適配體修飾磁納米材料及其在分離赭曲霉毒素a中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種適配體修飾磁性納米材料及其在分離赭曲霉毒素 A中的應用，屬 于分離赭曲霉毒素 A的技術領域。
【背景技術】
[0002] 赭曲霉毒素 A(〇chrat〇xinA，0ΤΑ)是曲霉菌屬和青霉菌屬的某些種產生的空間代 謝產物，毒理學研究表明，OTA具有腎臟毒性、肝臟毒性、免疫毒性，以及致畸、致癌和致突變 作用等多種毒性，對動物和人體健康有很大的潛在危害。OTA在自然界分布廣泛，主要存在 于谷類、豆類及豆制品、干果、啤酒、茶葉等中。因此，建立準確、靈敏、快速的OTA檢測技術 對于食品安全具有重要意義。
[0003] 核酸適配體是從體外合成的隨機寡核甘酸文庫中通過指數富集配體的系統進化 技術篩選得到的與靶物質特異性結合的一簇DNA或RNA片段。這種寡核甘酸序列形成的 高級結構具有能識別與之相對應的任何類型的蛋白質和低分子的靶物質，并與靶物質有高 親和力而形成靶物質-適配體的復合物。與抗體相比，核酸適配體具有易合成、易修飾、易 固定、可反復使用和長期保存的優點，并且核酸適配體作為識別分子在蛋白質研究、藥物檢 測、醫學診斷和食品安全等方面得到了廣泛應用。
[0004] 中國專利文獻CN102023147A公開了一種適配體功能化磁性納米材料磁分離-上 轉換熒光納米材料標記檢測赭曲霉毒素 A的方法，其中適配體功能化磁性納米材料制備采 用水熱法合成氨基化Fe3O4磁納米粒子，戊二醛將氨基化納米粒子和親和素偶聯，利用親和 素和生物素特異性結合生物素修飾的赭曲霉毒素 A適配體。這種制備方法存在戊二醛偶 聯氨基化Fe3O4磁納米粒子可能導致磁納米粒子聚集，磁納米粒子上戊二醛、親和素兩步修 飾，偶聯效率不高，親和素和生物素特異性結合能否在實際樣品中實現重復利用性（即再 生性）等問題。

【發明內容】

[0005] 本發明所要解決的技術問題在于采用現有技術方法對實際樣品中含有的微量OTA 進行檢測時，由于實際樣品中還含有其他多種復雜成分，最終導致檢測得到OTA含量的誤 差大，準確度較差，從而提出一種能夠從實際樣品中有效分離出OTA的適配體-磁納米粒子 復合物，將分離得到的OTA進行富集后再用于檢測，準確度高。
[0006] 為解決上述技術問題，本發明的技術內容為：
[0007] -種適配體-磁納米粒子復合物，具有核殼形結構，其從內至外依次包括：
[0008] 由順磁性Fe3O4磁納米粒子構成的內核層；
[0009] 包覆所述內核層的外殼層，所述外殼層包括內側的硅烷化層和位于所述硅烷化層 外側的適配體修飾層。
[0010] 用于形成所述硅烷化層的硅烷化試劑為3-(2, 3-環氧丙氧）丙基三甲氧基硅烷。
[0011] 所述適配體修飾層中的適配體為赭曲霉毒素 A適配體；
[0012] 所述的赭曲霉毒素 A適配體的序列號為5' -nh2-gatcgggtgtgggtggcgtaaagggagc ATCGGACA-3'。
[0013] 所述的適配體-磁納米粒子復合物的制備方法，包括如下步驟：
[0014] (1)內核層的制備
[0015] 將二價鐵可溶性鹽和三價鐵可溶性鹽按照摩爾比1 :2溶于強酸溶液中，得到混合 液；
[0016] 在氮氣保護條件下，將所述混合液加熱至30_50°C，之后在攪拌條件下，向所述混 合液中緩慢滴加強堿溶液并調節PH至10-11，升溫至50-70°C，陳化1-3小時，經水洗至中 性，干燥后即得作為所述內核層的順磁性Fe 3O4磁納米粒子；
[0017] (2)在所述內核層的外側包覆上所述硅烷化層
[0018] 稱取步驟⑴所述的順磁性Fe3O4磁納米離子，加入到含硅烷化試劑體積分數 為4-6 %的甲苯溶液中，控制所述順磁性Fe3O4磁納米離子與所述硅烷化試劑的加入量為 30-50mg/ml，超聲分散30-60min，室溫振蕩反應12-24h，經磁分離得到反應產物經甲苯和 乙醇交替清洗，氮氣保護下干燥，即在所述內核層的外側包覆上所述硅烷化層，得到表面帶 有環氧官能團的磁納米粒子；
[0019] (3)在所述硅烷化層的外側修飾上所述適配體修飾層
[0020] 稱取步驟（2)所述的表面帶有環氧官能團的磁納米粒子，超聲分散于PBS緩沖溶 液，在外加磁場下進行磁分離，棄去上清液后，將所述的磁納米粒子再次超聲分散于PBS緩 沖溶液中，加入適配體，30-40°C條件下進行振蕩反應12-24h ;
[0021] 之后加入pH = 8. 0的乙醇胺溶液，40-60°C振蕩反應4-6h，在外加磁場下進行磁分 離，棄去上清液，即在所述硅烷化層的外側修飾上所述適配體修飾層，即在所述硅烷化層的 外側修飾上所述適配體修飾層，得到適配體-磁納米粒子復合物。
[0022] 步驟⑴中所述干燥為冷凍干燥，所述干燥的時間為12-24h ;
[0023] 步驟（2)中所述干燥的溫度為80_120°C，所述干燥的時間為0. 5_2h ;
[0024] 所述的二價鐵可溶性鹽為氯化亞鐵、硫酸亞鐵中的一種或幾種的混合物；
[0025] 所述的三價鐵可溶性鹽為氯化鐵、硝酸鐵、硫酸鐵中的一種或幾種的混合物。
[0026] 所述的適配體-磁納米粒子復合物在分離赭曲霉毒素 A中的應用。
[0027] 采用所述的適配體-磁納米粒子復合物分離赭曲霉毒素 A的方法，具體步驟包 括：
[0028] (1)稱取含赭曲霉毒素 A的樣品，經溶劑提取、稀釋得到含赭曲霉毒素 A的樣品 液；
[0029] (2)向步驟⑴得到的所述含赭曲霉毒素 A樣品液中加入所述的適配體-磁納米 粒子復合物，37°C條件下進行振蕩反應20-40min，在外加磁場下進行磁分離，棄去上清液 后，得到赭曲霉毒素 A-適配體修飾磁納米復合材料；
[0030] (3)向步驟⑵得到的所述赭曲霉毒素 A-適配體修飾磁納米復合材料中加入甲酸 甲醇（1:99, V/V)混合溶液，使得赭曲霉毒素 A從所述的赭曲霉毒素 A-適配體修飾磁納米 復合材料中解離出來并溶于甲酸甲醇混合溶液中，在外加磁場下進行磁分離，得到的上清 液即為含赭曲霉毒素 A的分離液。
[0031] 還包括所述的適配體-磁納米粒子復合物的再生，具體步驟如下：
[0032] 將步驟（3)進行磁分離后得到的磁性離子，采用含NaCl濃度為0. 5mol/L的pH為 4. 0的乙酸緩沖液和含NaCl濃度為0. 5mol/L的pH為8. 3的磷酸緩沖液進行交替清洗，經 磁分離，即得再生后的適配體-磁納米粒子復合物。
[0033] 還包括對赭曲霉毒素 A含量的定量檢測，具體步驟包括：
[0034] 將所述的含赭曲霉毒素 A的分離液，經氮氣吹干，用體積比為4:6的水和乙腈的混 合溶液進行定容后，采用高效液相-熒光檢測聯用進行赭曲霉毒素 A的定量檢測。
[0035] 本發明的上述技術方案相比現有技術具有以下優點：
[0036] (1)本發明所述的適配體-磁納米粒子復合物，包括順磁性Fe3O4磁納米粒子構成 的內核層、硅烷化層和位于所述硅烷化層外側的適配體修飾層，從而所述的適配體-磁納 米粒子復合物不僅具備了能夠在外加磁場下快速從復雜樣液中分離出來的特性，同時還具 備了利用適配體對被檢物質能夠進行特異性識別捕獲的特性，從而利用本發明所述的適配 體-磁納米粒子復合物能夠實現從復雜樣液中將被檢物質進行快速、有效地分離，選擇性 好，分離效率高，數據表明，本發明所述的適配體-磁納米粒子復合物的分離效率和回收率 高達80-92 %，進一步，將分離出來的被檢物質富集后再用于檢測，能有效提高準確度。
[0037] 此外，由于所述順磁性Fe3O4磁性納米離子具有較大的比表面積，使得在其表面對 適配體具有較高的固定化容量，從而只需使用少量的Fe 3O4磁性納米離子就能實現對復雜 樣液中的被檢物質進行有效分離。
[0038] (2)本發明所述的適配體-磁納米粒子復合物，通過利用結構中的適配體對被檢 物質進行特異性識別捕獲后，還能夠在適當條件下將被檢物質從結構中適配體上解離出 來，進一步再對解離出被檢物質的磁性納米材料進行再生處理，即得再生后的適配體-磁 納米粒子復合物，將再生后的適配體-磁納米粒子復合物重新用于對復雜樣液中的被檢物 質進行