一種甲醛熒光探針及其制備方法、應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種甲醛熒光探針其制備方法、應用，屬于分析化學技術領域。
【背景技術】
[0002] 近年來，檢測具有活性羰基的物質受到了廣泛關注，比如一氧化碳、乙二醛、甲基 乙二醛和丙烯醛等。醛類物質是人體新陳代謝過程的產物，通常被認為是對人體有毒的。 那是因為羰基具有較高活性，能與蛋白質和DNA末端的氨基反應，破壞其原有的生物活性， 已被證明醛類物質與糖尿病、心血管病、腦梗塞、肝臟疾病和癌癥等疾病有關。甲醛作為最 簡單的醛，它不但可以通過自然活動和人類生產活動產生，也可以在生物體內通過去甲基 化酶和氧化酶催化產生，比如氨基脲敏感胺氧化酶（SSA0)和賴氨酸特異性組蛋白去甲基化 酶1 (LSD1)。人體內正常水平濃度的甲醛起著重要作用，與空間記憶和認知能力的形成緊 密相關。然而，當甲醛濃度高于正常水平時，會引起一些疾病的發生，例如心臟病、阿茲海默 癥、癌癥等。因此，檢測生理環境的甲醛可能對與甲醛相關的病理研究有幫助，是一項非常 重要和有實際意義的工作。
[0003] 熒光分析法具有特異選擇性、實時在線檢測和對生物樣品非侵入檢測等其他傳統 檢測方法而不具備的優點而備受關注。熒光分析法是通過熒光探針與特定目標分析物作 用，檢測其熒光信號變化的一種檢測方法。以在檢測過程中產生的發射帶數量來分，熒光 探針通常分為兩類，一類是只有單發射帶的熒光增強型或淬滅型熒光探針，其熒光信號的 強度通常與探針濃度、探針所處環境、檢測儀器等因素有關，因此其檢測的準確性會受到影 響；另一類是具有雙發射帶的比率型熒光探針，可以通過檢測其比值信號來消除以上因素 所帶來的實驗誤差，因此這類熒光探針在熒光分析法中更具有準確性。而目前報道的甲醛 熒光探針都是基于第一類的增強型熒光探針，還沒有比率型甲醛探針被報道。所以開發具 有比值熒光信號的甲醛探針還需進一步探索和研究。

【發明內容】

[0004] 針對目前甲醛熒光探針檢測甲醛時所面臨的"檢測準確性容易受探針濃度、探針 所處環境、檢測儀器影響"的現狀，本發明通過分子設計，合成出一種具有雙發射帶的比率 型甲醛熒光探針，我們將其命名為RFFP;并進一步提供了RFFP的制備方法和應用。
[0005] 技術方案 一種甲醛熒光探針，其分子式為：C14H15N0 ;其結構式如下：
[0006] 本發明的甲醛熒光探針，是一種具有雙發射帶的比率型熒光探針。其激發波長為 318nm;隨甲醛濃度的升高，其在359nm處的熒光峰值逐漸降低，同時在451nm處產生一 個新的發射帶并且熒光峰值逐漸增強。其在451nm處的熒光強度與359nm處的熒光強度 比值（1451/1359)，隨甲醛濃度的升高而增強；當甲醛濃度是醛熒光探針濃度的300倍時，I451/ ^359-53〇
[0007]本發明的甲醛熒光探針，隨著時間增加，451nm處的熒光強度與359nm處的熒光 強度比值（1451/1359)逐漸變大，并且在200分鐘左右達到最大值。
[0008]本發明的甲醛熒光探針，能抗乙醛、乙二醛、甲基乙二醛、苯甲醛、丙氨酸、甘氨酸、 絲氨酸、精氨酸、半胱氨酸、谷胱甘肽和葡萄糖的干擾。
[0009]所以，本發明還提供了上述甲醛熒光探針的應用，用于檢測甲醛。包括用于檢測水 環境中的甲醛和生物樣品的甲醛。
[0010] 上述應用，具體方法為：采用熒光光譜儀，通過甲醛熒光探針的熒光光譜變化來檢 測水環境中的甲醛；或者，采用共聚焦顯微鏡，通過觀察甲醛熒光探針的熒光成像圖的變化 來檢測生物樣品中的甲醛。所述生物樣品，可以是活細胞。
[0011] 上述應用，采用熒光光譜儀，激發波長為318nm;隨甲醛濃度的升高，熒光光譜在 359nm處的熒光峰值逐漸降低，同時在451nm處產生一個新的發射帶并且熒光峰值逐漸增 強。
[0012] 上述應用，采用共聚焦顯微鏡，激發光源為汞燈，分別收集藍色和綠色頻道熒光； 隨著甲醛濃度的增加，藍色頻道熒光逐漸減弱，同時綠色頻道熒光逐漸增強。
[0013] 上述的甲醛熒光探針的合成路線如下：
[0014] 上述甲醛熒光探針的制備方法： 將6-羥基-2-萘甲醛的甲醇溶液和質量分數為25%的氨水混合，在冰浴條件下攪拌 30-60分鐘；然后加入烯丙基硼酸頻哪醇酯，撤去冰浴，在攪拌條件下反應10小時以上；除 去溶劑，得廣品。
[0015]優選的，除去溶劑采用的方法為減壓蒸餾。
[0016]優選的，可以采用硅膠層析柱對產品進行純化。
[0017]本發明甲醛熒光探針，檢測準確性不容易受探針濃度、探針所處環境、檢測儀器影 響，準確性高；所能檢測到的甲醛的最低濃度為5. 53X10 5mmol/L，靈敏度高；抗干擾能 力強，實現了在水溶液中對甲醛的高選擇性檢測；不僅能檢測水環境中的甲醛，還能檢測生 物樣品(細胞環境）中的甲醛，現了在活細胞水平中甲醛的熒光成像，具有潛在的實際應用 價值。本發明的甲醛熒光探針的合成只需通過一步反應完成：其制備方法簡單，并且產率較 尚。
【附圖說明】
[0018] 圖1是實施例1中探針RFFP的1HNMR圖譜； 圖2是實施例1中探針RFFP的13CNMR圖譜； 圖3是實施例2中探針RFFP隨不同量甲醛的加入，熒光譜圖的變化情況；圖中，在359 nm處的熒光峰值，從上至下，依次為在甲醛濃度為0、0.ΟΚΟ. 05、0. 10、0. 15、0. 20、0. 25、 0· 30、0· 40、0· 50、0· 60、0· 80、L00、L50、2· 00、3· 00mmol/L中探針RFFP的熒光光譜；在 451nm處的熒光峰值，從下至上，依次為在甲醛濃度為0、0. 01、0. 05、0. 10、0. 15、0. 20、 0· 25、0· 30、0· 40、0· 50、0· 60、0· 80、1· 00、1· 50、2· 00、3· 00mmol/L中探針RFFP的熒光光 譜； 圖4是實施例2中探針RFFP熒光強度比值（I451/1359)與不同量甲醛的線性關系圖；圖 中，從左往右，甲醛濃度依次為〇· 20、0· 25、0· 30、0· 40、0· 50、0· 60、0· 80、1· 00、1· 50、2· 00、 3.00mmol/L； 圖5是實施例3中探針RFFP與甲醛隨時間變化的點狀熒光數據圖； 圖6是實施例4中探針RFFP對不同干擾分析物的選擇性柱狀熒光數據圖；圖中，1，空 白；2,甲醛；3,乙醛；4,甲基乙二醛；5,乙二醛；6,苯甲醛；7,丙氨酸；8,甘氨酸；9,絲氨酸； 10,精氨酸；11，半胱氨酸；12,谷胱甘肽；13,葡萄糖；14,雙氧水； 圖7是實施例5中探針RFFP與細胞中甲醛響應的熒光成像圖；圖中，加入10μΜ探針RFFP孵育30分鐘后的熒光成像（a-d)，隨后加入1mm〇l/L(e-h)或者3mm〇l/L(i-l)甲 醛繼續培育2小時后的熒光成像；(a，e，i)，明場成像；(b，f，j)，藍色通道熒光成像圖； (c，g，k)，綠色通道熒光成像；（d，h，k)，比值圖像(綠/藍）；標尺為25微米。
【具體實施方式】
[0019] 實施例1:化合物RFFP的合成：
將86mg6-羥基-2-萘甲醛（0.5mmol)浴觶十5mL甲醇中，在冰浴條仵卜，加入378μL質量分數為25%的氨水（5mmol)并持續攪拌30分鐘。隨后加入101mg烯丙基硼酸頻 哪醇酯（0.6mmol)，撤去冰浴并繼續攪拌反應過夜（10h以上）。反應完后，將反應液通過 減壓旋轉蒸發儀除去溶劑得到粗產品，并用硅膠（200-300目）層析柱，以體積比為10:1的 二氯甲烷與乙醇為洗脫劑進行純化，得到70mg白色固體(產率為66%)。4NMR(400MHz, CDC13)，（p