一種結核桿菌融合蛋白及其在誘導外周血單個核細胞產生細胞因子的應用
【技術領域】
[0001 ]本發明屬于分子生物學技術中的蛋白領域，具體涉及一種結核桿菌融合蛋白及其在誘導外周血單個核細胞產生細胞因子的應用。
【背景技術】
[0002I結核病(tuberculosis ,TB)是一種由結核分枝桿菌引起的慢性傳染病，可侵及許多臟器，以肺部結核感染最為常見。結核病的傳染主要是發生在病人未被發現并進行治療之前，I名結核病患者平均可傳染15人。因為在未發現患病前，新發病人沒有采取任何預防手段，在與家庭成員、同事、同學等密切接觸的過程中，接觸者就容易被結核菌感染。全世界約有1/3的人口感染結核桿菌，每年新發結核病人約900萬，每年約有300萬人死于結核病，結核病已成為全世界成人因傳染病而死亡的主要疾病之一。根據世衛組織2014年10月22日出版的《2014年全球結核病報告》顯示，2013年有900萬人染上結核病，150萬人死亡，約95%的結核病死亡發生在低收入和中等收入國家。中國是全球22個結核病高負擔國家之一，活動性肺結核病人數居世界第二位。
[0003]作為一種典型的胞內感染菌，結核分枝桿菌感染機體，其免疫機制主要是以T細胞為主的細胞免疫。結核分枝桿菌通過呼吸道進入肺部，定植于肺泡巨噬細胞，逃逸宿主免疫防御機制；同時，原肺泡中未活化的樹突狀細胞(Dendritic cells, DC)抗菌活性弱，但可將結核分枝桿菌吞噬并迀移到其他組織，通過MHC將抗原提呈于T淋巴細胞導致其活化，活化的T淋巴細胞可產生多種細胞因子(INF-γ、IL-2與TNF-α等)，這些細胞因子可激活其他免疫細胞，并共同作用于病灶中的結核分枝桿菌。根據這一免疫機制，通過對已感染結核分枝桿菌的患者及健康人血液中的細胞因子進行分析對比，發現感染結核分枝桿菌的患者其血液中INF- γ、IL-2、TNF-a的濃度明顯升高。
[0004]對于已經感染了結核分支桿菌的患者，當已經免疫過的特異性淋巴細胞在再次接觸結核桿菌時，仍然會分泌相應的細胞因子。為研究結核分枝桿菌的致病機制及免疫機制，研究人員使用體外誘導外周血單個核細胞(PBMC)產生結核相關細胞因子的方式。外周血是人類免疫系統研究的主要對象，其中的PBMC包括淋巴細胞(T淋巴細胞、B淋巴細胞和NK細胞)、單核細胞和樹突狀細胞。將已經感染了結核分枝桿菌的患者的外周血采出，提取其中的PBMC，并采用結核相關抗原對其進行刺激，PMBC即可對抗原發生免疫反應，產生相應的細胞因子。由于直接使用結核分枝桿菌進行實驗具有相當的危險性，不利于進行大量研究，因此研究人員采用提取的結核分枝桿菌抗原蛋白進行研究實驗。結核菌素純蛋白衍生物(PPD)是從結核分枝桿菌培養濾液中獲得的活性物質，其主要成分是蛋白質。PH)可以刺激T細胞產生IFN-γ、IL-2等細胞因子，但對于已經經過卡介苗(BCG)免疫個體的樣本，PH)同樣能夠刺激其提取出來的PBMC產生結核相關細胞因子，因此PPD的特異性較低，還需尋找特異性更好的刺激物。

【發明內容】

[0005]為了解決上述問題，尋找特異性更好的刺激物，本發明的目的在于提供一種結核桿菌融合蛋白及其在誘導外周血單個核細胞產生細胞因子的應用。
[0006]本發明所采取的技術方案是:
一種融合蛋白，包含PPE41、ESAT-6和PE25三個蛋白，蛋白之間通過連接肽連接。
[0007]優選的，連接肽氨基酸序列為GGGGSGGGSGGSGS(SEQ ID N0:3)o
[0008]優選的，PPE41、ESAT_6和PE25蛋白為全序列蛋白或表達抗原活性的部分功能區域多肽。
[0009]優選的，該融合蛋白為PPE41-連接肽-ESAT-6-連接肽-PE25、PPE41-連接肽-PE25-連接肽-ESAT-6、ESAT6-連接肽-PPE41-連接肽-PE25或ESAT6-連接肽-PE25 -連接肽-PPE41、PE25-連接肽-PPE41-連接肽-ESAT-6、PE25-連接肽-ESAT-6-連接肽-PPE41。
[0010]優選的，該融合蛋白為PPE41-連接肽-ESAT-6-連接肽-PE25。
[0011]優選的，融合蛋白PPE41-連接肽-ESAT-6-連接肽-PE25的氨基酸序列如SEQ IDNO: I所示。
[0012]優選的，編碼融合蛋白PPE41-連接肽-ESAT-6-連接肽-PE25的核酸序列如SEQ IDNO:2所示。
[0013]上述任一項所述的融合蛋白能夠誘導外周血單個核細胞產生結核相關細胞因子的融合蛋白。
[0014]上述任一項所述的融合蛋白作為結核病檢測抗原的應用。
[0015]上述任一項所述的融合蛋白在結核病預防治療中作為刺激物的應用。
[0016]本發明的有益效果是:
I)本發明提供了一種可以刺激PBMC產生結核相關細胞因子的融合蛋白，與現有的刺激物相比，其作用更高效、敏感性更強、特異性更高、刺激效果好。在本發明融合蛋白的作用下，PBMC可高效產生結核桿菌抗原特異性的IFN-γ、IL-2、TNF-a等結核相關因子，并且這一刺激誘導反應不受BCG(卡介苗)的干擾。
[0017]2)本發明選用的連接肽鏈為經過設計、篩選的可以顯著提高融合蛋白活性的短肽。目前蛋白領域研究中常用的連接肽主要有(Gly4Ser)3，而本發明所采用的連接肽氨基酸序列為GGGGSGGGSGGSGS，使得PPE41-ESAT-6-PE25融合蛋白中各自蛋白的空間構象及活性得到更好的實現，與混合肽、或其他融合蛋白相比，本發明融合蛋白的特異性及誘導效果具有明顯的進步。本發明提供的融合蛋白對結核病致病及免疫預防機制的研究有重要意義，從而對結核病的控制具有積極的意義。
【附圖說明】
[0018]圖1為ELISA檢測各組I3BMC在融合蛋白PPE41-ESAT-6-PE25作用下分泌細胞因子IL-2的情況；
圖2為ELISP0T檢測不同處理組中PBMC分泌IFN-γ的水平；
圖3為ELISP0T檢測不同處理組中PBMC分泌TNF-α的水平；
圖4為ELISP0T檢測各組PBMC分泌IFN-γ的水平;其中本發明融合蛋白的連接肽為GGGGSGGGSGGSGS; (Gly4Ser)3-融合蛋白組的連接肽(Gly4Ser)3，其他序列均與本發明融合蛋白相同；
圖5為ELISPOT檢測各組PBMC分泌IFN- γ的水平;實驗組孔中含有本發明融合蛋白，陽性對照組中含有植物凝集素PHA;
圖6為ELISPOT檢測不同處理組中PBMC分泌IFN-γ的水平。
【具體實施方式】
[0019]一種融合蛋白，包含PPE41、ESAT_6和ΡΕ25三個蛋白，蛋白之間通過連接肽連接。
[0020]優選的，連接肽氨基酸序列為GGGGSGGGSGGSGS(SEQ ID N0:3)o[0021 ]更優選的，連接肽的堿基序列如SEQ ID N0:4所示。
[0022]優選的，PPE4UESAT-6和PE25蛋白為全序列蛋白或表達抗原活性的部分功能區域多肽。
[0023]優選的，該融合蛋白為PPE41-連接肽-ESAT-6-連接肽-PE25、PPE41-連接肽-PE25-連接肽-ESAT-6、ESAT6-連接肽-PPE41-連接肽-PE25或ESAT6-連接肽-PE25 -連接肽-PPE41、PE25-連接肽-PPE41-連接肽-ESAT-6、PE25-連接肽-ESAT-6-連接肽-PPE41。
[0024]優選的，該融合蛋白為PPE41-連接肽-ESAT-6-連接肽-PE25。
[0025]優選的，融合蛋白PPE41-連接肽-ESAT-6-連接肽-PE25的氨基酸序列如SEQ IDNO: I所示。
[0026]優選的，編碼融合蛋白PPE41-連接肽-ESAT-6-連接肽-PE25的核酸序列如SEQ IDNO:2所示。
[0027]上述任一項所述的融合蛋白能夠誘導外周血單個核細胞產生結核相關細胞因子的融合蛋白。
[0028]上述任一項所述的融合蛋白作為結核病檢測抗原的應用。
[0029]上述任一項所述的融合蛋白在結核病預防治療中作為刺激物的應用。
[0030]上述任一項所述的融合蛋白作為刺激物，應用于結核病致病及免疫預防機制的研究，以及進一步的對結核病的控制中。
[0031]以下結合具體實施例對本發明作進一步的說明，但并不局限于此。
[0032]實施例1:PPE41-ESAT-6_PE25融合蛋白目的基因合成及原核表達載體的構建編碼PPE41、ESAT-6和PE25蛋白的基因分別為ppe41基因ID: 885945，esat-6基因ID:
862098，pe25基因ID: 885703。利用其全序列或者表達抗原活性的部分功能區域序列，設計引物。
[0033]
I)分別用PPE41、ESAT-6和PE25的上下游引物，用PCR分別擴增PPE41、ESAT_6和PE25的目的片段，使用Taq DNA聚合酶進行PCR擴增并回收上述片段。
[0034]2)采用人工合成方式合成兩種帶有連接肽核苷酸序列的核苷酸鏈，其中一種核苷酸鏈(下文簡稱連接肽鏈I)兩端分別包含PPE41和ESAT-6部分序列，中間為連接肽的堿基序列(SEQ ID N0:4)，另一種核苷酸鏈(下文簡稱連接肽鏈2)兩端分別包含ESA