專利名稱：用于測定酶動力學的方法
技術領域：
本發明涉及通過被分析物催化反應形成反應產物，由此來定量測定樣品中的酶的方法和裝置。更具體地講，本發明涉及下述方法，其中將被分析酶固定在層析介質的反應位點上，并且，把用于被分析物催化反應的底物和輔因子，并且把反應產物通過層析溶劑輸送至該位點并從該點離去。
用于檢測樣品中酶的已知方法一般包括使待分析樣品與底物和輔因子混合物相接觸，而該底物與輔因子的反應由被分析酶催化。作為被分析物催化反應的結果，通過觀察反應產物的產生速率或反應物(底物或輔因子)的消耗速率可以測得樣品中的被分析物。如果將反應中某一產物的產生速率用于指示某一酶的存在時，可用目視或分光光度法測定該產物。另外，如果用目視或分光光度法均難以測得反應產物時，使之經歷一步或多步能產生易于測定反應產物的后續反應即可測定之。這類反應常常包括使染料前體材料活化的反應。如果將某一反應物的消耗速率用于指示某一酶的存在，該反應物應該是目視或分光光度法能夠測得的。通常采用的反應物是分光光度法(于340nm處)或熒光測定法(于410nm處)能夠測得的輔因子尼古丁腺嘌呤二核苷酸(nicotineadeninediuncleotide)(NADH)。在許多酶催化反應中，該輔因子被氧化為NAD+，后者并不產生特征分光光度或熒光信號。因此，許多被分析物催化反應是根據NADH的消失來跟蹤的。
例如，已知一些方法可用于檢測丙氨酸轉氨酶(ALT)，后者血濃度的增加與肝炎相關。對本發明有意義的是下述文獻Murray，“臨床化學方法(Methods in Clinical Chemistry)PP.1062-1065，Pesce and Waplan，eds.，Mosby Publishing Co.，St.Louis.MO(1987)。ALT催化L-丙氨酸與α-酮戊二酸的轉氨反應，生成丙酮酸和L-谷氨酸。按照一種廣泛采用的用于檢測ALT的方法，將L-丙氨酸和α-酮戊二酸與血清一起保溫，在精確計時后，使反應停止，新形成的丙酮酸與二硝基苯肼(DNPH)反應，形成相應的腙。然后將該反應混合物堿化，由于形成腙陰離子而產生蘭色。因丙酮酸反饋抑制ALT，比色過程呈限制性線性。按照另一方法，將NADH與乳酸脫氫酶一道摻入反應介質中。乳酸脫氫酶催化丙酮酸轉化為乳酸，同時使還原型NADH氧化為氧化型NAD+。NADH的消失可通過分光光度或熒光法跟蹤。
已知類似的方法用于檢測天門冬氨酸轉氨酶(AST)，后者的血清濃度增加與下列疾病有關急性心肌梗塞，急性胰腺炎，病毒性或中毒性肝炎和急性肝硬化。AST催化天門冬氨酸和α-酮戊二酸的氨基轉移反應，形成草酰乙酸和谷氨酸。用于檢測該酶的方法包括將受試樣品用含有天門冬氨酸，α-酮戊二酸和2，4-二硝基苯肼的溶液保溫，這樣在AST催化產生草酰乙酸的同時形成2，4-二硝基苯基-腙-衍生物，后者在520nm處有光吸收。因此，可通過顏色信號指示樣品液體中的AST，該顏色信號可用分光光度計測得或者與比色圖表比較，由此半定量地指示AST的存在。已知類似的方法，用能與草酰乙酸反應的偶氮染料代替2，4-二硝基苯腙染料的前體化合物。還有其他用于檢測AST的已知方法，其中包括在利用馬來酸脫氫酶和NADH和NAD+的反應中將草酰乙酸轉化為馬來酸。這種分析反應既可在容器(如試管和微滴定井)中進行，也可在吸收浸漬條上進行。
與本發明有關的公開文獻為美國專利3，875，014(Forgione)，該專利公開了按上述公開的反應，利用天門冬氨酸，α-酮戊二酸和重氮鹽測定血清中AST濃度的測定指示劑。該測定指示劑包括用一粘合劑使之彼此粘著的一對多孔條，上述粘合劑可選擇地滲透草酰乙酸。其中第一層條包括底物L-天門冬氨酸和α-酮戊二酸。第二層條包括干燥的重氮鹽。該指示劑與血清相接觸，如果該血清中含有AST，它就可以催化底物反應，形成草酰乙酸。然后由此形成的所有草酰乙酸都滲到第二層條上，并使之與重氮鹽的顏色反應致活。
由于酶催化反應的動力學性質，用于定量測定被分析酶的各種分析方法的精確度是有限的。這些分析方法一般是使含有未知量酶的樣品與該酶的底物相接觸，并測定在一定時間內由該反應所產生的產物量。產物量代表反應的平均速率，而該反應本身與樣品中酶量相關。事實上，在經典分析條件下，采用反應平均速率測定酶量受到了限制，因為這些反應一般沒有恒定的反應速率。在固定體積底物/輔因子溶液中進行的酶催化反應受到啟動次數和影響反應速率的濃度效應的影響。一般來講，酶催化反應的特征在于在達到“穩定態”前采用低啟動速率。在反應進行，消耗底物/輔因子組并使其濃度降低的同時，反應速率降低。當由于反應產物的蓄積而產生反饋抑制時，反應速率也應該降低。當采用改變反應條件或加入抑制劑終止被分析物催化反應時，反應終止可能不是完全瞬間，因此要將另外的測不準因素加入平均反應動力學的測定。因此，被分析物催化反應的真實穩定態反應動力學明顯不同于在有限時間內評價所指示的平均反應速率。故以測定平均反應速率為基礎測定酶濃度是相當不精確的，即穩定態反應動力學不同于平均反應速率。因此，理想的是建立一種能夠評價某一給定反應的穩定態反應動力學，尤其是在任何時間的瞬時動力學的分析方法。
本發明涉及通過測定控制量底物/輔因子組中被分析物催化反應的速率來定量測定樣品中被分析酶的方法。具體地講，通過催化底物/輔因子組的反應可測得被分析酶，該方法包括下列步驟;(a)將存在于定量待分析樣品中的被分析酶固定在層析介質上;(b)使該層析介質與含有底物/輔因子組反應的溶液相接觸，至少形成一個反應產物的該反應由被分析酶以與固有酶量相關的速率催化之，(c)將該溶液輸送至反應位點，并使底物/輔因子組在酶的存在下反應形成反應產物，(d)將該溶液和反應產物從反應位點輸送至反應位點下游的檢測區，(e)通過測定下列數據測定酶催化反應的速率，(ⅰ)底物/輔因子組的消耗速率或(ⅱ)反應產物的產生速率。反應產物的產生速率可由下述方法測得，即使產物經歷一步或多步附加反應并測定(ⅰ)在所說附加反應中反應物的消耗速率或(ⅱ)在所說附加反應中產物的產生速率。通過在檢測區的選擇位點測定反應物或產物的濃度可以測得反應物消耗或產物產生的速率。本發明方法既可用于測定穩定態也可用于測定非穩定態酶反應動力學。本發明還提供了用于實施本發明方法的工具。


圖1a和3a是兩個不同類型的本發明試驗裝置的主視圖;
圖1b和3b分別為圖1a和3a所示試驗裝置沿1b-1b和3b-3b線的剖視圖;
圖1c為圖1a所示試驗裝置與一定體積底物/輔因子溶液接觸的剖視圖;
圖2a-2d為實施本發明方法時，圖1a所示裝置在不同點即示的主視圖;
圖4是描述在本發明裝置中丙氨酸轉酶濃度和由于消耗MADH輔因子而引起的熒光減退之間的相關曲線圖。
本發明提供了用于定量測定樣品中酶的改進方法，其中通過酶催化底物/輔因子組的反應來測定酶。本發明方法避免了下述分析方法的限制，即通過在有限時間內測定被分析物催化反應的平均速率來測定被分析酶的濃度。本發明還避免了下述方法的限制，即為了得到有意義的結果，必須測定樣品與分析試劑一起保溫的時間。不是將含有被分析物的樣品與給定體積含有底物/輔因子的溶液相接觸(其中在酶催化的反應過程中反應物和產物的濃度改變)，本發明將樣品溶液中固有的酶固定在反應位點上，并連續地將含有新鮮底物/輔因子的溶液輸送至該反應位點。另外，為了使處于反應位點的產物和反應物的濃度基本保持恒定，從反應位點沿層析介質的長度輸送含反應產物和未反應底物/輔因子材料的溶液。以這種方式輸送含未反應底物/輔因子組和反應產物的溶液使得沿該長度任一點所存在的反應產物和/或底物/輔因子組濃度可指示在某一特定時間的反應速率，而該反應速率是由成鍵酶的量，酶區的幾何形狀和溶液流速決定的。
相應于本發明的實施，提供了(最好以條狀)層析介質。使定量的待分析樣品與層析介質在反應位點相接觸，并將樣品中存在的所有酶都固定在反應位點。然后使該層析介質與層析流動溶液相接觸，該層析流動溶液的PH和離子條件要經過選擇，以適于該特定的反應系統，該系統包括底場/輔因子組，在被分析酶催化的反應中消耗所說底物/輔因子組產生反應產物。沿著層析介質將包括底物/輔因子組的溶液層析輸送至反應位點，在此，在被分析酶催化的反應中消耗酶底物和輔因子，形成一個或多個反應產物。然后將這些反應產物與定量輸送到反應位點的液體中未反應的底物/輔因子組成份一道，從反應位點沿層黿櫓適淥偷交虼┕觳馇鋇絞淥屯Ｖ刮埂＜瓤稍諶薌鏈硬鬮黿櫓實牡諞歡順ナ保部梢栽誆鬮黿櫓時ズ褪保ɡ紓蔽锪系醬鋝鬮黿櫓實牡詼聳保┲罩拐庖皇淥汀 由于未反應溶液流入和反應溶液從反應位點流出是恒定的，因此，在反應位點底物、輔因子和反應產物的濃度基本上是恒定的。這樣就可以基本上避免由于酶底物和輔因子濃度變化而帶來的動力學效應造成的被分析物催化反應的反饋抑制作用。除啟動效應引起的初始速率外，在反應位點的酶催化反應速率一般是十分恒定的。在適宜的底物/輔因子過量條件下，穩定態的反應速率與被分析酶濃度直接相關。從反應位點流出的溶液中，底物，輔因子和反應產物的濃度與在該反應位點酶催化反應的速率直接相關。因此，在反應位點下游沿層析路徑的反應產物，酶底物，輔因子的濃度提供了在一定時間內在反應位點酶催化反應速率的年代記錄。因此，本發明不僅可用于測定酶的未知濃度，也可更廣泛地用于研究酶動力學。
因此，沿檢測區，在控制反應條件下測定選自反應產物，酶底物和輔因子中某一成份的濃度都可以指示樣品中被分析酶的濃度。為分析測定在底物和輔因子的穩定態反應期間所形成的產物濃度和所消耗的反應物濃度，一般應對下述三個區域作出選擇;沿檢測區的某一位點，整個區域本身或排除靠近第二端小區域的整個區域，所說小區域的產物及底物/輔因子濃度所反映出的是非穩定態反應動力學。除此之外，通過測定相應于這類反應動力學，沿檢測區各位點所存在的產物量，可以分析該反應系統的啟動或其他反應動力學。
通常被分析物催化反應產物不易被目視或分光光度法測得。在這種情況下，為了產生目視或分光光度法易測得的產物或消耗目視或分光光度法易測得的反應物，最好將一步或多步附加反應與被分析物催化反應相組合。可以將附加試劑摻入含底物/輔因子的溶液，這些試劑在組合反應中與被分析物催化反應的產物反應，消耗可測反應物或產生可測產物。組合反應是有次序的，第一反應中的一個或多個產物是第二反應中的反應物。一般用于進行一對組合反應的反應溶液應含有除第一反應的一個產物之外的用于第二反應的所有反應物。因此，當無被分析酶催化第一反應時，則不會消耗反應物或由第二反應產生的產物。理想的組合反應是在含有底物/輔因子的溶液中存在的反應物在反應位點固有的條件下，可以容易地與一個或多個被分析物催化反應之產物完全反應。此外，組合的第二反應的速率也最好不是限速的。
如果組合的附加反應在被分析物催化反應產物存在下自發進行，則第二反應可以并且應該在反應位點或其稍下的地方發生。因此，在該反應位點下游可測得該反應產生的可測產物或該反應消耗的可測反應物的濃度。
但是，也有這樣的系統，即在被分析物催化反應產物存在下，組合的附加反應不會自發進行。在這種情況下，為了使反應進行完全，必須催化該附加反應。為了利用這類組合反應系統，本發明提供了分析裝置，其中將酶或催化劑固定在第二反應位點或者最好是第一反應位點下游，在第一反應位點下游固有被分析酶。與實施本發明的這一特點相適應，將含有底物/輔因子組和該附加反應中任何反應物的溶液輸送到第一反應位點，在該位點被分析酶催化底物/輔因子組的反應，形成一個或多個反應產物。那些反應產物與未反應底物/輔因子組和用于該附加反應的反應物一道，或者在第一反應位點，或者在處于第一反應位點下游的第二反應位點，與用于該組合附加反應的催化劑相接觸。然后該催化劑催化被分析物催化反應產物的反應，另外該反應消耗目視或分光光度法可測得的反應物或產生類似的可測得產物。最好對反應條件，試劑的量和性質加以選擇，以便完全消耗掉被分析物催化反應的產物。
當被分析物催化反應產物的反應是定量并完全時，根據從第二反應位點下游輸出的可測反應物或產物的量即可確定第一反應產物的量以及由此而確定被分析酶的濃度。由于組合的附加反應速率與被分析物催化反應的速率相對應，因此通過觀察組合反應即可確定被分析物催化反應動力學并由此來確定被分析酶的濃度。
根據附圖，圖1a，1b，1c描述了用于定量測定樣品中酶的單一反應位點實驗裝置(10)，該裝置包括連接在惰性支撐條(12)上的一定長度的層析介質(11)。層析介質(11)具有第一端(13)和第二端(14)，層析輸送在(13)開始，在(14)結束。層析介質(11)包括以層析材料第一端(13)取向配置的反應位點(15)，在反應位點(15)和層析材料第二端(14)之間配置的檢測區(16)。無論對該圖還是其他圖都應注意到靠近第二端(14)的斷線表示具有這一特征的部分與反應位點(15)之間的延伸距離，這一距離可以滿足遠向反應位點(15)以上層析輸送底物/輔因子材料和反應產物。
根據使用圖1a，1b，1c所示裝置(10)的方法，將欲分析酶含量的液體樣品施于反應位點(15)。然后，使裝置(10)在其第一端(13)與容器(17)〔裝有含底物/輔因子組的溶液(18)〕內的成份相接觸，被分析酶可催化該反應。然后含有底物/輔因子的溶液沿層析介質(11)的長度穿行到達反應位點(15)，在此，被分析酶起催化底物/輔因子組反應的作用，形成一個或多個反應產物。將含有未反應底物/輔因子組和被分析物催化反應的任何產物的溶液從反應位點向層析介質的第二端(14)輸送，到達并穿過檢測區(16)。含有反應產物和底物/輔因子組的溶液層析輸送延續至該溶液前沿到達第二端(14)或延續至定量溶液耗干為止。然后通過檢測(ⅰ)底物/輔因子組或檢測(ⅱ)反應產物的濃度來評價檢測區。
圖2a-2d是圖1a所示裝置的主視圖。圖2a描述已用定量含被分析物樣品在反應位點(15)浸漬的裝置(10)。該裝置始終與含底物/輔因子組的溶液(18)相接觸，并且在第一端(13)和反應位點(15)之間隨溶劑前沿(19)不斷從層析介質(11)的第一端(13)輸送上述溶液。在圖2b中，溶劑前沿(19)已穿過反應位點(15)，并且反應位點(15)下游的溶劑含有定量的可測得反應產物，該產物是在底物/輔因子組的被分析物催化反應的啟動期期間產生的。在圖2c中，溶劑前沿(19)已向層析條的第二端推進。與此同時，在反應位點(15)發生的被分析物催化反應已經過啟動期，依據產生較多的可檢測反應產物這一事實，該反應正以穩定態速率進行。盡管從反應啟動動力學向穩定態動力學的轉化是一個逐步變化的過程，并且并不能在某一特定時間出現確切的變化，但根據(20)所示的穩定態反應前沿，仍可表示出在啟動和穩定態反應動力學之間的這一界線。在圖2d中，溶劑前沿(19)到達層析介質的第二端(14)，并且且層析輸送停止。在這一點，穩定態反應前沿(20)已越過檢測區(16)，因此，通過測定現存反應產物濃度可以評價被分析物催化反應的穩定態速率，由此評價現存被分析酶的量。
根據附圖，圖3a和3b描述了一個用于測定樣品中被分析酶濃度的雙反應位點試驗裝置(30)，該裝置包括與惰性固體支撐物(32)相連接的層析介質(31)。層析介質(31)具有第一端(33)和第二端(34)在(33)端開始層析輸送，在(34)端結束層析輸送。所說層析介質包括第一反應位點(35)和第二反應位點(36)，在(35)位點接觸含有能催化第一反應的被分析物樣品并干燥之，催化劑被固定在(36)位點，該催化劑催化第二反應中一個或多個被分析物催化反應產物的反應。層析介質(31)還包括一個檢測區(37)，在該檢測區檢測第二反應位點(36)中的反應物或所產生的反應產物。
按照使用圖3a，3b所示裝置(30)的方法，將待分析酶含量的樣品施于第一反應位點(35)。然后使該裝置(30)與裝有溶液(39)的容器(38)內的成份在該裝置的第一端(33)相接觸，溶液(39)含有底物/輔因子組，其反應由被分析酶催化，并且還包括與被分析物催化反應產物反應的試劑。然后該底物輔因子溶液沿層析介質(31)的長度穿過到達第一反應位點(35)，在該位點被分析酶催化底物/輔因子組反應，形成反應產物。將含有未消耗底物/輔因子組，被分析物催化反應的任何反應產物和用于與被分析物催化反應產物反應的任何試劑的溶液從第一反應位點輸送到第二反應位點(36)。然后，固定在第二反應位點(36)的催化劑催化分析物催化反應的第一產物的反應，產生一種或多種第二反應產物。然后，將第二反應產物與未反應底物/輔因子組和用于與被分析物催化反應產物反應的任何試劑一道，從第二反應位點(36)朝向層析介質第二端(34)，抵達并穿過檢測區(37)進行層析輸送。連續層析輸送該溶液直到溶液前沿到達第二端(34)為止，或者直到消耗完底物/輔因子溶液為止。評價檢測區(37)，以測定(ⅰ)第二反應產物的量或(ⅱ)第二反應的反應物量。
用于本發明的介質不僅包括層析介質，而且一般還包括用于輸送本發明中所采用的各種試劑和反應產物的溶劑。所謂層析介質，按照嚴格的定義，是用來按照輸送速度的差異進行材料分離的介質。適宜的層析介質包括對輸送底物，輔因子和反應產物的溶劑具有毛細作用和容量的那些物質。用于本發明的層析介質最好是條形，但也可以根據對本領域普通工作人員顯而易見的要求制成各種尺寸和形狀。眾多的各種層析材希紓河糜謚講鬮齙姆鬧錆臀薹畝囁撞牧希捎糜詒痙⒚鰲Ｌ乇鷯叛〉氖遣捎夢⒖諄蛭⒘１〔悴鬮鑫鎦剩蛭湊氈痙⒚鰨捎謎飫嗖牧峽梢愿納品治鏊俁群頭直媛省Ｆ淥室說慕櫓拾ɑЦ男圓牧希紓聰喔咝П〔悴鬮黿櫓駛蚧腔櫓省Ｕ庋牟牧咸岣吡稅湊招枰擲敕從ξ錆頭從Σ锏哪芰ΑＮ⒖紫躉宋夭牧咸乇鷙茫詈檬遣捎肨ypeSSWP(MilliporeCorp.，Bedford，Massachusetts)孔徑為3μm的微孔硝基纖維素材料。該材料最好是惰性的，一般不與任何底物，輔因子或反應產物發生化學或物理反應。
由于該裝置的層析介質最好是化學惰性的，在任何反應位點它可能必須被活化，在該反應位點最好將被分析酶或催化劑固定，使其催化組合的第二反應而又抗溶劑輸送。需要采用各種方法按照試劑具體的化學性質將試劑固定。一般來講，當介質是硝基纖維素或混合型硝基纖維素酯時，為固定酶不需要采用特殊的化學鍵合。將含有被分析酶的樣品施于層析介質。并于室溫下10至15分鐘后即可干燥。將存在于樣品中的酶固定在反應位點以抗溶劑輸送，一般應保留足夠的或主要的酶活性。如果該分析利用一對組合反應，并且要催化第二反應，必須將用于組合的第二反應的催化劑固定在第二反應位點。用于組合的第二反應的催化劑最好是酶，這樣就可以采用在第一反應位點固定被分析酶的相同方法固定該催化劑。
值得考慮的是可利用本發明普遍地定量檢測酶。被認為本發明特別適用于分析的酶包括丙氨酸轉氨酶(ALT)，天門冬氨酸轉氨酶(AST)，乳酸脫氫酶(LDH)，磷酸酶，醛縮酶，堿性磷酸酶，α-萘基丁酸酯酶，α-1胰蛋白酶，淀粉酶，血管緊張肽轉化酶，血漿銅蘭蛋白，氯乙酸酯酶，肌酸激酶，膽堿酯酶，半乳糖-1-磷酸尿苷酰轉移酶，γ-谷氨酰轉移酶，血紅蛋白(作為氧化酶)，脂酶，溶菌酶，2′，5′腺苷酸磷酸二酯酶，2′，5′-腺苷酸合成酶，5′-核苷酸酶，血管緊張素肽原酶，胰蛋白酶和許多其他的酶。按照本發明可以被分析的酶僅局限于所選擇的酶不能被固定在適宜的層析介質上，或者一旦被固定則基本上完全失去其酶活性。當將某些酶固定在第一反應位點時，它們可能在一定程度上失活，這一點并不妨礙本發明的應用，因為本領域普通工作人員有能力在評價分析結果時，對該失活作出計算。可以按照本發明方法分析的含酶樣品包括各種生物學材料，其包括但不限于血液，血清，血漿，尿，唾液，大便，眼淚，喉頭取樣(throatswabs)，傷口滲出液，汗，細胞，細胞溶胞產物，細胞上清液，細菌和細菌媒介。
根據被分析酶的特殊性質選擇對被分析酶反應敏感，并適用于本發明的各種底物/輔因子組試劑。這類反應系統一般對本領域來講是公知的，并且按照本發明方法易于施用。一般來說，按照本發明可以利用適用于慣用試管或浸漬條方法的單一和組合酶反應系統。適宜的系統包括在該系統中用于酶催化反應的底物或用于該反應的輔因子經反應得到目視或分光光度法可測得的反應產物，例如染料。另外，酶底物或被分析物催化反應的輔因子本身可以是目視或分光光度法可測的(例如，輔因子NADH)，但是，在該酶催化反應過程中要消耗該酶底物或輔因子。
按照本發明的某些實施例，如果用于酶催化反應的底物/輔因子組試劑或該反應的產物均不是目視或分光光度法易測得的，那么可以給該被分析物催化反應增加第二反應，該第二反應或者消耗易測得反應物，或者產生這樣的產物。本文引為參照文獻的1985年8月6日出版的美國專利4，533，629(Litman等)公開了許多用于在酶標記免疫分析中產生信號的酶的組合反應系統。這類組合反應系統經常利用水解或氧化-還原反應來活化染料前體。根據某些方法，將底物氧化產生過氧化氫，后者然后與染料前體反應使可測得染料致活。含有底物/輔因子組的溶液可以與其他試劑(例如，穩定劑，抑制劑等)混合。當給被分析物催化反應與第二反應組合時，含有底物/輔因子組的溶液也可以含有用于與被分析物催化反應產物反應的試劑。該試劑本身可以是可測的，并且在組合的第二反應中能夠被消耗或者可以與被分析物催化反應的產物反應，產生可測得反應產物。
實施例1按照本實施例，制作用于定量測定乳酸脫氫酶(LDH)的裝置，并且按本發明所述方法使用之。將厚度接近0.15mm，孔徑為3μm的微孔硝基纖維素材料(MilliporeSSWP)在薄膜干燥裝置中于60至65℃復蓋在聚酯薄膜和粘合劑(Mono-kote，TopFliteModels，Inc.，Chicago，IL)上。將膜和襯墊物切成長8.5cm，寬0.3cm的長條。
按照使用上述制成裝置的方法，制備LDH(Sigma，Chemi-calCo.，St.Louis，No)的各種稀釋液的溶液，在該溶液中包括0.8mg/ml小牛血清清蛋白。茲以2μl為整份的LDH溶液在距第一端1cm處的反應位點浸漬在層析條上。然后將該條的第一端浸在含有下述成份的溶液中;0.1M的磷酸緩沖液，PH7.8，丙酮酸鹽，0.2mM還原型β-尼古丁腺嘌呤二核苷酸(NADH)和1mM丙酮酸鈉。將該緩沖液源源不斷地沿著該條層析輸送直到它到達反應位點為止，事先已將LDH樣品固定在該反應位點。在此，LDH催化丙酮酸與NADH和質子的反應，形成乳酸和尼古丁腺嘌呤二核苷酸的氧化型(NAD)。將這些反應產物與溶液中的其他成份一道，從反應位點下游沿層析條層析輸送，直到溶液到達條的末端為止，并停止溶液輸送。根據在紫外(375nm)燈下觀察反應位點下游熒光消失，目視觀察結果。
實施例2按照本實施例，制作用于定量測定酶ALT的雙反應位點裝置，并按本發明所述方法使用之。在薄膜干燥裝置中，于60至65℃，將厚度接近0.15mm，孔徑為3μm的微孔硝基纖維素材料(MilliporeSSWP)復蓋在聚酯薄膜和粘合劑(Monokote，TopFliteModels，Inc.，Chicago，IL)上。將膜和襯墊物切成0.3cm寬，8.5cm長的條。將2μl整分份的乳酸脫氫酶(LDH)(SigmaChemicalCo.，St.Louis，Mo)固定在距每條第一端2cm處的第二反應位點上。
按照使用上述制作裝置的方法，配制ALT的各種稀釋液的溶液，在該溶液中含有0.8mg/ml小牛血清清蛋白(BSA)。然后通過臨床化學試劑法(A-gent，AbbotLabora-tories，NorthChicago，IL)分析該溶液的酶活性。將2μl含ALT的溶液浸漬到第一反應位點，該反應位點位于LDH浸過的位點和第一端之間，離第一端1cm處。使酶樣品在反應位點干燥10至15分鐘。
將各條的第一端浸于含下述成份的溶劑溶液中500mML-丙氨酸，0.3mM還原型β-尼古丁腺嘌呤二核苷酸(NADH)，15mMα-酮戊二酸，0.1mM吡哆醛-5-磷酸酯，100mM三(羥甲基)-氨基甲烷，30.3mM琥珀酸和2.26mM乙二胺四乙酸鈉(EDTA)。沿該條層析輸送該溶劑直到它到達第一反應位點為止，事先已將ALT樣品固定在該第一反應位點。在此ALT催化L-丙氨酸和α-酮戊二酸的反應，形成丙酮酸和L-谷氨酸。然后在溶劑不斷推進的同時，將這些反應產物與未反應酶底物，輔因子和流動緩沖液中其他成份一道，從第一反應區層析輸送至第二反應區，在第一反應區事先已固定了ALT樣品，在第二反應區事先已固定了LDH。當溶劑中的丙酮酸和其他成份接觸到固定在第二反應區的LDH時，LDH催化丙酮酸與NADH和質子的反應，形成乳酸和氧化態尼古丁腺嘌呤二檢苷酸(NAD+)。然后將第二反應的這些產物沿層析介質輸送3至4cm，直到層析輸送停止為止。通過在紫外(375nm)燈下觀察LDH反應位點下游的熒光消失，目視跟蹤NADH至NAD+的氧化。前沿前的流體不呈現熒光，而相應于啟動動力學的前沿流體出現一熒光峰，該峰降至一恒定水平(相應于穩定態動力學)，然后該水平延續至第二反應位點。
盡管目視可以觀察到該熒光，但也可以用薄層層析掃描器例如(CAMAGScamnerп，CAMAG，Muttenz，Switzerland)分光光度觀察到。該掃描器采用365nm的激發波長，并采用過濾除去低于420nm的波長來檢測。
根據前文描述，本領域普通的工作人員應該認識到本發明的許多變化和改進，使之更適于應用。因此，正如下文權利要求所述，對本發明化有這些限制。
權利要求
1.一種定量測定樣品中被分析酶的方法，其中通過酶催化底物/輔因子組的反應可以測定該酶的存在，該方法包括下列步驟(a)將存在于定量待分析樣品中的被分析酶固定在層析介質上的某一反應位點，(b)使所說層析介質與包括底物/輔因子組的溶液相接觸，該反應遼儺緯梢桓齜從Σ鋝⒂傷當環治雒復呋浞從λ俾視胨嬖諉傅牧肯喙兀 (c)將所說溶液輸送到所說反應位點并使所說底物/輔因子組在所說酶存在下反應，形成所說反應產物，(d)將所說溶液和所說反應產物從所說反應位點輸送至所說反應位點下游的檢測區，和(e)通過測定(i)底物/輔因子組的消耗速率或(ii)所說反應產物的產生速率來確定該酶催化反應的速率。
2.權利要求1所述方法，其中通過使反應產物經歷一步或多步附加反應并且通過測定(ⅰ)在一步或多步所說附加反應中反應物的消耗速率或(ⅱ)在一步或多步所說附加反應中產物的產生速率來確定所說反應產物的產生速率。
3.權利要求1或2所述方法，其中通過測定檢測區中某一選擇位點上所說成份的濃度，由此來確定選自下列成份之一的消耗或產生速率，這些成份包括(1)底物/輔因子組;(2)所說第一反應產物;(3)至少一步所說附加反應或多步附加反應中的某一反應物或(4)至少一步所說附加反應或多步附加反應中的某一產物。
4.權利要求3所述方法，其中檢測區中的選擇位點含有選擇自下列成份之一，這些成份包括(1)底物/輔因子組;(2)所說第一反應產物;(3)至少一步所說附加反應或多步附加反應中的某一反應物和(4)至少一步所說附加反應或多步附加反應中的某一產物，在被分析酶的穩定態反應期間產生上述產物。
5.權利要求2所述方法，其中通過催化劑固定在第二反應位點來催化所說一步附加反應或多步附加反應。
6.權利要求5所述方法，其中所說催化劑是一種酶。
7.權利要求3所述方法，其中通過目視或分光光度計測定選自下列成份之一的濃度，這些成份包括(1)底物/輔因子組;(2)所說第一反應產物;(3)至少一步所說附加反應或多步附加反應的某一反應物和(4)至少一步所說附加反應或多步附加反應的某一產物。
8.權利要求7所述方法，其中用目視法測定所說濃度。
9.一種用于定量測定樣品中被分析酶的工具，其中通過催化底物/輔因子組成份的反應可以測定所說酶，該工具包括(a)一種層析介質，該介質包括一個反應位點，可以將存在于所說樣品中的被分析酶固定在該位點上;和(b)一種定量的溶液，該溶液包括由所說酶催化的底物/輔因子組反應成份。
10.權利要求9所述工具，其中所說層析介質包括一個第二反應位點，催化劑固定在該位點并能催化消耗所說被分析酶催化反應產物的第二反應。
全文摘要
本發明提供了通過測定被分析物催化反應的速率進而定量測定樣品中被分析酶的方法和工具。本發明方法可用來測定穩定態和非穩定態酶反應動力學，并提供了反映該結果的物理記錄法。
文檔編號G01N30/90GK1033075SQ8810768
公開日1989年5月24日 申請日期1988年11月4日 優先權日1987年11月5日
發明者朱利安·戈登, 安德烈斯·卡普薩利斯, 理查德·E·湯普森 申請人:艾博特公司