一種熒光探針gh及其制備和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及熒光探針領域，具體涉及一種可用于選擇性檢測堿性磷酸酶的熒光探 針。在細胞內常見的小分子5'磷酸核糖鳥苷（簡稱GMP)上引入熒光團2'2羥苯基苯并噻 唑（HBT)，與堿性磷酸酶作用后，利用反應物與產物的熒光差別實現選擇性地檢測活細胞中 的堿性磷酸酶。
【背景技術】
[0002] 堿性磷酸酶（ALP，ALKP，ALPase，Alk Phos) (EC 3. 1. 3. 1)是廣泛分布于人體各臟 器器官中，其中以肝臟為最多，其次為腎臟，骨骼、腸、和胎盤等組織。ALP能介導蛋白質，核 酸，及生物堿類等生物大分子的去磷酸化。該去磷酸化作用與激酶的磷酸化作用密切相關， 是生物體內物質代謝、物質轉運、信號轉導等生命活動中必要的調節過程。目前公認的堿性 磷酸酶偏高與肝臟疾病，肝腸循環，骨骼疾病密切相關。人血清的堿性磷酸酶廣泛用于疾病 的指示，當ALP產生過多或排泄受阻時，均可使血中ALP水平發生變化。但是其水平調控的 內在機制并不清楚。因此，開發能夠實時檢測細胞中堿性磷酸酶的探針具有重要意義。
[0003] 熒光探針是有效檢測生命體內堿性磷酸酶的手段之一，相比吸光度法具有檢測靈 敏的優勢。一個具有應用前景的熒光探針應具有作用前后熒光變化明顯、對目標分子響應 快、選擇性好、合成簡單等優點。目前應用于檢測堿性磷酸酶的方法主要集中于血清堿性磷 酸酶水平的檢測，檢測細胞中堿性磷酸酶的重要性并未受到太多重視。檢測方法最廣泛應 用的還是405nm下檢測pnpp (磷酸對硝基酚）的去磷酸化產物的吸收光譜，檢測堿性磷酸 酶的熒光探針雖然有一些新的發展，但是選擇性好的熒光探針仍寥寥無幾。尤其堿性磷酸 酶，酸性磷酸酶，磷酸二酯酶，腺苷酸環化酶對于去磷酸化的作用有很多底物交叉現象，開 發對其有選擇性的探針具有很大挑戰性。

【發明內容】

[0004] 本發明就是針對上述問題，提供了一種可用于選擇性檢測細胞內堿性磷酸酶的熒 光探針，此探針可以在生理條件下選擇性地與堿性磷酸酶作用，作用后熒光顯著增強。
[0005] 本發明采用如下技術方案：采用2' 2羥苯基苯并噻唑（HBT)作為熒光母體，在體 內普遍存在的小分子5'磷酸核糖鳥苷（簡稱GMP)上引入HBT，利用反應物與產物的熒光差 別實現選擇性地檢測堿性磷酸酶，尤其是可以應用于檢測活細胞中的堿性磷酸酶。合成的 探針化合物的結構用代號GH表示。
[0006] 所述的熒光探針GH的結構如結構式I所示。
[0007]
[0008] 所述的熒光探針的制備方法為：以2' 2羥苯基苯并噻唑（HBT)作為熒光母體，在 體內普遍存在的小分子5'磷酸核糖鳥苷（簡稱GMP)上引入HBT ;具體制備步驟如下，
[0009] 1)三氯氧磷與HBT于溶劑中攪拌反應后，真空下70°C加熱蒸干；
[0010] 2)步驟1)中得到的產物冷卻后，加入溶劑，攪拌后，加入 2' 3' -〇-isopropygyanosine，室溫下攪拌反應10h后，真空下70°C加熱蒸干；
[0011] 3)向步驟2)中得到的產物中加入蒸餾水，攪拌lh后抽濾出固體，甲醇洗滌三次所 得固體，紅外烘干；
[0012] 4)取步驟3)所得產物溶于醋酸和水中，冷凝回流，之后與正丁醇80°C下共沸旋 干，甲醇洗滌產物三次，得到最終產物GH。
[0013] 步驟1)中所述的HBT與三氯氧磷的加入量為1 :3-10 ;步驟2)中 2' 3' -〇-isopropygy anosine的加入量為第一步中HBT加入量的1. 2-1. 5倍；步驟4)中 加入的醋酸和水的量為4:1，冷凝回流的溫度為KKTC，時間為2h。
[0014] 步驟1)和步驟2)中，所述的所用的溶劑為無水吡啶；步驟1)-4)中所述的攪拌 方式為磁力攪拌。
[0015] 所述的熒光探針可以用于堿性磷酸酶的定性或定量檢測；所述的熒光探針和堿性 磷酸酶的作用模型符合雙位點酶動力學。
[0016] 所述的熒光探針應用于檢測堿性磷酸酶時，其是生成具有結構II的化合物，從而 導致熒光變化，結構II的名稱為2' 2羥苯基苯并噻唑（HBT)。
[0017]
[0018] 所述的熒光探針在定量檢測堿性磷酸酶中，與堿性磷酸酶作用后，512nm處檢測得 的熒光強度正比于堿性磷酸酶的活性。
[0019] 所述的熒光探針可用于細胞內堿性磷酸酶的檢測，實現細胞內堿性磷酸酶的熒光 成像。
[0020] 本發明的有益效果：該化合物在堿性磷酸酶存在下熒光發生顯著改變，可用于高 選擇性、高靈敏性地檢測堿性磷酸酶。尤其是，該化合物可用于細胞內中的堿性磷酸酶檢 測，這對于深入研究堿性磷酸酶在生物體內生理和病理過程的動力學機理具有重要意義。
【附圖說明】
[0021] 圖1實施例1中本發明提供的熒光探針GH的合成路線圖；
[0022] 圖2本發明提供的熒光探針GH檢測堿性磷酸酶的原理示意圖；
[0023] 圖 3 本發明提供的探針 GH 的1H NMR(a)，13C NMR(b)，32P NMR(c)譜圖；
[0024] 圖4實施例2中熒光探針GH與熒光團HBT水溶液的紫外可見吸收光譜（a)、熒光 激發光譜（b)、發射光譜（c);
[0025] 圖5實施例3中熒光探針GH對堿性磷酸酶的選擇性示意圖；
[0026] 圖6實施例4中熒光探針GH對不同濃度的ALP響應的動力學示意圖（a)及反應 速率與酶濃度的線性關系（b);
[0027] 圖7實施例5中突光探針GH與堿性磷酸酶反應速率的的動力學示意圖；
[0028] 圖8實施例6中熒光探針GH在堿性磷酸酶被抑制作用下示意圖。
[0029] 圖9實施例7中熒光探針GH在Hela細胞中成像示意圖。
【具體實施方式】
[0030] 實施例用于進一步說明本發明，但本發明不限于實施例。
[0031] 實施例1 (探針的合成）：
[0032] 如圖1所示，GH的合成：50mL兩口燒瓶真空/氮氣置換三次，加入20mL的 干燥吡啶和2mL的干燥三氯氧磷，緩慢加入HBTl.Slg，室溫下攪拌lh。lh后，真空 下70°C加熱蒸干，得到淺綠色固體。停止加熱待冷卻后，重新連接真空/氮氣置換三 次，再次加入批陡20mL，使潤旋，使淺綠色沉淀全部溶解，加入2. 58g2' 3' -0-isopropy guanosine(2'，3' -0-異亞丙基鳥苷），攪拌，室溫反應10h。10h后真空下70°C加熱旋 干。加入20mL蒸餾水，攪拌lh，抽濾，紅外烘干，得到固體2.05g。將所得固體經甲醇 洗三次（每次 5〇mL)得化合物 2' 3' -〇-isopropyguanosine 5'（HBT-phosphate)(白 色固體）。取該化合物500mg，溶于4.8mL醋酸和1.2mL水中，KKTC冷凝回流2h。反 應結束后，與10mL正丁醇80°C共沸真空旋干。用甲醇洗三次，每次20mL。最終得到 目標化合物 GH(白色固體）。4 NMR(400MHz, DimethylsuLfoxide_d6) δ (ppm) : δ = 10. 66 (s, 1Η), 8. 39 (d, 1H, J = 7. 64Hz), 8. 25 (s, 1H), 8. 05 (t, 2H), 7. 91 (s, 1H), 7. 75 ( d, 1H, J = 8. 2Hz), 7. 52(d, 1H, J = 7. 44Hz), 7. 43 (t, 1H, J = 6. 6Hz), 7. 40 (t, 1H, J = 7. 0Hz), 7. 20(t, 1H, J = 7. 52Hz), 6. 6 (s, 2H), 5. 72 (d, 1H, J = 6. 0Hz), 4. 53 (t, 1H, J = 5. 24Hz), 4. 0-4. 2 (m, 4H). 13C NMR (DimethylsuLfoxide-d6, 100MHz) δ (ppm) : 162. 92, 156. 87, 154. 87, 154. 61, 154. 32, 152. 08, 151. 64, 136. 15, 132. 03, 128. 98, 126. 58, 125. 31, 123. 65, 123. 25, 122. 88, 122. 21, 120. 50, 11