一種赭曲霉毒素定向免疫磁珠及其制備方法和用圖
【專利摘要】本發明涉及一種赭曲霉毒素定向免疫磁珠及其制備方法和用途，該定向免疫磁珠利用蛋白G或者蛋白A偶聯到磁珠上，然后用抗赭曲霉毒素的抗體與磁珠上的蛋白G或者蛋白A偶聯，然后再利用交聯劑對結合赭曲霉毒素抗體的蛋白G/蛋白A磁珠進行交聯，該免疫制備方法充分利用了蛋白G與蛋白A與抗體親和力高以及與抗體的Fc片段特異性結合的特點。主要用于對于糧食、食品、飼料、牛奶、血樣以及其他多種樣本中的赭曲霉毒素的結合和純化，可以用于赭曲霉毒素檢測前樣品前期處理，樣品中赭曲霉毒素檢測以及赭曲霉毒素純化。
【專利說明】
_種赭曲霉毒素定向免疫磁珠及其制備方法和用途
技術領域
[0001]本發明涉及一種赭曲霉毒素的定向免疫磁珠及其制備方法和用途，屬于赭曲霉毒素的純化與檢測領域。
【背景技術】
[0002]赭曲霉毒素A(Ochratoxin A)簡稱0ΤΑ，是曲霉屬和青霉屬的一些菌種的有毒代謝產物，屬真菌毒素之一。自然界中產生赭曲霉毒素A的真菌種類繁多，但以純綠青霉(Penicillium verrucosum)、赫曲霉(Aspergillus ochraceus)和碳黑曲霉(A.carbonarius)三種菌為主，其中赭曲霉是稻谷感染的常見菌。赭曲霉毒素能引起腎臟的嚴重病變、肝臟的急性功能障礙、脂肪變性、透明變性及局部性壞死，而且還有致畸性、致突變性、免疫抑制和致癌性。1993年國際癌癥研究中心已將赭曲霉毒素A列為可能的人類致癌物。赭曲霉毒素廣泛的存在于谷類、大豆、綠豆、花生、香料、干果、動物腎臟、血液、咖啡、牛奶、白酒、啤酒、葡萄酒、巧克力、奶制品和調味品中。赭曲霉毒素A的測定已經引起廣泛的關注。
[0003]目前赭曲霉毒素的檢測方法有薄層層析法、高效液相色譜法(HPLC)、酶聯免疫吸附法(ELISA)等。
[0004]其中薄層層析法是最早使用也是最廣泛使用的檢測赭曲霉毒素的方法，其優點是適合于沒有經過專門培訓的人員操作，且成本低，無需價格昂貴的儀器，。但是薄層層析法對樣品處理繁瑣，實驗過程復雜，所需檢測周期較長，容易受到雜質的干擾。測定時用目測半定量，主觀影響較大，靈敏度不高等，已遠遠不能滿足現代檢測要求。
[0005]酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測方法檢測特異、快速、靈敏度高、并且成本較低。成本低的特點，適用于基層機構大量樣品的篩選和普查，可以大大節省時間和費用，因此越來越受到基層檢驗單位的歡迎。ELISA方法的主要問題是容易造成假陽性。因此主要用于基層的篩查檢測。
[0006]高效液相色譜法(HPLC)具有準確度高、靈敏性強、可微量測定等優點，是目前常用于食品中毒素檢測的方法。但因其對樣品中毒素純度的要求較高，導致檢測成本高、周期長，無法滿足大批量樣品快速篩選的需要，所以使用受到限制。今年來發展起來的免疫親和柱-高效液相色譜(IAC-HPLC))將免疫親和純化技術與高效液相色譜相結合。使HPLC的使用更加廣泛。免疫親和柱作為一種新的凈化技術，在真菌毒素的分析檢測中應用越來越廣泛。它是將特異性抗體結合到活化的固相載體上填充而成。當樣品提取液通過柱子時，其中的抗原與抗體結合，其他雜質則通過水溶液洗掉，再用有機溶劑將抗原即毒素洗脫下來，從而使樣品中的毒素得以凈化。
[0007]由于檢測原理的不同，高效液相色譜法對樣本的處理要求高。對于目前常用的樣本前處理方法主要是通常的做法都是先將待檢樣本通過粉碎，過濾等步驟后，利用免疫親和柱對樣本進行赭曲霉毒素的免疫親和凈化。然后將洗脫產物進行高效液相色譜檢測。由于待檢樣本比較復雜，盡管前期經過了過濾等步驟，但是在用免疫親和柱的時候還是會發生親和柱堵塞的現象。親和柱堵塞會降低毒素結合力，減緩反應溶液的通過率，進而影響親和柱的純化效率。此外，由于免疫親和柱自身的特點，會造成類似于塔板效應，位于親和柱頂部的凝膠與赭曲霉毒素結合更多，而越到親和柱底部，毒素結合越少。導致親和柱底部的凝膠往往不能有效的結合樣本中的赭曲霉毒素。
[0008]如果利用赭曲霉毒素的定向免疫磁珠對樣本中的赭曲霉毒素進行純化，對樣本的要求就會放寬，只需要將粉碎后的樣本在一定的溶液中與磁珠混合，磁珠上面的抗體就可以將樣本中的赭曲霉毒素吸附，磁珠利用磁性原理貼壁后，將其余的部分去除。然后再將結合在定向免疫磁珠上面的赭曲霉毒素洗脫下來。不但操作簡單，而且還可以對樣本中的赭曲霉毒素進行富集。可以檢測低含量的樣本。此外，由于完全在液相條件下進行赭曲霉毒素純化，每個磁珠對于毒素的結合能力都是相同的。
[0009]目前市場上常見的定向免疫磁珠都是將抗體直接偶聯到磁珠表面，但是由于抗體分子較大，偶聯不受控制，抗體可能以任何方向偶聯到磁珠上。某些抗體偶聯方向會導致在抗原分子結合時由于空間位阻的原因無法結合，更有些情況下，抗體的抗原結合區域偶聯到磁珠上導致這一抗原結合區域被封閉掉。由于赭曲霉毒素分子很小，攜帶的抗原表位只有1-2個，一個抗原結合區域的封閉就可能導致這一分子的抗體失去抗原結合能力。因而會影響到整個定向免疫磁珠的抗原結合效率。利用蛋白A或者蛋白G能夠特異性結合抗體恒定區(Fe區)的特點，通過蛋白A或者蛋白G將抗體固定在磁珠表面，抗體的抗原結合區域(Fab區)全部暴露在外，大大增加了定向免疫磁珠的抗原結合能力。

【發明內容】

[0010]本發明的目的在于提供一種赭曲霉毒素定向免疫磁珠及其制備方法和用途，為了達到上述目的，在本發明中，利用了蛋白G或者蛋白A的功能，蛋白G是一種G型鏈球菌細胞壁上的蛋白，能特異性的與多種動物抗體的Fe部位相結合。并且具有很高的親和力。蛋白A是葡萄球菌細胞壁上的一種蛋白，與蛋白G類似。蛋白A也具有抗體結合能力，也是通過抗體的Fe區域與抗體結合。微生物來源的蛋白G和蛋白A這一特性與其多年來進化獲得的宿主逃避和自我保護能力密切相關。我們克隆了野生蛋白G和蛋白A的基因序列，并且對其密碼子進行了優化、重組后，在大腸桿菌中表達出了與抗體有高親和力的基因重組蛋白G和蛋白A。將基因重組的蛋白G或蛋白A偶聯到磁珠上后，再將赭曲霉毒素抗體偶聯到蛋白G或蛋白A上，制備出了赭曲霉毒素一蛋白G/蛋白A—磁珠，再用交聯劑將載體進行交聯。就形成了高親和力的赭曲霉毒素定向免疫磁珠。該磁珠操作簡便，純化赭曲霉毒素效率高。樣本經過簡單的處理后就可以進行純化，得到純度很高的赭曲霉毒素。用于高效液相色譜檢測。
[0011]本發明利用了蛋白G與蛋白A與Ig抗體特異性結合的特點，IgG抗體由兩條重鏈和兩條輕鏈構成，抗體分為Fab區和Fe區，其中，Fab區是抗原結合的區域。蛋白G是鏈球菌細胞壁上的一種特殊的蛋白，與抗體的Fe區域有特異性的結合能力。蛋白G與抗體結合后，抗體的Fab區域游離在外，不影響抗體的抗原結合能力。經過我們基因優化重組后的蛋白G，I個分子的蛋白G可以結合3個分子的IgG抗體，具有很高的抗體親和力。與蛋白G類似，蛋白A是葡萄球菌細胞壁上的一種特殊的蛋白，與抗體的Fe區域有特異性的結合能力。蛋白A與抗體結合后，抗體的Fab區域游離在外，不影響抗體的抗原結合能力。經過我們基因優化重組后的蛋白A，I個分子的蛋白G可以結合6個分子的IgG抗體，具有很高的抗體未和力。以此蛋白G或者蛋白A為基礎制備的定向免疫磁珠具有特異性好，赫曲霉毒素結合量大，純化效率高的特點。
[0012]赭曲霉毒素定向免疫磁珠及其制備方法說明如下:
1.將磁珠用含0.01% SDS的50mM PH6.0 MES緩沖液懸起。
[0013]2.在磁珠中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)至終濃度5-20mg/ml，再加入硫化-N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) (Sulfo-NHS)至終濃度10_25mg/ml。
[0014]3.室溫反應15-60分鐘。
[0015]4.反應后的磁珠用50mM MES緩沖液PH6.0洗滌3次，然后重懸在50mM PH6.0的MES緩沖液中。
[0016]5.將蛋白G或者蛋白A加入重懸后的磁珠中，使蛋白量與磁珠表面配基的摩爾比達到 5-10:1。
[0017]6.室溫反應2-4小時。
[0018]7.反應后的磁珠用50mM MES緩沖液PH6.0洗滌3次。
[0019]8.反應后的磁珠用IM的乙醇胺室溫封閉。
[0020]9.磁珠用20mM PBS緩沖液PH7.4洗滌3次，然后重懸在20mM PBS PH7.4緩沖液中。
[0021]10.在磁珠中加入抗赭曲霉毒素抗體，使抗體量與磁珠中蛋白G量摩爾比達到3-5:10
[0022]11.將加入抗體的磁珠在37°C反應10-40分鐘。
[0023]12.磁珠用0.1 M硼酸緩沖液PH9.0洗滌3次，然后磁珠重懸在IM PH9.0的硼酸緩沖液中。
[0024]13.將赭曲霉毒素抗體一蛋白G/蛋白A—磁珠載體加入終濃度0.2M的三乙醇胺和20mM的二甲基庚二酸酯(DMP)，PH8.3，室溫反應1_2小時。
[0025]14.用50mM PH9.0的乙醇胺終止反應，用含有0.01%硫柳汞的1mMPBS PH7.4洗滌赭曲霉毒素抗體一蛋白G/蛋白A —磁珠3次。
[0026]15.將磁珠重懸在含有0.01%硫柳汞的1mMPBS PH7.4中。放于4°C保存。
[0027]與現有技術相比，本發明具有如下優點:
1.充分的利用了蛋白G與蛋白A與IgG抗體特異性結合的特性，使抗體通過蛋白G/蛋白A偶聯到載體上。并且IgG抗體的Fab片段充分的暴露在外，大幅度提高了赭曲霉毒素的捕捉能力，赫曲霉毒素的純化效率也得到有效提尚。
[0028]2.本發明使用了基因改造后的蛋白G和蛋白A，通過對密碼子的優化和IgG結合域基因的優化。使蛋白G和蛋白A的抗體結合能力大幅度提尚，進而提尚了赫曲霉毒素的純化效率。
[0029]3.使用本發明純化赭曲霉毒素操作簡便，幾步就可以得到純度較高的赭曲霉毒素。更方便操作者使用。
[0030]4.使用本發明得到的赭曲霉毒素純度很高，后續不用再做別的純化處理就可以直接用于高效液相色譜檢測或者熒光檢測。節省了操作者的時間和費用。
【附圖說明】
[0031]圖1、蛋白G偶聯的赫曲霉毒素定向免疫磁珠結構不意圖。
[0032]圖2、瓜拉納果粉中OTA含量檢測HPLC圖譜。
[0033]圖3、歐芹樣本中OTA含量檢測HPLC圖譜。
[0034]圖中A:磁珠，B:蛋白G，C:赭曲霉毒素抗體。
實施例
[0035]實施例1:利用基因重組蛋白G制備赫曲霉毒素定向免疫磁珠本發明制備赭曲霉毒素定向免疫磁珠的一個優選的實施方案如下:
1.磁珠活化
取5mg羧基修飾的納米磁珠，用含0.01% SDS的50mM PH6.0 MES緩沖液洗滌3次，然后將磁珠用5ml的50mM PH6.0 MES緩沖液懸起。
[0036]2.在磁珠中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC) lOOmg，再加入硫化-N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) (Sulfo-NHS) lOOmg，室溫反應15分鐘。
[0037]3.反應后的磁珠用50mM MES緩沖液PH6.0洗滌3次，然后重懸在5ml 50mMPH6.0的MES緩沖液中。
[0038]4.在磁珠中加入20mg蛋白G，室溫反應4小時。
[0039]5.反應后的磁珠用50mM MES緩沖液PH6.0洗滌3次。
[0040]6.反應后的磁珠用20ml IM的乙醇胺室溫封閉2小時。
[0041]7.磁珠用50ml 20mM PBS緩沖液PH7.4洗滌3次，然后重懸在5ml 20mM PBSPH7.4緩沖液中。
[0042]8.在磁珠中加入200mg抗赭曲霉毒素抗體，將加入抗體的磁珠在37°C反應30分鐘.9.磁珠用20mM PBS緩沖液PH7.4洗滌3次，然后重懸在20mM PBS PH7.4緩沖液中。
[0043]10.磁珠用0.1 M硼酸緩沖液PH9.0洗滌3次，然后磁珠重懸在5ml 0.1 M硼PH9.0的硼酸緩沖液中。
[0044]11.稱取26mg 二甲基庚二酸酯(DMP)加入含赭曲霉毒素抗體一蛋白G—磁珠的PBS緩沖液中，然后加入10ul 2M的三乙醇胺至調PH8.3.室溫反應I小時。
[0045]12.用25ml 50mM PH9.0的乙醇胺終止反應。
[0046]13.用含有0.01%硫柳汞的1mMPBS PH7.4洗滌赭曲霉毒素抗體一蛋白G —磁珠3次。然后將磁珠重懸在5ml的該緩沖液中，放于4°C保存。
[0047]實施例2:利用基因重組蛋白A制備赫曲霉毒素定向免疫磁珠本發明制備赭曲霉毒素定向免疫磁珠的一個優選的實施方案如下:
1.磁珠活化。
[0048]2.取5mg羧基修飾的納米磁珠，用含0.01% SDS的50mM PH6.0 MES緩沖液洗滌3次，然后將磁珠用5ml的50mM PH6.0 MES緩沖液懸起。
[0049]3.在磁珠中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC) lOOmg，再加入硫化-N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) (Sulfo-NHS) 100mg，室溫反應20分鐘。
[0050]4.反應后的磁珠用50mM MES緩沖液PH6.0洗滌3次，然后重懸在5ml 50mM PH6.0的MES緩沖液中。
[0051]5.在磁珠中加入30mg蛋白A，室溫反應4小時。
[0052]6.反應后的磁珠用50mM MES緩沖液PH6.0洗滌3次。
[0053]7.反應后的磁珠用20ml IM的乙醇胺室溫封閉2小時。
[0054]8.磁珠用50ml 20mM PBS緩沖液PH7.4洗滌3次，然后重懸在5ml 20mM PBSPH7.4緩沖液中。
[0055]9.在磁珠中加入300mg抗赭曲霉毒素抗體，將加入抗體的磁珠在37°C反應30分鐘。
[0056]10.磁珠用20mM PBS緩沖液PH7.4洗滌3次，然后重懸在20mM PBS PH7.4緩沖液中。
[0057]11.磁珠用0.1 M硼酸緩沖液PH9.0洗滌3次，然后磁珠重懸在5ml 0.1 M硼PH9.0的硼酸緩沖液中。
[0058]12.稱取26mg 二甲基庚二酸酯(DMP)加入含赭曲霉毒素抗體一蛋白A—磁珠的PBS緩沖液中，然后加入10ul 2M的三乙醇胺至調PH8.3.室溫反應I小時。
[0059]13.用25ml 50mM PH9.0的乙醇胺終止反應。
[0060]14.用含有0.01%硫柳汞的1mMPBS PH7.4洗滌赭曲霉毒素抗體一蛋白A —磁珠3次，然后將磁珠重懸在5ml的該緩沖液中，放于4°C保存。
[0061]實施例3:利用蛋白G偶聯的赫曲霉毒素定向免疫磁珠純化和檢測瓜拉納果粉中的赭曲霉毒素
1.將瓜拉納果粉樣品用鋼磨粉碎，過2mm分樣篩。
[0062]2.取1g過篩粉碎的樣品加入50mL 20mM PH7.4 PBS緩沖液溶液混勻。
[0063]3.加入lmg/ml蛋白G偶聯的黃曲霉素定向免疫磁珠10ml，混勾后室溫放置30分鐘。
[0064]4.將反應后的磁珠混合液放到磁力架上2分鐘，待磁珠貼壁。用吸管去掉其余的緩沖液。
[0065]5.在磁珠中加入50ml 20mM PH7.4 PBS洗滌磁珠，然后將磁珠放入磁力架中待磁珠貼壁后，用吸管去除緩沖液。
[0066]6.重復洗滌步驟3次。
[0067]7.在磁珠中加入5ml 0.1M PH3.0的甘氨酸緩沖液，混勻。使磁珠上的赭曲霉毒素洗脫下來。
[0068]8.將磁珠放入磁力架中使磁珠貼壁，將洗脫的緩沖液取出到另一試管中，馬上加Λ 500ul PH9.0 IM Tris緩沖液，充分混合。
[0069]9.洗脫后的緩沖液用高效液相色譜(HPLC)檢測其含量。
[0070]10.高效液相色譜檢測結果如圖2所示，根據HPLC檢測圖譜可以得出該瓜拉納果粉樣本中赭曲霉毒素含量為4.73ppbo
[0071]實施例4:利用蛋白A偶聯的赫曲霉毒素定向免疫磁珠純化和檢測歐序中的赫曲霉毒素
將歐芹樣品用鋼磨粉碎，過2mm分樣篩；
1.取1g過篩粉碎的樣品加入50mL 10mM PH8.0 Tris緩沖液溶液混勻；2.加入lmg/ml蛋白A偶聯的黃曲霉素定向免疫磁珠10ml，混勾后室溫放置30分鐘。
[0072]3.將反應后的磁珠混合液放到磁力架上2分鐘，待磁珠貼壁。用吸管去掉其余的緩沖液。
[0073]4.在磁珠中加入50ml 10mM PH8.0 Tris緩沖液洗滌磁珠，然后將磁珠放入磁力架中待磁珠貼壁后，用吸管去除緩沖液。
[0074]5.重復洗滌步驟3次。
[0075]6.在磁珠中加入5ml 0.1M PH5.0的檸檬酸緩沖液，混勻。使磁珠上的赭曲霉毒素洗脫下來。
[0076]7.將磁珠放入磁力架中使磁珠貼壁，將洗脫的緩沖液取出到另一試管中。洗脫后的緩沖液用高效液相色譜(HPLC)檢測其含量。
[0077]8.高效液相色譜檢測結果如圖3所示，根據HPLC檢測圖譜可以得出該歐芹樣本中赭曲霉毒素含量為L 72 ppbo
【主權項】
1.一種赭曲霉毒素的定向免疫磁珠，其特征在于包含有磁珠載體、蛋白G或者蛋白A和赭曲霉毒素抗體。2.根據權利要求1中所述的定向免疫磁珠，其特征在于蛋白G或者蛋白A通過共價鍵偶聯在載體上，然后赭曲霉毒素抗體與蛋白G結合，然后用交聯劑交聯，形成磁珠-蛋白G/蛋白A-赭曲霉毒素抗體形式的偶聯載體。3.根據權利要求1中所述的赭曲霉毒素定向免疫磁珠，其特征在于所用的蛋白G是天然的蛋白G或者基因重組表達的蛋白G。4.根據權利要求1中所述的赭曲霉毒素定向免疫磁珠，其特征在于所用的蛋白A是天然的蛋白A或者基因重組表達的蛋白A。5.根據權利要求3中所述的蛋白G，包括按照序列I表達的蛋白G，以及經過序列優化后表達的蛋白G。6.根據權利要求4中所述的蛋白A，包括按照序列2表達的蛋白A，以及經過序列優化后表達的蛋白A。7.根據權利要求1中所述的載體，包括納米磁珠和直徑超過Iym的普通磁珠。8.根據權利要求2中所述的抗赭曲霉毒素抗體，其特征在于包括單克隆IgG抗體和多克隆抗體。9.一種純化赭曲霉毒素的定向免疫磁珠制備方法，其特征在于: 1)將磁珠用含0.01% SDS的50mM PH6.0 MES緩沖液懸起； 2)在磁珠中加入EDC至終濃度5-20mg/ml，再加入硫化-N-羥基琥珀酰亞胺至終濃度10_25mg/ml ； 3)室溫反應15-60分鐘； 4)反應后的磁珠用50mMMES緩沖液PH6.0洗滌3次，然后重懸在50mM PH6.0的MES緩沖液中； 5)將蛋白G或者蛋白A加入重懸后的磁珠中，使蛋白量與磁珠表面配基的摩爾比達到5-10:1 ； 6)室溫反應2-4小時； 7)反應后的磁珠用50mMMES緩沖液PH6.0洗滌3次； 8)反應后的磁珠用IM的乙醇胺室溫封閉； 9)磁珠用20mMPBS緩沖液PH7.4洗滌3次，然后重懸在20mM PBS PH7.4緩沖液中； 10)在磁珠中加入抗赭曲霉毒素抗體，使抗體量與磁珠中蛋白G量摩爾比達到3-5:1; 11)將加入抗體的磁珠在37°C反應10-40分鐘； 12)磁珠用0.1 M硼酸緩沖液PH9.0洗滌3次，然后磁珠重懸在IM PH9.0的硼酸緩沖液中； 13)將赭曲霉毒素抗體一蛋白G/蛋白A—磁珠載體加入終濃度0.2M的三乙醇胺和20mM的二甲基庚二酸酯(DMP)，PH8.3.室溫反應1_2小時； 14)用50mMPH9.0的乙醇胺終止反應，用含有0.01%硫柳汞的1mMPBS PH7.4洗滌赭曲霉毒素抗體一蛋白G/蛋白A —磁珠3次； 15)將磁珠重懸在含有0.01%硫柳汞的1mMPBS PH7.4中，放于4°C保存。10.一種赭曲霉毒素的定向免疫磁珠，其用途在于包括蔬菜、水果及果汁制品、糧食、酒類、飼料、牛奶及乳制品、水產、血液、尿液、水中赭曲霉毒素的分離純化，純化后的赭曲霉毒素可以用于高效液相色譜及其它方法檢測。
【文檔編號】G01N33/68GK105842454SQ201510016963
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2015年1月14日
【發明人】張彥明, 柳家鵬
【申請人】北京康諾生物科技有限公司