一種針對赭曲霉毒素a的檢測方法
【專利摘要】本發明提供了一種針對赭曲霉毒素A的檢測方法，該方法基于直接競爭ELISA技術，先將單抗包被后，加入待測樣品和觸酶C100標記的赭曲霉毒素A，樣品中的赭曲霉毒素A與觸酶標記的赭曲霉毒素A競爭性的與酶標板上固定的單克隆抗體結合，通過觸酶催化雙氧水分解，降低對巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點的熒光淬滅，根據熒光強度來判斷樣品中赭曲霉毒素A的含量。本發明創新性的引入了新的過氧化氫酶，在降低成本的同時提升了反應精度；與此同時，本發明使用了更為靈敏的新型熒光底物巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點，較傳統的TMB底物發光靈敏性顯著提升。
【專利說明】
一種針對赭曲霉毒素A的檢測方法
技術領域
[0001]本發明涉及抗原檢測技術領域，進一步涉及基于ELISA的抗原檢測技術，具體涉及一種針對赭曲霉毒素A的檢測方法。
【背景技術】
[0002]赭曲霉毒素是由赭曲霉(Aspergillusochraceors)、統孢青霉(Pmiciliumvermculosutm)、純綠青霉(Penici Iiumviridicatum)和其他幾種青霉屬真菌產生的次級代謝產物。赭曲霉毒素為異香豆素類系列衍生物，包括A、B、C等7種結構類似的化合物。其中赭曲霉毒素A毒性最大，可損害動物的肝臟和腎臟，且具有致畸、致癌和致突變作用，被認為與人類巴爾干腎病發生有關。國際癌癥研究機構(Internat1nal Agency forResearch on Cancer，IARC)將赭曲霉毒素A定位為2B類致癌物。赭曲霉毒素A常污染小麥、玉米、谷類、咖啡以及葡萄等農作物。因此，建立靈敏、快速的檢測方法是有效防治赭曲霉毒素A的重要技術前提。
[0003]現有技術中，檢測赭曲霉毒素A常用方法包括確證法以及快速篩查法兩大類。常用確證法有高效液相色譜法及液相色譜-質譜聯用法等。盡管該類方法具有靈敏度高等特點，但需依賴于昂貴的儀器設備和熟練的操作人員，且需復雜的樣品前處理，因此無法滿足基層及現場實地監控的需要。基于免疫學的快速篩查方法因具有通量高、檢測快速、價格便宜等優勢，近年來得到了大量的推廣和應用。特別是，酶聯免疫吸附法(ELISA)方法因具有快速、靈敏、特異、準確、可定量、操作簡便、無需貴重儀器設備，且對樣品純度要求不高，特別適用于大批量樣品的檢測等優點，已成為赭曲霉毒素A快速篩查檢測的主要方法。然而，現有技術中針對赭曲霉毒素A的ELISA檢測方法普遍基于辣根過氧化物酶標記的抗體或抗原催化雙氧水生成羥自由基，進而氧化無色的化學顯色底物四甲基聯苯二胺(TMB)形成藍色產物，然后使用終止液(2M H2SO4)終止反應形成黃色溶液于450nm處記錄吸光度值。該類方法因其顯色強度較低，因此檢測靈敏度相對較低，當待測樣品中目標物含量較低時易出現假陰性結果，從而無法滿足實際應用的要求。
[0004]近年來，一些新型的信號傳導機制被報道用于替代傳統ELISA的信號傳導機制用于提高ELI SA的靈敏度，如放射免疫分析底物、化學發光底物、熒光底物以及共振膠體金溶液等。然而，發光體系的構建需要充分考慮被檢測對象的分子生物學性質，例如在方法層面，抗體的包被及其與抗原的結合性能，選用何種標記物酶及其與抗體的偶聯方法，顯色底物的選擇以及具體發光方法;在效果層面，既要保證顯色反應的靈敏性，又應滿足顯色強度與目標物含量的線性關系。因此，針對赭曲霉毒素A的ELISA檢測方法，尤其以提升其檢測靈敏性為目的的方法改進，具有突出的技術難度。

【發明內容】

[0005]本發明旨在針對現有技術的技術缺陷，提供一種針對赭曲霉毒素A的檢測方法，以解決現有技術的赭曲霉毒素A ELISA檢測方法精度較低。
[0006]本發明要解決的另一技術問題是現有技術用于赭曲霉毒素A檢測的ELISA方法中，標記抗原的酶靈敏性較低。
[0007]本發明要解決的再一技術問題是現有技術用于赭曲霉毒素A檢測的ELISA方法中，顯色系統靈敏性較低。
[0008]本發明要解決的又一技術問題是當采用ELISA法檢測赭曲霉毒素A時，過程中抗赭曲霉毒素A單抗的包被效果較差。
[0009]本發明要解決的又一技術問題是當采用觸酶ClOO作為抗原標記酶對赭曲霉毒素A執行ELISA檢測時，具體工藝方法并不明確。
[0010]本發明要解決的又一技術問題是當采用觸酶ClOO作為抗原標記酶、采用雙氧水和巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點作為底物對赭曲霉毒素A執行ELISA檢測時，檢測結果與抗原濃度的線性關系不佳。
[0011]本發明要解決的又一技術問題是當采用觸酶ClOO作為抗原標記酶、采用雙氧水和巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點作為底物對赭曲霉毒素A執行ELISA檢測時，過程中洗滌效果不佳。
[0012]為實現以上技術目的，本發明采用以下技術方案:
[0013]—種針對赭曲霉毒素A的檢測方法，該方法屬于直接競爭酶聯免疫法，該方法是針對赭曲霉毒素A抗原的檢測，該方法中用于標記抗原的酶是觸酶C100。
[0014]作為優選，該方法中底物包括雙氧水和巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點。
[0015]作為優選，該方法包括以下步驟:
[0016]I)包被抗赭曲霉毒素A單克隆抗體，而后加入待測樣品；
[0017]2)而后加入觸酶ClOO標記的赭曲霉毒素A，混合后于35?39°C避光環境中反應40?80min，洗滌；
[0018]3)而后加入濃度為8?12ymol/L的雙氧水溶液混合，于35?39°C避光環境中反應20?40min;
[0019]4)而后加入巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點混合，于室溫避光環境中反應10?20min；
[0020]5)檢測步驟4)產物的熒光強度。
[0021]該熒光強度即用于反應待測樣品中赭曲霉毒素A含量，實際操作中可利用已知濃度且呈梯度分布的多組赭曲霉毒素A標準液通過以上方法繪制熒光強度-赭曲霉毒素A濃度標準曲線，再利用待測樣品的熒光強度從標準曲線中計算待測樣品的赭曲霉毒素A含量。具體操作方法可以依據本技術領域的一般技術常識任一選擇。上述梯度分布的多組赭曲霉毒素A標準液，可以分別選擇Opg/mL、0.125pg/mL、0.25pg/mL、0.5pg/mL、Ipg/mL、2pg/mL。
[0022]該優選技術方案中，步驟I)中先加入待測樣品，使待測樣品中所含有的抗原物質與酶標板上的抗體結合，待步驟2)加入觸酶ClOO標記的赭曲霉毒素A后，觸酶ClOO標記的赭曲霉毒素A與待測樣品中的抗原競爭性的與固相抗體結合;步驟3)加入雙氧水溶液后，可被觸酶ClOO催化分解;而后步驟4)加入量子點后實現發光作用；由于酶標板上所含有的觸酶Cl00的量與發光強度呈正相關、與待測樣品中抗原含量呈負相關，因此待測樣品中赭曲霉毒素A的含量與發光強度呈負相關性。在該優選技術方案中:各試劑在使用前可以先于室溫平衡30min以上再使用；步驟I)中待測樣品的加入量優選為30?70yL/孔，更優的是50yL/孔;步驟2)中觸酶ClOO標記的赭曲霉毒素A的加入量優選為30?70μ!7孔，更優的是50μ!7孔;步驟3)中雙氧水溶液的加入量優選為80?120yL/孔，更優的是I OOyL/孔;步驟4)中巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點的加入量優選為30?70μ!7孔，更優的是50μ!7孔。
[0023]作為優選，步驟I)中所述包被抗赭曲霉毒素A單克隆抗體具體包括以下操作:
[0024]Α)取蛋白G，在酶標板上以0.04?0.0611101/1、？!19.4?9.8的碳酸鹽緩沖液作為包被液，稀釋蛋白G至18?22yg/ mL ；
[0025]B)去除酶標板上的液體后利用洗滌液洗滌酶標板，而后取抗赭曲霉毒素A單克隆抗體，利用所述包被液在酶標孔內稀釋抗赭曲霉毒素A單克隆抗體至0.6?lyg/mL;
[0026]C)去除酶標板上的液體后利用洗滌液洗滌酶標板，再加入牛血清白蛋白封閉液，于35?39°C封閉I?3h，而后棄去封閉液。
[0027]進一步可以執行以下優選:步驟A)中稀釋后，于O?8°C條件下靜置8?12h，再執行步驟B);步驟B)中稀釋后，于35?39°C條件下靜置I?3h，再執行步驟C);步驟A)所述包被液的加入量為80?120yL/孔，更優的是10yL/孔;步驟B中包被液的加入量為80?120yL/孔，更優的是10yL/孔;步驟C)所述牛血清白蛋白的濃度為0.3?0.7 %，更優的是0.5 % ;棄去封閉液后的酶標板于室溫下干燥，而后于2?6°C保存。
[0028]作為優選，步驟2)所述觸酶ClOO標記的赭曲霉毒素A是通過以下方法制備的:
[0029]M)配制赭曲霉毒素A濃度為0.8?1.2mg/mL的四氫呋喃溶液，加入N-羥基丁二酰亞胺至濃度為1.8?2.2mg/mL，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽至濃度為3.6?4.411^/1111^，而后于避光條件下反應40?80111；[11;
[0030]N)而后固液分離，取上清揮發溶劑，取殘留物溶解于二甲基甲酰胺中，即得到活化產物；
[0031 ] P)將步驟N)所述活化產物與含觸酶ClOO濃度為3.5?4.5mg/mL的碳酸氫鈉溶液混合，于避光條件下反應8?12h;
[0032]Q)而后透析去除游離的赭曲霉毒素A，即得到所述觸酶ClOO標記的赭曲霉毒素A。
[0033]進一步可以執行以下優選:步驟Μ)中所述四氫呋喃溶液的溶劑僅為四氫呋喃；步驟Μ)中反應溫度為室溫;步驟N)中二甲基甲酰胺的用量是步驟Μ)中四氫呋喃用量的1/5?3/5;步驟P)中所述碳酸氫鈉溶液中碳酸氫鈉含量為0.1?0.15mol/L，更優的是0.1?0.15moI/L;步驟P)中的反應是在震蕩條件下進行的；步驟Q)所述透析的時間為66?78h，更優的是72h;步驟Q)所述透析是在0.0lmol/L的PBS溶液中進行的；步驟N)中所述固液分離是10000r/min離心 15min。
[0034]作為優選，步驟4)所述巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點是通過以下方法制備的:配制含有8?12mmol/L硝酸鎘、20?28mmol/L巰基丙酸、3?7mmol/L碲氫化納的溶液即為前體溶液，所述前體溶液的PH為11?11.5，將所述前體溶液水浴加熱至93?97°C，即得到所述巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點。在此基礎上進一步優選的，還可以包括PH調整環節，所述pH調整是利用NaOH實現的。
[0035]作為優選，步驟5)中熒光強度的檢測是利用酶標儀實現的，激發波長為310nm，發射波長為590nmo
[0036]在以上任一項技術方案基礎上優選的，所述洗滌是利用洗滌液沖洗或浸泡，所述洗滌液是含有0.3?0.7 % (v/v)吐溫-20的PBST溶液，所述PBST溶液的濃度為0.005?0.02mol/L，所述 PBST 溶液的 pH 為 7.0?7.5。
[0037]在以上技術方案中，觸酶(Catalase)又稱為過氧化氫酶，本發明中所使用的觸酶ClOO專指由美國Sigma-Aldrich公司出品的、型號為cat.N0.ClOO的觸酶。所述觸酶ClOO標記的赭曲霉毒素A是指在赭曲霉毒素A分子上連接觸酶ClOO后的物質。
[0038]以上技術方案中，酶標板可以選用96孔黑色熒光酶標板。96孔黑色熒光酶標板，抗赭曲霉毒素A單克隆抗體，觸酶C100，雙氧水，硝酸鎘，巰基丙酸，碲氫化納等試劑均自市面購得。
[0039]作為優選，所述洗滌是向酶標孔中加入320?360yL/孔的洗滌液，洗滌3?4次，每次間隔10?30s。
[0040]作為優選，待測樣品在執行檢測前先進行以下預處理:(1)取粉碎好的樣品過20目篩并徹底混合；(2)稱取5g樣品，加入12.5ml提取液(甲醇:水=7: 3)，劇烈震蕩30min; (3)5000印111離心10111；[11，用濾紙過濾；(4)取ImL濾液用ImL PBS稀釋，備用。
[0041]本發明采用酶聯免疫吸附試驗方法來檢測。用于檢測赭曲霉毒素A的ELISA試劑盒的測定原理:樣品中的赭曲霉毒素A與觸酶標記赭曲霉毒素A競爭性的與酶標板上固定的抗赭曲霉毒素A單克隆抗體結合，通過觸酶催化雙氧水分解，降低對巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點的熒光淬滅，根據熒光強度的大小來判斷樣品中赭曲霉毒素A的含量。如果樣品中的赭曲霉毒素A含量少，熒光強度高;反之，則熒光強度低。即熒光強度的高低與標準品或樣品中赭曲霉毒素A的含量成反比例關系。該方法可直接用于檢測玉米及玉米制品中的赭曲霉毒素A。本發明的試劑盒檢測方法操作簡便，檢測靈敏、準確、快速，適用于大批量樣品的檢測。
[0042]采用本發明技術方案具有如下有益效果:
[0043]1、本發明方法使用更為靈敏的新型的觸酶取代傳統ELISA方法中的辣根過氧化物酶，可以大大節約了成本。
[0044]2、本發明方法使用更為靈敏的新型的熒光底物(巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點)取代傳統ELISA方法中的化學顯色底物，可以大大提高其檢測靈敏度，相對于傳統ELISA至少提高了 2-3數量級。
【附圖說明】
[0045]圖1是本發明檢測方法和以辣根過氧化物酶作為抗體標記物酶、以TMB作為底物的常規檢測方法原理對比圖。
[0046]圖2是本發明實施例1中百分熒光率-赭曲霉毒素A濃度標準曲線圖。
[0047]圖3是本發明實施例2中百分吸光率-赭曲霉毒素A濃度標準曲線圖。
【具體實施方式】
[0048]以下將對本發明的【具體實施方式】進行詳細描述。為了避免過多不必要的細節，在以下實施例中對屬于公知的結構或功能將不進行詳細描述。
[0049]以下實施例中所使用的近似性語言可用于定量表述，表明在不改變基本功能的情況下可允許數量有一定的變動。因此，用“大約”、“左右”等語言所修正的數值不限于該準確數值本身。在一些實施例中，“大約”表示允許其修正的數值在正負百分之十(10%)的范圍內變化，比如，“大約100”表示的可以是90至IjllO之間的任何數值。此外，在“大約第一數值到第二數值”的表述中，大約同時修正第一和第二數值兩個數值。在某些情況下，近似性語言可能與測量儀器的精度有關。
[0050]除有定義外，以下實施例中所用的技術和科學術語具有與本發明所屬領域技術人員普遍理解的相同含義。
[0051 ]以下實施例中所用的試驗試劑耗材，如無特殊說明，均為常規生化試劑;所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值;以下實施例中的％，如無特別說明，均為質量百分含量。
[0052]以下實施例中，所述96孔黑色熒光酶標板購買于美國Corning公司；所述的抗赭曲霉毒素A單克隆抗體是購買于無錫中德伯爾生物技術有限公司;所述觸酶(cat.N0.C100)和底物液A雙氧水購買于美國Sigma-Aldrich公司(35% ,cat.N0.349887)。所述的觸酶ClOO即指觸酶(cat.N0.Cl 00)。
[0053]實施例1(基于本發明赭曲霉毒素A的新型熒光ELISA檢測方法制備一試劑盒，并將其用于在檢測玉米和玉米產品中的赭曲霉毒素A殘留量)
[°°54]檢測赭曲霉毒素A的新型熒光ELISA試劑盒的制備及檢測方法，包括抗赭曲霉毒素A單克隆抗體包被的96孔黑色熒光酶標板、赭曲霉毒素A標準品、觸酶標記赭曲霉毒素A工作液、底物液A雙氧水，熒光底物液B巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點和濃縮洗滌液。
[0055]下面具體描述本發明中檢測赭曲霉毒素A的ELISA試劑盒的制備，
[0056]所述96孔黑色熒光酶標板購買于美國Corning公司;抗赭曲霉毒素A單克隆抗體是購買于無錫中德伯爾生物技術有限公司；觸酶(cat.N0.C100)和底物液A所述雙氧水購買于美國Sigma-Aldrich公司(35% ,cat.N0.349887)。
[0057]所述觸酶標記赭曲霉毒素A通過以下方式獲得:取0.5mg赭曲霉毒素A溶解于500yL無水四氫呋喃中，加入Img N-羥基丁二酰亞胺和2.0mg 1_(3_二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽，室溫避光反應60min ； 10000r/min離心15min，棄沉淀，干燥上清，揮發四氫呋喃，殘留物溶于200yL二甲基甲酰胺中，得到活化產物；將活化產物緩慢滴加于觸酶溶液(4mg，溶解于ImL 0.13mol/L NaHCO3溶液中)中，室溫避光劇烈振蕩過夜，反應產物在0.01mol/L的PBS溶液中透析72h，去除游離的赭曲霉毒素A;透析結束后，將樣品冷凍干燥得到觸酶標記赭曲霉毒素A，分裝，-20 0C保存。
[0058]所述熒光底物液B巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點通過以下方式獲得:取新鮮配置的碲氫化納溶液加入到硝酸鎘溶液中，加入lmol/L的氫氧化鈉溶液調pH值至11.2，向混合溶液中加入巰基丙酸溶液做穩定劑，形成的碲化鎘前體溶液水浴加熱到950C ο前體溶液中加入各溶液的濃度為硝酸鎘溶液的終濃度為lOmmol/L，巰基丙酸的終濃度為24mmol/L，碲氫化納的終濃度為5mmol/L。
[0059]所述抗赭曲霉毒素A單克隆抗體包被的96孔黑色熒光酶標板的制備:
[0060]用0.05mol/LpH 9.6的碳酸鹽(CBS)緩沖液作為包被液，將蛋白G(購買于上海研卉生物科技有限公司，cat.N0.PR0-402)稀釋成20yg/mL，10yL/孔，4 °C放置過夜，取出酶標板甩掉板內液體，用稀釋后的濃縮洗滌液340μ!7孔，洗板3次，30 s/次;然后將抗赭曲霉毒素A單克隆抗體稀釋成0.8yg/mL，10yL/孔，37°C放置2h，取出酶標板甩掉板內液體，用稀釋后的濃縮洗滌液340yL/孔，洗板3次，30s/次;最后加入0.5 %牛血清白蛋白(BSA，購買于美國Sigma-Aldrich公司，cat.N0.A4737)封閉，340yL/孔，37°C放置2h，棄去封閉液，拍干后的酶標板放置恒溫間(25°C)晾干;抽檢合格后將酶標板真空密封后置4°C下保存。所述的赭曲霉毒素 A 標準品配制濃度分別為 0pg/mL、0.125pg/mL、0.25pg/mL、0.5pg/mL、lpg/mL、2pg/mL。
[0061]所述觸酶標記赭曲霉毒素A工作液的制備:采用赭曲霉毒素A與觸酶偶聯得到的，用卩85(0.0謂4!17.4)稀釋成1:1280。
[0062]所述底物液A雙氧水的制備:用roS( 0.0 lmol/L，pH7.4)稀釋至ΙΟμπιο 1/L。所述巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點熒光底物液的制備:方法，用PBS (0.0 Imo I/L，pH7.4)稀釋成1:400。
[0063]所述濃縮洗滌液是10倍濃縮洗滌液，其包含0.5%吐溫-20，0.0lmoVL的roST，pH值范圍7.0-7.5之間。
[0064]基于上述制備的試劑，本發明用于檢測赭曲霉毒素A的ELISA試劑盒包括如下材料:
[0065](I) 96孔酶標板X I塊(包被有抗赭曲霉毒素A的單克隆抗體)；
[0066](2)標準液 X 6瓶:(ImL/瓶)0pg/mL、0.125pg/mL、0.25pg/mL、0.5pg/mL、lpg/mL、2pg/mL；
[0067](3)觸酶標赭曲霉毒素A工作液8mL;
[0068](4)底物液 A7mL；
[0069](5)熒光底物液B 7mL;
[0070](6)終止液7mL;
[0071](7) 10 X 濃縮洗滌液 20mL。
[0072]使用本試劑盒時的注意事項:
[0073](I)從冰箱中取出的試劑及樣本應回溫至20?25°C;
[0074](2)在洗板過程中如果出現板孔干燥的情況，則會出現標準曲線不成線性，重復性不好的現象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作；
[0075](3)每加一種試劑前需將其搖勻；
[0076](4)底物液A為濃度35 %的雙氧水，避免直接接觸皮膚；
[0077](5)不要使用過了有效日期的試劑盒;也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試劑，摻雜使用過了有效期的試劑盒會引起靈敏度的降低;不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑；
[0078](6)儲存條件:保存試劑盒于2?8°C，不要冷凍，將不用的酶標板微孔板放進自封袋重新密封。底物液A和熒光底物液B對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下；
[0079](7)該試劑盒最佳反應溫度為25°C，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發生變化。
[0080]本發明的試劑盒用于檢測玉米和玉米產品中的赭曲霉毒素A殘留量時，通過以下步驟實施:樣品前處理、用本發明試劑盒進行檢測、分析結果。
[0081 ] (I)樣品前處理
[0082]取粉碎好的樣品過20目篩，并徹底混合;稱取5g樣品，加入12.5mL提取液(甲醇:水=7:3)，劇烈震蕩30min；5000印111離心10111；[11，用濾紙過濾;取ImL濾液用ImL PBS稀釋，備用。
[0083](2)用本發明試劑盒進行檢測上述樣品中赭曲霉毒素A殘留量
[0084]取包被有抗赭曲霉毒素A單克隆抗體的酶標板，加標準品/樣本50yL/孔到對應的微孔中；加入觸酶標記赭曲霉毒素A工作液，50yL/孔，用蓋板膜蓋板后置室溫37 V避光環境中反應45min;小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，用洗滌工作液340yL/孔，充分洗滌4?5次，每次間隔1s，用吸水紙拍干;加入底物液A雙氧水(lOymol/L)稀釋液，10yL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37°C避光環境中反應30min;加入熒光底物液B巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點稀釋液50μ!7孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C避光環境中反應15min，設定焚光酶標儀(美國Thermo Var1skan Flash全波長多功能酶標儀)于激發波長為310nm，發射波長為590nm處檢測，測定每孔熒光值(請在5min內讀完數據)；以標準品測試的熒光值與標準品的濃度對數值繪制標準曲線，對照標準曲線計算樣品中赭曲霉毒素A的含量。
[0085](3)分析結果
[0086]用上述制備的試劑盒中的6個赭曲霉毒素A標準品濃度Opg/mL、0.125pg/mL、
0.25pg/mL、0.5pg/mL、lpg/mL、2pg/mL。在激發波長為310nm，發射波長為590nm處檢測焚光強度。
[0087]百分熒光率的計算，標準品或樣本的百分熒光率等于標準品或樣本的百分熒光強度值的平均值(雙孔)除以第一個標準(O標準)的熒光強度值，再乘以100%，即百分熒光率(% ) =F/FoX 100%，其中F為標準溶液或樣本溶液的平均熒光強度值，Fo為Opg/mL標準溶液的平均熒光強度值。
[0088]以標準品百分熒光率為縱坐標，以赭曲霉毒素A標準品濃度(pg/mL)的半對數為橫坐標繪制標準曲線，求出直線方程。標準曲線為y = -0.3221n (X) +0.3047，R2 = 0.9902，見附圖2 ο該方法的IC5q被定義為百分分光率為50 %時所對應的赭曲霉毒素A的濃度。通過該標準曲線計算得IC5Q為0.55pg/mL。當進行實際樣本檢測時，將樣本的百分熒光率(F/FoX100%)值代入標準曲線中，從標準曲線上讀出所對應樣本的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中赭曲霉毒素A的實際濃度。
[0089]實施例2(以辣根過氧化物酶為抗體標記酶、以TMB作為顯色底物的赭曲霉毒素A直接競爭ELI SA檢測方法)
[0090]傳統ELISA試劑盒用于檢測玉米和玉米產品中的赭曲霉毒素A殘留量時，通過以下步驟實施:樣品前處理、用本發明試劑盒進行檢測、分析結果。
[0091](I)樣品前處理
[0092]取粉碎好的樣品過20目篩，并徹底混合;稱取5g樣品，加入12.5mL提取液(甲醇:水=7:3)，劇烈震蕩30min；5000印111離心10111；[11，用濾紙過濾;取ImL濾液用ImL PBS稀釋，備用。
[0093](2)用傳統ELISA試劑盒進行檢測上述樣品中赭曲霉毒素A殘留量
[0094]取包被有抗赭曲霉毒素A單克隆抗體的酶標板，加標準品/樣本50yL/孔到對應的微孔中；加入辣根過氧化物酶標記赭曲霉毒素A工作液，50μ!7孔，用蓋板膜蓋板后置室溫370C避光環境中反應45min;小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，用洗滌工作液340yL/孔，充分洗滌4?5次，每次間隔1 s，用吸水紙拍干;加入TMB顯色液，I OOyL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置37°C避光環境中反應15min;加入終止液50μ!7孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀于450nm處檢測，測定每孔吸光度值(請在5min內讀完數據)；對比待測樣品與標準品的吸光度值大小，定量分析待測樣品中的赭曲霉毒素A的殘留量。
[0095](3)分析結果
[0096]用傳統ELISA試劑盒中的6個赭曲霉毒素A標準品濃度0ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.2ng/mL、0.5ng/mL、lng/mL、2ng/mL。在450nm處測量吸光度值。百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等于標準品或樣本的百分吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個標準(O標準)的吸光度值，再乘以100%，即百分吸光度值(％)=B/BoX 100%其中B為標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值，Bo為Ong/mL標準溶液的平均吸光度值。
[0097]以標準品百分吸光率為縱坐標，以赭曲霉毒素A標準品濃度(ng/mL)的半對數為橫坐標繪制標準曲線，求出直線方程。標準曲線為7 = -21.33111(1) + 18.39，妒=0.9924，見附圖3 ο該方法的IC5q被定義為百分吸光率為50 %時所對應的赭曲霉毒素A的濃度。通過該標準曲線計算得IC5q為0.4ng/mL。當進行實際樣本檢測時，將樣本的百分熒光率(B/BoX 100%)值代入標準曲線中，從標準曲線上讀出所對應樣本的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中赭曲霉毒素A的實際濃度。
[0098]由以上實施例1與實施例2對比可以發現，本發明的新型ELISA方法靈敏度可達經典ELISA方法的700倍[(400pg/mL)/(0.55pg/mL)]，同時也證明本發明的新型ELISA方法可適用于以高靈敏度檢測任何傳統ELISA方法可以檢測的物質。
[0099]實施例3
[0100]—種針對赭曲霉毒素A的檢測方法，該方法屬于直接競爭酶聯免疫法，該方法是針對赭曲霉毒素A抗原的檢測，該方法中用于標記抗原的酶是觸酶C100。
[0101]在以上技術方案的基礎上，滿足以下條件:
[0102]該方法中底物包括雙氧水和巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點。
[0103]具體檢測方法包括以下步驟:
[0104]I)包被抗赭曲霉毒素A單克隆抗體，而后加入待測樣品；
[0105]2)而后加入觸酶ClOO標記的赭曲霉毒素A，混合后于35°C避光環境中反應40min，洗滌；
[0106]3)而后加入濃度為8ymol/L的雙氧水溶液混合，于35°C避光環境中反應20min;
[0107]4)而后加入巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點混合，于35°C避光環境中反應1min;
[0108]5)檢測步驟4)產物的熒光強度。
[0109]步驟I)中所述包被抗赭曲霉毒素A單克隆抗體具體包括以下操作:
[0110]A)取蛋白G，在酶標板上以0.04mol/L、pH9.4的碳酸鹽緩沖液作為包被液，稀釋蛋白G至18yg/mL，于(TC條件下靜置Sh;
[0111]B)去除酶標板上的液體后利用洗滌液洗滌酶標板，而后取抗赭曲霉毒素A單克隆抗體，利用所述包被液在酶標孔內稀釋抗赭曲霉毒素A單克隆抗體至0.6yg/mL，于35 °C條件下靜置Ih;
[0112]C)去除酶標板上的液體后利用洗滌液洗滌酶標板，再加入牛血清白蛋白封閉液，于35°C封閉lh，而后棄去封閉液。
[0113]步驟2)所述觸酶ClOO標記的赭曲霉毒素A是通過以下方法制備的:
[0114]M)配制赭曲霉毒素A濃度為0.8mg/mL的四氫呋喃溶液，加入N-羥基丁二酰亞胺至濃度為1.8mg/mL，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽至濃度為3.611^/11^，而后于避光條件下反應40min;
[0115]N)而后以lOOOOr/min離心15min進行固液分離，取上清揮發溶劑，取殘留物溶解于二甲基甲酰胺中，即得到活化產物；
[0116]P)將步驟N)所述活化產物與含觸酶ClOO濃度為3.5mg/mL的碳酸氫鈉溶液混合，于避光條件下反應Sh;
[0117]Q)而后透析去除游離的赭曲霉毒素A，即得到所述觸酶ClOO標記的赭曲霉毒素A。
[0118]步驟4)所述巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點是通過以下方法制備的:配制含有8mmo 1/L硝酸鎘、20mmo 1/L巰基丙酸、3mmol/L碲氫化納的溶液即為前體溶液，所述前體溶液的PH為11，將所述前體溶液水浴加熱至93°C，即得到所述巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點。
[0119]步驟5)中熒光強度的檢測是利用酶標儀實現的，激發波長為310nm，發射波長為590nmo
[0120]所述洗滌是利用洗滌液沖洗或浸泡，所述洗滌液是含有0.3% (v/v)吐溫-20的PBST溶液，所述PBST溶液的濃度為0.005mol/L，所述PBST溶液的pH為7.0。
[0121]實施例4
[0122]—種針對赭曲霉毒素A的檢測方法，該方法屬于直接競爭酶聯免疫法，該方法是針對赭曲霉毒素A抗原的檢測，該方法中用于標記抗原的酶是觸酶C100。
[0123]在以上技術方案的基礎上，滿足以下條件:
[0124]該方法中底物包括雙氧水和巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點。
[0125]具體檢測方法包括以下步驟:
[0126]I)包被抗赭曲霉毒素A單克隆抗體，而后加入待測樣品；
[0127]2)而后加入觸酶ClOO標記的赭曲霉毒素A，混合后于39°C避光環境中反應80min，洗滌；
[0128]3)而后加入濃度為12ymol/L的雙氧水溶液混合，于39°C避光環境中反應40min;
[0129]4)而后加入巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點混合，于39°C避光環境中反應20min;
[0130]5)檢測步驟4)產物的熒光強度。
[0131 ]步驟I)中所述包被抗赭曲霉毒素A單克隆抗體具體包括以下操作:
[0132]A)取蛋白G，在酶標板上以0.06mol/L、pH9.8的碳酸鹽緩沖液作為包被液，稀釋蛋白G至22yg/mL，于8 V條件下靜置12h;
[0133]B)去除酶標板上的液體后利用洗滌液洗滌酶標板，而后取抗赭曲霉毒素A單克隆抗體，利用所述包被液在酶標孔內稀釋抗赭曲霉毒素A單克隆抗體至lyg/mL，于39°C條件下靜置3h;
[0134]C)去除酶標板上的液體后利用洗滌液洗滌酶標板，再加入牛血清白蛋白封閉液，于39°C封閉3h，而后棄去封閉液。
[0135]步驟2)所述觸酶ClOO標記的赭曲霉毒素A是通過以下方法制備的:
[0136]M)配制赭曲霉毒素A濃度為1.2mg/mL的四氫呋喃溶液，加入N-羥基丁二酰亞胺至濃度為2.2mg/mL，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽至濃度為4.411^/11^，而后于避光條件下反應80min;
[0137]N)而后以lOOOOr/min離心15min進行固液分離，取上清揮發溶劑，取殘留物溶解于二甲基甲酰胺中，即得到活化產物；
[0138]P)將步驟N)所述活化產物與含觸酶ClOO濃度為4.5mg/mL的碳酸氫鈉溶液混合，于避光條件下反應12h;
[0139]Q)而后透析去除游離的赭曲霉毒素A，即得到所述觸酶ClOO標記的赭曲霉毒素A。
[0140]步驟4)所述巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點是通過以下方法制備的:配制含有12mmo I /L硝酸鎘、28mmo I /L巰基丙酸、7mmo I /L碲氫化納的溶液即為前體溶液，所述前體溶液的PH為11.5，將所述前體溶液水浴加熱至97°C，即得到所述巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點。
[0141]步驟5)中熒光強度的檢測是利用酶標儀實現的，激發波長為310nm，發射波長為590nmo
[0142]所述洗滌是利用洗滌液沖洗或浸泡，所述洗滌液是含有0.7% (v/v)吐溫-20的PBST溶液，所述PBST溶液的濃度為0.02mol/L，所述PBST溶液的pH為7.5。
[0143]實施例5
[0144]一種針對赭曲霉毒素A的檢測方法，該方法屬于直接競爭酶聯免疫法，該方法是針對赭曲霉毒素A抗原的檢測，該方法中用于標記抗原的酶是觸酶C100。
[0145]在以上技術方案的基礎上滿足以下條件:
[0146]該方法中底物包括雙氧水和巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點。
[0147]具體檢測方法包括以下步驟:
[0148]I)包被抗赭曲霉毒素A單克隆抗體，而后加入待測樣品；
[0149]2)而后加入觸酶ClOO標記的赭曲霉毒素A，混合后于37°C避光環境中反應60min，洗滌；
[0150]3)而后加入濃度為ΙΟμπιοΙ/L的雙氧水溶液混合，于37°C避光環境中反應60min;
[0151]4)而后加入巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點混合，于37°C避光環境中反應15min;
[0152]5)檢測步驟4)產物的熒光強度。
[0153]實施例6
[0154]—種針對赭曲霉毒素A的檢測方法，該方法屬于直接競爭酶聯免疫法，該方法是針對赭曲霉毒素A抗原的檢測，該方法中用于標記抗原的酶是觸酶C100，該方法中底物包括雙氧水和巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點。
[0155]實施例7
[0156]—種針對赭曲霉毒素A的檢測方法，該方法屬于直接競爭酶聯免疫法，該方法是針對赭曲霉毒素A抗原的檢測，該方法中用于標記抗原的酶是觸酶C100。
[0157]以上對本發明的實施例進行了詳細說明，但所述內容僅為本發明的較佳實施例，并不用以限制本發明。凡在本發明的申請范圍內所做的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1.一種針對赭曲霉毒素A的檢測方法，該方法屬于直接競爭酶聯免疫法，該方法是針對赭曲霉毒素A抗原的檢測，該方法中用于標記抗原的酶是觸酶C100。2.根據權利要求1所述的針對赭曲霉毒素A的檢測方法，其特征在于該方法中底物包括雙氧水和巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點。3.根據權利要求2所述的針對赭曲霉毒素A的檢測方法，其特征在于包括以下步驟: 1)包被抗赭曲霉毒素A單克隆抗體，而后加入待測樣品； 2)而后加入觸酶ClOO標記的赭曲霉毒素A，混合后于35?39°C避光環境中反應40?80min，洗滌； 3)而后加入濃度為8?12ymol/L的雙氧水溶液混合，于35?39°C避光環境中反應20?40min； 4)而后加入巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點混合，于室溫避光環境中反應10?20min; 5)檢測步驟4)產物的熒光強度。4.根據權利要求3所述的針對赭曲霉毒素A的檢測方法，其特征在于步驟I)中所述包被抗赭曲霉毒素A單克隆抗體具體包括以下操作: A)取蛋白G，在酶標板上以0.04?0.06mol/L、pH9.4?9.8的碳酸鹽緩沖液作為包被液，稀釋蛋白G至18?22yg/mL; B)去除酶標板上的液體后利用洗滌液洗滌酶標板，而后取抗赭曲霉毒素A單克隆抗體，利用所述包被液在酶標孔內稀釋抗赭曲霉毒素A單克隆抗體至0.6?lyg/mL; C)去除酶標板上的液體后利用洗滌液洗滌酶標板，再加入牛血清白蛋白封閉液，于35?39°C封閉I?3h，而后棄去封閉液。5.根據權利要求4所述的針對赭曲霉毒素A的檢測方法，其特征在于步驟A)中稀釋后，于O?8°C條件下靜置8?12h，再執行步驟B);步驟B)中稀釋后，于35?39°C條件下靜置I?3h，再執行步驟C)。6.根據權利要求3所述的針對赭曲霉毒素A的檢測方法，其特征在于步驟2)所述觸酶Cl00標記的赭曲霉毒素A是通過以下方法制備的: M)配制赭曲霉毒素A濃度為0.8?1.2mg/mL的四氫呋喃溶液，加入N-羥基丁二酰亞胺至濃度為1.8?2.2mg/mL，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽至濃度為3.6?4.4mg/mL，而后于避光條件下反應40?80min ； N)而后固液分離，取上清揮發溶劑，取殘留物溶解于二甲基甲酰胺中，即得到活化產物； P)將步驟N)所述活化產物與含觸酶ClOO濃度為3.5?4.5mg/mL的碳酸氫鈉溶液混合，于避光條件下反應8?12h; Q)而后透析去除游離的赭曲霉毒素A，即得到所述觸酶ClOO標記的赭曲霉毒素A。7.根據權利要求6所述的針對赭曲霉毒素A的檢測方法，其特征在于步驟N)中所述固液分離是 10000r/min離心 15min。8.根據權利要求3所述的針對赭曲霉毒素A的檢測方法，其特征在于步驟4)所述巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點是通過以下方法制備的:配制含有8?12 m m ο I / L硝酸鎘、2 O?28mmol/L巰基丙酸、3?7mmol/L碲氫化納的溶液即為前體溶液，所述前體溶液的pH為11?11.5，將所述前體溶液水浴加熱至93?97 °C，即得到所述巰基丙酸修飾的碲化鎘量子點。9.根據權利要求3所述的針對赭曲霉毒素A的檢測方法，其特征在于步驟5)中熒光強度的檢測是利用酶標儀實現的，激發波長為310nm，發射波長為590nmo10.根據權利要求3?9任一項所述的針對赭曲霉毒素A的檢測方法，其特征在于所述洗滌是利用洗滌液沖洗或浸泡，所述洗滌液是含有0.3?0.7% (v/v)吐溫-20的PBST溶液，所述PBST溶液的濃度為0.005?0.02mol/L，所述PBST溶液的pH為7.0?7.5。
【文檔編號】G01N33/543GK105842441SQ201610156983
【公開日】2016年8月10日
【申請日】2016年3月18日
【發明人】熊勇華, 江湖, 陳銳, 梁毅, 周耀峰, 黃小林, 許恒毅
【申請人】南昌大學