一種高選擇性比值型熒光探針及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于熒光探針領域，具體涉及一種高選擇性比值型熒光探針及其在定量檢 測活細胞蛋白質相鄰巰基及活細胞熒光原位成像方法中的應用。
【背景技術】
[0002] 細胞內氧化還原環境的變化深刻地影響著細胞內各種生理功能。相鄰巰基蛋白 質，作為氧化還原平衡中還原端的頂點，密切參與各類氧化還原的調節，在酶活性的調節、 細胞信號轉導、疾病發生進程等方面起著非常關鍵的作用。由于蛋白質的巰基修飾基本沒 有光譜學特性，無法直接測量，而一般的檢測手段常常需要破壞細胞再通過化學方法檢測， 通常無法得到相鄰巰基蛋白在細胞內分布的信息。而細胞結構的破壞會導致細胞內各細胞 器氧化還原環境，以及各種與相鄰巰基相關酶類的重新分布。熒光成像可以提供大量直觀， 動態的信息，是進行生命科學研究的主要手段之一。
[0003] 錢永健等基于相鄰巰基與三價砷特異性結合的特點設計合成出了用于雙砷熒光 探針FLAsH及其類似物（Science1998, 281，269-272;US6008278)，但是該類探針只用于 發展一種蛋白質標記策略，涉及到的相鄰巰基蛋白是通過外源性導入的多肽鏈，內源性的 細胞中的相鄰巰基蛋白反而被外加的一定濃度的EDT給抑制住。
[0004]Ebright，R.H.等發展一類基于內源性相鄰巰基蛋白的雙砷探針（US20040019104， US20060141531)，該類探針雖然可以同細胞內內源性的相鄰巰基蛋白作用，但是該類探針 也只用于發展一種蛋白質標記策略，并非將該類探針用于檢測相鄰巰基蛋白以及與之密切 相關的氧化還原信號轉導和氧化還原蛋白質組學研究。同時，該類探針上連接了兩個砷基 團，在化學計量學上并不能同單一的一個含相鄰巰基的蛋白結合，容易在同一個探針分子 上連接上不同種類的相鄰巰基蛋白。
[0005] 因此，以上兩類探針只注重于發展一種蛋白質標記策略，并不能用于原位檢測活 細胞內源性的蛋白質相鄰巰基。因此，設計合成特異性的蛋白質相鄰巰基小分子熒光探針， 發展蛋白質相鄰巰基的原位熒光成像技術及相關蛋白質組技術，對系統性地研究與揭示蛋 白質巰基氧化還原狀態在信號轉導這一與許多重要疾病相關的重大生命科學領域中的功 能與作用具有重要意義，是當前研究十分迫切的任務。
[0006]CN102807588已設計出一類用于活細胞內蛋白質相鄰巰基檢測和原位成像的小分 子熒光探針。為了進一步消除外部背景干擾，提高檢測信號的信噪比，本發明進一步設計并 合成一種可以實現對細胞內蛋白質相鄰巰基分布強度進行熒光定量檢測和比值型熒光成 像的比值型小分子熒光探針就顯得非常有價值。

【發明內容】

[0007] 本發明設計合成一類基于熒光共振能量轉移（FRET)原理的比值型小分子熒光探 針，建立對不同氧化還原條件下細胞內蛋白質相鄰巰基分布強度的熒光定量檢測和比值型 熒光成像方法。
[0008] 因此，本發明第一方面提供下式I所示的化合物：
[0009]
[0010] 式I中，
[0011] &為11或羥基；
[0012] R2 為Η或C1-C3 烷基；
[0013]R3 為Η或C1-C3 烷基；
[0014]m為 1、2 或 3;和
[0015] η為1-5的整數。
[0016] 在一個具體實施例中，&為羥基。
[0017] 在一個具體實施例中，R2和R3都為Η。
[0018] 在一個具體實施例中，式I化合物為：
[0019]
[0020] 本發明另一方面提供具有下式II結構的比值型小分子熒光探針：
[0021]
[0022] 式II中，
[0023]D為能量供體；
[0024]A為能量受體；
[0025]m為 1、2 或 3;和
[0026]η為1-5的整數。
[0027] 在一個具體實施例中，D為香豆素、萘酰亞胺、氟硼吡咯、熒光素、羅丹明、花菁染料 等熒光團。
[0028] 在一個具體實施例中，Α為香豆素、萘酰亞胺、氟硼吡咯、熒光素、羅丹明、花菁染 料、偶氮類熒光淬滅劑等。
[0029] 在一個具體實施例中，式II化合物的VTAF1部分（即除A和D以外的式II結構） 通過包括但不限于氨基與羧基縮合，氨基烷基化等方式與熒光團連接。這些連接方式是本 領域技術人員根據式II化合物與熒光分子上的相應連接基團而能夠容易地確定的。
[0030] 在一個具體實施例中，D為7-氨基香豆素，A為1，8-萘酰亞胺。
[0031] 在一個具體實施例中，本發明式II化合物為：
[0032]
..0
[0033] 本發明還提供一種檢測組合物，該組合物含有本發明式II所示的化合物和適宜 的溶劑。
[0034] 溶劑的例子可以是，例如任何可溶解本發明式II所示的化合物并與所培養的細 胞相容的各種溶劑。這類溶劑的例子包括但不限于PBS溶液（例如含有5 - 15mMPBS、 1 - 10mMEDTA、和 0· 1 - 1. 0%DMS0,ρΗ7· 4 ;優選含有 10mMPBS、5mMEDTA、0. 5%DMS0， ρΗ7· 4)，HEPES緩沖液（例如含有 5 - 15mMHEPES、1 - 10mMEDTA和 0· 1 - 1% %DMSO， ρΗ7· 4 ;優選含有lOmMHEPES、5mMEDTA和 0· 5%DMSO,ρΗ7· 4)，Tris緩沖液（25mMTris 堿，1. 92M甘氨酸），和MOPS緩沖液（例如含有 15-25mMM0PS、25-75mMNaCl和 0. 5-1. 5mM EDTA，ρΗ7· 0 ;優選含有 20mMM0PS、50mMNaCl和ImMEDTA，ρΗ7· 0)等。
[0035] 本發明還提供一種檢測試劑盒，該試劑盒含有本發明式II所示的化合物或本發 明的檢測組合物，以及任選地指導技術人員使用該試劑盒檢測或定位相鄰巰基蛋白質的說 明書。
[0036] 本發明的探針分子能夠與蛋白質上相鄰巰基特異性作用。因此，本發明還包括式 II化合物在相鄰巰基蛋白質的檢測或定位中的應用。
[0037] 本發明還包括一種檢測或定位相鄰巰基蛋白質的方法，所述方法包括將本發明的 式II所示的探針分子給予檢測對象，和檢測所述化合物中的熒光分子，從而檢測或定位所 述相鄰疏基蛋白質。
[0038] 在一具體實施例中，本發明采用熒光比值檢測技術對相鄰巰基蛋白進行離體檢 測。在此實施例中，通過利用本發明的熒光探針結合相鄰巰基蛋白前后的熒光波長發生移 動，利用熒光移動前后兩個波長處兩種熒光信號強度的比值達到定量檢測蛋白質相鄰巰基 的目的。
[0039] 在一具體實施例中，本發明采用熒光共聚焦顯微鏡研究細胞內蛋白質相鄰巰基強 度分布，利用比值型熒光成像技術檢測亞細胞水平上蛋白質分布。具體為利用熒光探針結 合細胞內相鄰巰基蛋白前后發生不同波長的兩種熒光信號，從而利用雙通道熒光信號對亞 細胞器上的相鄰巰基蛋白進行成像檢測，從而達到檢測細胞水平上相鄰巰基蛋白在活細胞 內的熒光定量檢測。
[0040] 本發明的方法還可結合電泳技術和流式細胞儀，進行與相鄰巰基蛋白相關的氧化 還原蛋白質組學研究。
[0041] 在一具體實施例中，本發明方法利用本發明探針分子原位檢測生物體內內源性相 鄰疏基蛋白。
[0042]在一具體實施例中，本發明方法利用本發明的探針分子進行氧化還原蛋白質組學 研究。
[0043] 可用于本發明探針分子進行檢測的相鄰巰基蛋白指一類包含一對及以上的空間 上鄰近巰基的蛋白質，包括但不限于硫氧還蛋白（Trx)和牛血清蛋白（BSA)，其中Trx蛋白 含有一對相鄰疏基，牛血清蛋白含有17對相鄰疏基。在該類蛋白質中，相鄰疏基不一定在 序列上相互挨近，但是必須在空間上足夠鄰近以至能夠使它們在氧化條件下成二硫鍵，在 還原條件下能以鄰近巰基形式存在。如果蛋白質上一對巰基滿足在氧化條件下能夠成為二 硫鍵，那么該對疏基就被稱為相鄰疏基。
[0044] 本發明的檢測對象或檢測樣品可包括例如，各種組織、器官和血液，這些組織、器 官和血液中的細胞，細胞培養物等。任何需要檢測和/或定位其相鄰巰基蛋白的對象或樣 品都可用于本發明。
[0045] 本發明還包括式II所示的探針分子的制備方法，包括設計合成了一個穩定的蛋 白質相鄰巰基受體二巰基丙醇及其類似物保護的對氨基亞砷酸（VTAF1)，和通過引入能夠 發生熒光共振能量轉移的一對熒光團和適當的連接臂修飾，從而合成了所示探針分子。制 備本發明探針分子的示范性實施例可參見本申請的實施例中的流程。本領域技術人員可根 據實際所要制備的探針分子，適當改變所述流程中的反應物質和條件，這些都在本領域技 術人員所掌握的知識范圍之內。
[0046] 本發明與現有技術相比，其有益效果體現在：
[0047] 1.合成的相鄰巰基受體VTAF1在生理環境中有較好的氧化還原耐受性，穩定性較 好；同時該受體對蛋白質相鄰巰基具有較高的選擇性，蛋白質上的其他基團如氨基、羧基和 單巰基等不存在干擾。另外該類受體可以分別在兩端修飾熒光團作為構建FRET探針。
[0048] 2.合成了一系列基于FRET原理的比值型小分子熒光探針以及相應的對照探針， 可以滿足活細胞內源性蛋白質相鄰巰基定量檢測的需求。
[0049] 3.利用熒光共聚焦成像技術及其分析軟件，首次實現了對于活細胞內源性蛋白質 相鄰疏基的定量檢測和動態跟蹤。
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