一種dna探針及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種DNA探針及其應用，屬于DNA生物傳感器技術領域。
【背景技術】
[0002]DNA具有豐富的空間結構及良好的結構可操作性，通過控制周圍環境(如pH、離子濃度等)以及人為設計具有特定堿基序列的DNA鏈，可形成特定的DNA空間構象，這些DNA結構與一些特定的化學或者生物分子相互作用，進而引起某種信號(如光信號、電信號)的改變，因此DNA作為優良的信號輸入和信號輸出單元，被廣泛應用于DNA分子傳感器的設計。光學分子傳感器由于其內在高靈敏度、可活體檢測等優勢，在DNA分子傳感器更是得到蓬勃發展。G-四鏈體是一種具有代表性的DNA高級結構，某些熒光探針可以特異性識別G-四鏈體結構，并產生熒光強度的變化。基于此，人們利用G-四鏈體構建了一系列DNA生物傳感器。
[0003]切刻內切酶是一類特殊的限制性核酸內切酶。通常，限制性核酸內切酶可以識別特定的雙鏈堿基序列，并在識別序列上或其周圍切割雙鏈，形成粘性末端或者平齊末端，而切刻內切酶的不同之處在于它可以識別特定的雙鏈堿基序列，但只在堿基序列上或者其周圍切斷一條鏈。研宄表明，限制性核酸內切酶與生物的許多生理過程有著密切的聯系，如DNA復制、DNA重組以及DNA修復等，因此對于切刻酶活性的檢測具有十分重要的意義。
[0004]隨著科學技術的發展，越來越多的致病基因序列得到確認，如HCV、人博卡病毒等。因此構建起一種高效、靈敏、定向檢測某種致病基因序列的生物傳感器尤為必要。

【發明內容】

[0005]本發明的目的就是為了克服上述現有技術存在的缺陷而提供一種DNA探針及其應用，通過所設計的DNA探針的構象變化，以熒光強度為檢測信號，用于對切刻內切酶活性和鐮刀型細胞貧血癥的致病基因進行檢測，從而為該方面生物傳感器的設計提供理論依據。
[0006]本發明的目的可以通過以下技術方案來實現:
[0007]本發明提供第一種DNA探針，該探針的DNA堿基序列含有目標切刻內切酶的特異性識別序列，在特異性識別序列兩端為富G序列，當特異性識別序列被切斷后，DNA雙鏈發生彎曲，在K+存在時，DNA探針兩端的富G單鏈因空間距離的拉近而形成G-四鏈體，以熒光強度為檢測信號來檢測G-四鏈體存在與否，進而檢測目標切刻內切酶存在與否。
[0008]作為優選，所述的目標切刻內切酶為Nt.BbvCI。
[0009]該DNA探針用于對目標切刻酶切酶的靈敏度、選擇性進行檢測。
[0010]通過熒光光譜法進行顯示，其對目標切刻酶切酶的熒光信號升起，對其它酶無明顯熒光信號升起的響應，顯示出對目標切刻酶切酶的選擇性。
[0011]通過熒光光譜法，測得其對目標切刻內切酶的檢出限為0.09U/mL。
[0012]本發明提供第二種DNA探針，該探針的DNA堿基序列同時含有目標切刻內切酶的特異性識別序列以及鐮刀型細胞貧血癥的正常基因序列，且切刻內切酶的特異性識別序列與鐮刀型細胞貧血癥的正常基因有部分重合序列，且鐮刀型細胞貧血癥的致病基因的突變位點位于重合序列之中。
[0013]該DNA探針用于對鐮刀型細胞貧血癥的致病基因的選擇性進行檢測。
[0014]通過熒光光譜法、比色法和紫外-可見光透射法進行顯示，其對正常基因的熒光信號升起，對鐮刀型細胞貧血癥的致病基因無明顯熒光信號升起的響應，顯示出對鐮刀型細胞貧血癥的致病基因的選擇性。
[0015]熒光光譜法是研宄小分子與DNA相互作用的主要手段，熒光物質在激發光的激發下，由基態躍迀至激發態后，會消耗一部分能量回到第一電子激發態的最低震動能級，同時以光量子的形式發射能量，即為熒光。小分子與DNA作用后，它的震動模式發生變化，導致熒光信號的變化。
[0016]比色法是通過比較或測量有色物質溶液顏色深度來確定待測組分含量的方法，它以生成有色化合物的顯色反應為基礎。本發明采用G-四鏈體/hemin DNA酶體系，G-四鏈體和hemin結合可形成一種具有辣根過氧化物酶催化性質的DNA酶，可催化H2O2氧化無色的ABTS，產生綠色的ABTS陽離子自由基(ABTS.+)，進而觀察到酶切反應溶液的顏色變化。
[0017]紫外-可見光透射法是指當不同反應體系熒光強度有較大差異時，在紫外燈固定波長的照射下，可裸眼觀察到明顯的熒光強度差異。
[0018]與現有技術相比，本發明設計的DNA探針對目標切刻內切酶和鐮刀型貧血病致病基因序列具有識別作用，從而為此類生物傳感器的設計提供理論依據，且檢測技術成熟，檢測精度高。
【附圖說明】
[0019]圖1為本發明中DNA探針形成G-四鏈體結構示意圖；
[0020]圖2為實施例1所設計的DNA探針對目標切刻內切酶活性檢測的熒光曲線；
[0021]圖3為實施例1中目標切刻內切酶的濃度和熒光強度的線性關系圖；
[0022]圖4為實施例2所設計的DNA探針對目標切刻內切酶的選擇性柱狀圖；
[0023]圖5為實施例3所設計的DNA探針對鐮刀型細胞貧血癥致病基因檢測的比色圖；
[0024]圖6為實施例3所設計的DNA探針對鐮刀型細胞貧血癥致病基因檢測的紫外-可見光透射圖；
[0025]圖7為實施例3所設計的DNA探針對鐮刀型細胞貧血癥致病基因檢測采用的DNA說明圖。
【具體實施方式】
[0026]下面結合附圖和具體實施例對本發明進行詳細說明。
[0027]以下實施例中，DNA探針形成G-四鏈體結構如圖1所示，該探針的DNA堿基序列含有目標切刻內切酶的特異性識別序列，在特異性識別序列兩端為富G序列，當特異性識別序列被切斷后，DNA雙鏈發生彎曲，在K+存在時，DNA探針兩端的富G單鏈因空間距離的拉近而形成G-四鏈體。
[0028]實施例1
[0029]DNA探針對目標切刻內切酶活性進行檢測
[0030]1.緩沖溶液的配制
[0031]緩沖溶液用三重蒸餾水配制。
[0032]高純水用SZ97自動三重蒸餾水發生器獲得。
[0033]緩沖液1:10mM Tris, pH = 7.5
[0034]緩沖液2:10mM Tris, 50mM KCl, pH = 7.5
[0035]2.本實施例的DNA探針，其喊基序列如下:
[0036]5， -GGGTTGGGCTCTGCTGAGGATCCATCGGGATGGG-3?
[0037]3， -AGACGACTCCTAGGTA-5，
[0038]其中，斜體加粗下劃線部分為目標切刻內切酶的特異性識別序列，長鏈序列在特異性識別序列的兩端為富G序列。
[0039]在裝有DNA的EP管內加入相應體積的緩沖液I，用移液槍吸吐使其混合均勻，密封，于90°C恒溫水槽中靜置5min，緩慢冷卻至室溫，4°C保存備用。
[0040]DNA濃度確定:用紫外分光光度計測量DNA在260nm的吸光度值A26(l。摩爾消光系數為 2.285 X 15m3CnT1, DNA 濃度[DNA] = ΚΧΑ260/ 2.285 X 15 (k 是稀釋倍數)，單位為 mo I
I/1 ο
[0041]3.存儲液的配制
[0042]I)NMM(N-甲基卟啉二丙酸IX)存儲液的配制(1.72mL, 5mM)
[0043]準確稱取NMM 5mg，用1.72mL DMSO(二甲基亞砜)將其溶解，混合均勻，_20°C避光保存，備用。
[0044]2) EDTA 溶液(5OmL, 40mM)
[0045]準確稱取0.7445g EDTA,加入50mL三重蒸餾水將其完全溶解，常溫保存備用。
[0046]熒光光譜法檢測的條件為:
[0047]儀器:Hitachi FP 7000熒光光度計
[0048]儀器參數:激發波長:399nm，狹縫寬度:(10，10)，電壓:500V
[0049]掃描范圍:550-750nm。
[0050]以切刻內切酶Nt.BbvCI為目標檢測物，實驗共配8組樣，每組樣依次加入 1yL DNA 探針(100 μ M)和 5yL 1X Cutsmart buffer，然后依次加入35，33，31，29，27，25，23，21 μ L新蒸三重蒸餾水，用移液槍吸吐，混合均勻，置于恒溫培養搖床(370C ) 1min 后，依次加入 O, 2，4，6，8，10，12，14 μ L Nt.BbvCI (1000U/mL)。樣品在恒溫培養搖床內培養1.5h后，加入50 μ L EDTA使酶失活。靜置0.5h后，加入880 μ L緩沖液2，靜置過夜。加入20 μ L ΝΜΜ(ΙΟΟμΜ)，暗處靜置40min，測熒光光譜。
[0051]本實施例所設計的DNA探針對目標切刻內切酶活性檢測的熒光曲線如圖2所示，隨著目標切刻內切酶濃度的增大，體系的熒光強度也隨之上升；目標切刻內切酶的濃度和熒光強度的線性關系如圖3所示，圖3表明在O?14U/mL濃度范圍內，切刻內切酶濃度與NMM的熒光強度呈現出良好的線性關系。以上數據隨著目標切刻內切酶濃度的增大，越來越多的DNA探針被目標切刻內切酶切斷后形成越來越多的G-四鏈體，NMM特異性結合G-四鏈體，并使得自身熒光強度逐漸上升，該DNA生物傳感器對目標切刻內切酶活性具有較好的檢測效果。
[0052]實施例2
[0053]DNA探針對目標切刻內切酶的選擇性
[0054]儀器:Hitachi FP 7000熒光光度計
[0055]儀器參數:激發波長:399nm，狹縫寬度:(10，10)，電壓:500V
[0056]掃描范圍:550-750nm。
[0057]以切刻內切酶Nt.BbvCI為目標檢測物，另外選取切刻內切酶Nt.BsmAI, Nt.BspQ