裝質粒轉染HEK293細胞，通過過濾和高速離心制備高滴度復制 缺陷的轉染用病毒。用血液透析白細胞去除法分離健康志愿者提供的血液樣品中的原代人 白細胞，然后用試劑盒R〇ssetSep(購買自Stem cell technology公司）進一步富集CD4和 CD8陽性T細胞，所得細胞在培養基中和抗CD3/CD28抗體包被的免疫磁珠共同培養以使T 細胞群體擴增。用上述病毒轉染所獲得的擴增后的T細胞，進而得到穩定持續表達嵌合Fc 受體的治療用基因工程T細胞。
[0022] 本發明的發明人對上述嵌合Fc受體進行親和力檢測、基因工程T細胞增殖實驗、 體內抑制腫瘤生長等實驗。實驗結果表明，本發明公開的基因工程T細胞可以與IgG的Fc 結合，尤其是在與IgG的免疫復合物結合后，能夠有效激活嵌合Fc受體細胞內部的信號傳 導功能，刺激細胞活化、增殖和分化，最終激活其免疫殺傷功能。實驗表明，與相應IgG抗體 組合使用，基因工程T細胞在體內外對表達特定抗原的腫瘤細胞均具有很高的殺傷效能。
[0023] 現有CAR-T細胞在移植到患者體內后經常會導致無法控制的強烈免疫反應，細胞 因子大量分泌，從而產生嚴重的毒副作用。然而，本發明融合蛋白能夠通過調整相應抗體的 使用劑量來控制毒副作用。另外，本發明CAR-T細胞能夠與靶向多種抗原的抗體組合使用， 可以用于治療不同類型的疾病而不用重新設計新的基因表達載體。
【附圖說明】
[0024] 圖1是CD64-CART和CD16A-CART對IgG Fc段的親和力效果圖；
[0025] 圖2是由抗體介導的細胞毒作用結果圖；
[0026] 圖3是由抗體介導的細胞因子產生結果圖；
[0027] 圖4是由Trastuzumab介導的體內抗腫瘤作用效果圖；
[0028] 圖5是由Cetuximab介導的體內抗腫瘤作用效果圖；
[0029] 圖6是由Rituximab介導的體內抗腫瘤作用效果圖。
【具體實施方式】
[0030] 以下實施例、實驗例是對本發明的進一步說明，不應理解為對本發明的限制。實 施例不包括對常規方法的詳細描述，如那些用于構建載體和質粒的方法，將編碼蛋白的基 因插入到這樣的載體和質粒的方法或將質粒引入宿主細胞的方法。這樣的方法對本領域 中具有普通技術的人員是眾所周知的，并且在許多出版物中都有所描述，例如：Sambr 〇〇k， J. , Fritsch, E.F. and Maniais, T. (1989)Molecular Cloning ：A Laboratory Manual,2nd edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press。
[0031] 實施例1.嵌合Fc受體表達載體的構建以及慢病毒制備
[0032] 編碼人源FcyRIA(CD64)和FcyRIIIA(CD16A)的cDNA購買自北京義翹神州生物 技術有限公司。其中跨膜區和信號轉導結構域參照專利US20130309258 A1中的SEQ ID N0 12,其編碼序列由蘇州金唯智生物技術服務有限公司全基因合成。根據DNA序列分別設計 弓丨物用聚合酶鏈式反應擴增FcyR基因的Fc結合結構域編碼區，以及跨膜區和信號轉導結 構域的編碼區；設計引物時引入一定長度的互補重疊區，以便用重組PCR法將Fc結合結構 域基因連接到跨膜區和信號轉導結構域的基因片段上。
[0033] PCR均采用高保真DNA聚合酶（例如：Takara公司的PrimcSTARK HS DNA Polymerase)。反應條件按照DNA聚合酶生產商說明書合理設置：95°C 20秒；55°C 10秒， 72°C 1分/kb;30個循環。以上PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳純化回收后用于重組PCR的模 板，重組PCR反應條件為：95°C 20秒；55°C 10秒，72°C 2分；6個循環后再加入相應的引 物；95°C 20秒；55°C 10秒，72°C 1分/kkPCR產物經瓊脂糖凝膠電泳純化回收并克隆到 慢病毒載體pLVX-IRES-ZsGreenl中，測序驗證后確認獲得了正確的克隆。SEQ ID ΝΟ:1、 SEQIDNO:2分別顯示了嵌合CD64的核苷酸和氨基酸序列；SEQIDNO:3、SEQIDNO :4分 別顯示了嵌合⑶16A的核苷酸和氨基酸序列。
[0034] 攜帶目的基因的慢病毒載體與相應慢病毒包裝質粒共同轉染HEK293細胞，48小 時后收集細胞上清液，〇. 45 μ m濾膜過濾后，4°C以25000rpm離心2h，離心前在離心管底部 加入2ml含有20%蔗糖的磷酸鹽緩沖溶液形成一個蔗糖墊。離心完畢后小心取出超速離心 管，小心棄去上清液，留下管底沉淀。100 μ L冷PBS重懸，并輕輕吹打溶解沉淀，注意避免產 生氣泡，-80 °C凍存。
[0035] 實施例2.表達嵌合Fc受體的基因工程T細胞的制備
[0036] 分離白細胞的血液樣品均來自健康志愿者。血液的采集遵循本公司機構審查 委員會和并獲得志愿者的簽署的知情同意書。人外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC)通過以下方法獲得：在離心管中加入適量PBMC(Sigma公司產 品）；取肝素抗凝靜脈血與等量RPMI1640充分混勻，用滴管沿管壁緩慢疊加于分層液面 上，注意保持清楚的界面；水平離心2000rpmX 20分鐘；離心后管內分為三層，上層為血漿 和RPMI1640,下層主要為紅細胞和粒細胞，中層為淋巴細胞分離液，在上、中層界面處有一 以單個核細胞為主的白色云霧層狹窄帶，此細胞層包含單個核細胞包括淋巴細胞和單核細 胞，此外，還含有皿小板；用滴管擦到云霧層，吸取單個核細胞，置入另一離心管中，加入5 倍以上體積的RPMI1640,1500rpmX 10分鐘，洗滌細胞兩次；末次離心后，棄上清，加入含有 10%小牛血清的RPMI1640,重懸細胞；取一滴細胞懸液與一滴0. 2%臺盼蘭染液混合，于血 球計數板上，計細胞總數和活率。然后獲得的PBMC用試劑盒RossetS印（購買自Stem cell technology公司）進一步富集⑶4和⑶8陽性T細胞，所得細胞在培養基中和抗⑶3/⑶28 抗體包被的免疫磁珠 （Life technologies公司產品；磁珠與細胞之比為1 :3)于37°C、5% 〇)2培養箱中共同培養以使T細胞群體擴增；第二天，用上述病毒轉染所獲得的擴增后的T 細胞，進而得到穩定持續表達嵌合Fc受體的基因工程T細胞；第四天，洗滌細胞除去殘余病 毒粒子，繼續培養；第六天，在小型生物反應器中繼續培養；第十天左右，除去免疫磁珠，離 心收集細胞，洗滌和濃縮后，將所得細胞用可注射的冷凍培養基凍存于液氮。最終得到的兩 種工程T細胞根據嵌合受體的來源分別命名為⑶64-CART和⑶16A-CART。
[0037] 實施例3.基因工程T細胞對IgG Fc親和力檢測實驗-流式細胞法
[0038] 實驗步驟：上述兩種基因工程T細胞分別用磷酸鹽緩沖液（以下簡稱PBS: 135mM NaCl，2. 7mM KC1，1. 5mM KH2P04,8mM Κ2ΗΡ04;ρΗ 7. 2)洗滌后將細胞密度均調整為 2X 10 5/ ml ;上述...