一種基于近紅外上轉換發光標記和磁分離的赭曲霉毒素a檢測方法
【專利摘要】一種基于近紅外上轉換發光標記和磁分離的赭曲霉毒素A檢測方法，用于小麥及其制品等中赭曲霉毒素A(OTA)含量的檢測。通過將NaYF4:Yb0.2,Tm0.02近紅外上轉換發光材料與赭曲霉毒素A核酸適配體連接形成信號探針，再通過堿基互補配對原則與適配體互補寡核苷酸單鏈修飾的Fe3O4磁性納米材料形成納米復合物，此時上轉換發光信號達到最大；當檢測體系中存在OTA時，OTA與OTA適配體特異性結合，從而使雙鏈解鏈，通過監控近紅外光區804nm處的上轉換發光信號強度，能夠定量檢測OTA，線性范圍為0.01?100ng/mL，檢出限為0.005ng/mL。本發明用于OTA檢測具有靈敏度高、快速簡便的優點，并應用于啤酒樣品的檢測，結果準確可靠。
【專利說明】
一種基于近紅外上轉換發光標記和磁分離的赭曲霉毒素 A檢 測方法
技術領域
[0001] -種基于近紅外上轉換發光標記和磁分離的赭曲霉毒素A檢測方法，涉及納米材 料和分析化學技術領域，用于對食品中赭曲霉毒素A進行檢測。
【背景技術】
[0002] 赫曲霉毒素A(0chratoxins A，0TA)主要由純綠青霉（Penicillium Verrucosum)、 赫曲霉(Aspergillus achraceus)和碳黑曲霉(A.carbonarius)三種真菌產生，不少其他產 毒菌株也不斷地被報道。0TA主要污染植物性產品，比如谷物、豆類、花生、葡萄干、咖啡、啤 酒和紅酒，不少報道顯示，部分動物性產品中也存在0TA，這是因為食物鏈蓄積作用，動物攝 食部分受0TA污染的植物性產品導致0TA在動物體內富集。0TA具有較強的肝臟、腎臟和神經 毒性和致畸、致癌、致突變作用，對人類身體健康和食品安全造成很大的危害。因此，建立準 確、靈敏、快速的0TA檢測技術對于食品安全具有重大意義。
[0003] 目前檢測0TA的主要方法有薄層色譜法(TLC)、高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜 質聯用法(LC-MS/MS)、酶聯免疫吸附法(ELISA)和膠體金免疫層析分析法(GICA)等。ELISA 主要基于抗原抗體親和反應，常用于OTA現場快速檢測和大批量樣品篩選。但抗體易受外界 條件影響，尤其是溫度，而且抗體的制備需要經過動物或者細胞實驗，繁瑣費時，成本較高； 而基于儀器的分析方法則需要大量的人力和財力投入，常常只用于實驗室分析。所以開發 一種快速方便，穩定性好、靈敏度高、特異性強、成本低廉的新型檢測方法是很有必要的。
[0004] 核酸適配體(Aptamer)通過指數富集配體系統進化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)技術從體外篩選得到的，能與相應配體專一 性緊密結合的一類單鏈寡核苷酸序列。這種寡核苷酸序列形成的高級結構能夠識別與之對 應的任何類型的蛋白和低分子等靶物質，并與靶物質具有高度親和力。與抗體相比，適配體 的靶分子范圍廣，體外篩選，易人工合成和修飾，分子較小，穩定性好，對溫度不敏感，容易 保存，而且適配體作為識別分子已經在臨床診斷、臨床治療、藥物運輸、蛋白質組研究和食 品安全中得到廣泛應用。
[0005] 近年來，新型納米材料在分析檢測中的快速發展受到越來越多的科研工作者的青 睞，并涌現出了很多具有優秀特性的納米材料。其中上轉換發光納米材料引起獨特的光學 特性被人們所熟知。
[0006] 上轉換發光納米材料(Upconversion Nanoparticles，UCNPs)的發光機制是基于 雙光子或者多光子過程，是一種將紅外光轉變成可見光的有效途徑。相對于傳統的有機焚 光染料和其他熒光納米材料，上轉換發光納米材料作為完全惰性的無機發光材料具有很大 的優勢，光化學性質穩定，單色性強，具有較長的發光壽命，可以選擇不同的基質材料和摻 雜離子來調節上轉換發光，真正實現單激發多發射，有利于生物體系中多組分標記同時檢 測。鑒于上述優點，上轉換發光納米材料已成為一種優秀的生物標記材料被廣泛的用于生 物監測分析領域。
[0007] 本發明首先合成了在804nm處有強發射峰的近紅外上轉換發光納米材料，其次用 一步合成法制備了氨基化Fe3〇4磁性納米材料，并分別在近紅外上轉換發光納米材料上修飾 0TA適配體和在Fe304磁性納米材料上修飾互補寡核苷酸鏈，分別組成信號探針和磁性探 針，基于兩者堿基互補配對原則，使得兩種探針形成近紅外上轉換發光納米材料-磁性納米 材料納米復合物，此時的發光強度達到最大。當加入不同量的0TA時，0TA與適配體進行特異 性結合，使得雙鏈結構解離，部分近紅外上轉換發光納米材料從磁性納米材料表面脫落，近 紅外上轉換發光強度減弱，以980nm激光作為激發光源記錄近紅外上轉換發光檢測信號，通 過對不同濃度赭曲霉毒素A標準品的檢測，建立標準曲線，達到對含赭曲霉毒素A樣品進行 定量檢測的目的。該發明可以用于啤酒、玉米、谷物、飼料及其制品等樣品中赭曲霉毒素A含 量的檢測。

【發明內容】
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[0008] 一種基于近紅外上轉換發光標記和磁分離的赭曲霉毒素A檢測方法：將NaYF4: Yb0.2，TmQ.()2近紅外上轉換發光納米材料和Fe 3〇4磁性納米材料分別通過EDC/NHS反應和戊二 醛交聯法偶聯親和素，利用親和素和生物素之間的高親和力，分別偶聯生物素化0TA適配體 和互補鏈，基于雜交反應使兩種材料形成納米復合物，此時納米復合物具有最大的發光信 號。當這個復合物體系中加入目標物0TA后，由于0TA適配體與0TA的特異性識別結合，0TA適 配體優先結合靶標0TA，導致0TA適配體與互補鏈的解離，造成近紅外上轉換發光納米材料 和磁性納米材料的分離，通過外加磁場作用，收集得到的納米復合物中近紅外上轉換發光 納米材料減少，此時的發光信號就會相應的減弱，根據加入靶標濃度與發光信號強度變化 量之間的關系，可以實現0TA的定量檢測;步驟為：
[0009] (1)通過高溫熱解法技術，制備NaYF4: Ybo.2，Tmo.02近紅外上轉換發光納米材料，并 對其做表面修飾。稱取YC13 ? 6H20，YbCl3 ? 6H20，TmCl3 ? 6H2〇(Ln:78mol%Y3+，20mol%Yb3+， 2mo 1 % Tm3+;總共lmmo 1)加入到1 OOmL三口燒瓶中，加入6mL油酸以及15mL 1 -十八烯。在攪拌 下，逐漸升溫至160°C，待形成均一的溶液后，自然冷卻至室溫。準確稱取2.5mmol NaOH和 4mmol NH4F溶于10mL甲醇溶液中。將上述溶液緩慢加入到三口燒瓶中，磁力攪拌30min。再 將溶液緩慢加熱去除甲醇，氬氣保護下加熱到300°C，并且持續lh。反應結束后，自然冷卻至 室溫，用水和乙醇離心所得材料清洗三次，儲存備用。
[0010] (2)利用配體交換法對上轉換發光納米顆粒進行表面羧基化修飾。稱取30mg油酸 修飾NaYF4: Ybo.2，Tmo.〇2UCNPs分散于4mL氯仿溶液中。于圓底燒瓶中，加入200mg聚丙稀酸(相 對分子量2000)和8mL超純水，攪拌均勻充分溶解。將UCNPs氯仿溶液緩慢加入到圓底燒瓶 中，磁力攪拌24h后，離心收集材料，用超純水清洗數次，得到聚丙烯酸修飾NaYF4: Ybo. 2， Tmo. Q2近紅外上轉換發光納米材料，儲存備用。
[0011 ] (3)采用一步溶劑法制備氨基化Fe3〇4磁性納米材料。稱取2.0g無水醋酸鈉，1.0g FeCh ? 6H2O和6.5g 1，6_己二胺加入30mL乙二醇中，磁力攪拌下加熱至50°C，待形成透亮均 一的膠體溶液后，轉移到帶內襯的反應釜中，在198°C件下反應6h。待反應釜冷卻后，將釜內 液體轉移到燒杯中，磁鐵分離收集黑色固體，棄去上清，反復清洗幾次。所得黑色固體在60 °(：條件下過夜干燥備用。
[0012] (4)利用EDC/NHS法將羧基化上轉換發光納米材料與親和素(Avidin)偶聯。稱取 lOmg聚丙稀酸修飾的NaYF4: Ybo.2，Tm〇.()2近紅外上轉換發光納米材料分散于5mL lOmmol/L 1^3化115.6)緩沖液中，充分超聲分散，加入0.61^211^/1111^0(：溶液和0.21^211^/1^順3溶 液，37°C搖床中活化2h。離心收集材料，用磷酸緩沖液清洗三次。然后分散于磷酸緩沖液中， 加入lmL 0.5mg/mL親和素溶液，在37°C搖床中反應12h。離心收集材料和上清，測定親和素 反應前后的紫外吸收。
[0013] (5)利用戊二醛法將氨基化Fe3〇4磁性納米材料與親和素偶聯。準確稱取10mg氨基 化Fe3〇4磁性納米材料分散于5mL 10mmol/L磷酸緩沖液中，充分超聲分散，然后加入1.25mL 25 %戊二醛溶液，37 °C孵育2h，磁分離后，用磷酸清洗數次，磁分離收集后，分散于磷酸緩沖 液中，加入lmL 0.5mg/mL親和素溶液，37°C搖床中反應12h后磁分離收集。
[0014] (6)利用通過親和素(Avidin)與生物素(Biotin)之間的特異性結合將表面修飾親 和素的近紅外上轉換發光納米顆粒和親和素修飾的Fe3〇4磁性納米材料分別與生物素 (Bi〇t in)修飾的赭曲霉毒素A適配體DNA單鏈和互補鏈連接。具體方法為：將親和素修飾 NaYF4: Ybo.2，Tmo.〇2近紅外上轉換發光納米材料分散于磷酸緩沖液中，加入一定量的生物素 化0TA適配體，在37 °C搖床中孵育12h，離心收集材料和上清，用磷酸緩沖液清洗三次，將最 后得到的近紅外上轉換發光信號探針（apt-UCNPs)分散于BB緩沖液（10mM Tris，pH8.5， 120mM NaCl，5mM KC1 和20mM CaCl2)中。
[0015]將親和素修飾的Fe3〇4磁性納米材料分散于5mL磷酸緩沖液中，加入一定量的生物 素化0TA適配體互補鏈，在37°C搖床中孵育12h，磁分離收集材料，用磷酸緩沖液清洗數次， 將最后得到的互補鏈修飾的磁性納米探針（cDNA-MNPs)分散于BB緩沖液（10mmol/L Tris， pH 8.5，120mmol/L NaCl，5mmol/L KC1 和20mmol/L CaCl2)中，4°C保存。
[0016] (7)對赭曲霉毒素A標準品進行檢測，建立標準曲線。通過赭曲霉毒素A適配體DNA 與其互補DNA單鏈的雜交，取75yL信號探針和80yL磁性探針在BB緩沖液中37°C反應2h，得到 近紅外上轉換發光納米材料-磁性納米材料復合物，磁分離收集復合物，用BB緩沖液清洗數 次，保證游離的近紅外上轉換發光納米材料完全除去，重懸于BB緩沖液中，在980nm激光激 發下得到804nm處的上轉換發光信號，此時復合物的信號（1〇)最大。配制不同濃度的0TA標 準品加入到納米復合物體系中，在37°C反應2h后，外界磁場分離下清洗數次，保證脫落下來 的UCNPs完全洗去。于熒光光譜儀中，在980nm激光激發下測定發光強度，隨著赭曲霉毒素A 濃度的增加發光信號（I)逐步減小。根據發光差值(AI = I-Io)與對應的赭曲霉毒素A標準 品濃度建立標準曲線，實驗結果在〇.〇l-l〇〇ng/mL區間內得到良好線性關系。
[0017] (8)對赭曲霉毒素A樣品進行檢測：對樣品做簡單的處理，隨后直接加入到上述納 米復合物體系中37°C孵育2h后，直接在980nm激光下激發得到804nm處的上轉換發光信號， 從標準曲線中求得對應的赭曲霉毒素A的濃度。
[0018]本發明的優點是：
[0019] (1)利用適配體對被檢測物質實現特異性捕獲，有效提高了檢測的穩定性和準確 性。
[0020] (2)利用適配體與抗體相比較，具有可人工合成，不依賴動物和細胞，周期短、成本 低、批次間差異小，便于化學修飾，穩定性也好，可長期保存。
[0021] (3)利用激光誘導上轉換發光，檢測背景低大大提高了檢測的靈敏度。
[0022] (4)利用一步溶劑法制備Fe304磁性納米材料將其用于分析檢測過程，可以簡化分 離過程，提高檢測效率。
【附圖說明】
[0023]圖1:基于基于近紅外上轉換發光標記和磁分離的赭曲霉毒素A檢測方法的實驗原 理圖
[0024]圖2:他￥?4113().2，1'111().()2近紅外上轉換發光納米材料的電鏡圖（ &);聚丙烯酸修飾 NaYF4: Ybo. 2，Tmo. 〇2近紅外上轉換發光納米材料的電鏡圖(b)
[0025]圖3:氨基化Fe3〇4磁性納米材料的電鏡圖
[0026] 圖4:近紅外NaYF4: Ybo. 2，Tmo. 〇2上轉換發光納米材料的XRD圖
[0027] 圖5:氨基化Fe3〇4磁性納米材料的XRD圖
[0028] 圖6:他￥?4113().2，1'111().()2近紅外上轉換發光納米材料的發光光譜
[0029] 圖7:近紅外上轉換發光強度隨赭曲霉毒素A變化疊加圖（a);赭曲霉毒素A檢測標 準曲線圖（b)，濃度范圍在0.01-100ng/mL。
【具體實施方式】
[0030] 本發明包括但不限于以上實施例，凡是在本發明的精神和原則下進行的任何等同 替換或者局部改進，都將視為在本發明的保護范圍之內。
[0031] 實施例1:啤酒實際樣品中赭曲霉毒素A檢測標準曲線建立及檢測樣品預處理：啤 酒樣品置于4°C冰箱冷藏30min，超聲脫氣。取脫氣后啤酒樣品20g，置于25mL容量瓶中，加 2%碳酸氫鈉和15%氯化鈉混合提取液至刻度，混勻，用玻璃纖維濾紙過濾至澄清，收集濾 液備用。
[0032] 從本地超市購買5中不同類別的啤酒，利用本發明方法和酶聯免疫方法分別測定 其中赭曲霉毒素A的含量，結果見表一。兩種方法檢測結果一致，無明顯差異。
[0033]表一:啤酒實際樣品檢測，本發明方法與ELI SA方法對比
[0034]
[0035] 注:ND為未檢出
[0036] 實施例2:啤酒實際樣品中赭曲霉毒素A的檢測及加標回收率實驗樣品預處理同實 施例1。
[0037]以實施例1得到的5組赭曲霉毒素A濃度數據為本底值，分別向其中加入五種不同 濃度的0TA標準品，同樣利用本發明方法再次檢測其中0TA的含量，得到檢測值。回收率％ = (檢測值-本底值)/添加量X 100%。從表二數據可以看到回收率在90.0%~105.0%，說明 本發明穩定，靈敏，準確，適用于啤酒實際樣品中0TA的檢測。
[0038]表二:啤酒實際樣品中赭曲霉毒素A的檢測及加標回收率
【主權項】
1. 一種基于近紅外上轉換發光標記和磁分離的赭曲霉毒素 A檢測方法，其特征在于:將 赭曲霉毒素 A(OTA)適配體與近紅外NaYF4:YbQ.2，TmQ.() 2上轉換發光納米材料偶聯形成信號探 針，同時生物素化0TA適配體互補寡核苷酸單鏈與Fe3〇 4磁性納米材料連接形成磁性探針，通 過雙鏈雜交形成似￥?4:￥13().2，1'1]1().()2近紅外上轉換發光納米材料一Fe3〇4磁性納米材料復合 物；向檢測體系中加入OTA，0TA會優先與適配體結合，導致互補鏈與0TA適配體解離，從而使 一部分NaYF4: Ybo. 2，Tmo. 〇2近紅外上轉換發光納米材料一Fe3〇4磁性納米材料復合物分解，充 分磁分離去上清后，利用980nm激發，收集上轉換發光在804nm處的發光信號；在0.01-100ng/mL濃度范圍內，0TA的濃度與804nm處上轉換發光信號變化呈正相關，建立標準曲線， 達到對0TA的定量檢測，可用于啤酒中0TA的檢測。
【文檔編號】G01N33/543GK106053790SQ201610353399
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月25日
【發明人】王周平, 戴邵亮, 吳世嘉, 段諾
【申請人】江南大學