一種堿性細菌漆酶在酵母中的高通量表達方法
【專利摘要】本發明公開了一種堿性細菌漆酶在酵母中的高通量表達方法，包括以下步驟：A、帶有堿性細菌漆酶基因的畢赤酵母表達載體構建；B、陽性轉化子的篩選；C、酵母表達載體的線性化；D、酵母電轉感受態的制備E、重組子的表達鑒定；F、融合蛋白的純化；G、酶動力學參數測定。本發明通過基于語義的模型發現來幫助建模者，更加高效、合理的完成模型的組合建模，從而解決了堿性細菌漆酶在原核表達系統中易形成包涵體及產量、酶活性低的問題。
【專利說明】一種堿性細菌漆酶在酵母中的高通量表達方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物工程【技術領域】，涉及一種堿性細菌漆酶在酵母中的高通量表達方法。
【背景技術】
[0002]漆酶(Laccase ECl.10.3.2)是一種含銅的多酚氧化酶，能催化酚類和芳香類化合物的氧化，使之生成相應的苯醌，同時伴隨電子的轉移，將分子氧還原成水。由于漆酶能夠氧化芳香類化合物和其它一些非芳香類有機物，具有廣泛的底物特異性，因此在紙漿漂白、紡織品染料脫色、有毒廢棄物的去除、生物修復、醫療診斷或作偽抗癌藥物制備的催化劑以及生物傳感器等方面具有巨大的應用潛力。漆酶不僅存在于植物中，還廣泛存在于真菌中。而最新研究表明，某些昆蟲甚至細菌也可產生具有漆酶活性的物質。近年來隨著研究的深入，真菌漆酶的工業用途日益受到人們的關注，但真菌漆酶只在酸性范圍有活性，嚴重地限制了該酶的工業應用。而細菌漆酶則在某些方面如高溫、高壓、高pH的條件下比植物漆酶和真菌漆酶更具有優勢。但目前細菌漆酶主要在原核表達系統中表達，其表達量及活性仍然較低，需要進一步提高才能滿足工業上的需要。相比較而言，酵母表達系統具有分泌表達的優勢，可進行高密度發酵，重組蛋白表達量高，因此可以利用酵母表達系統的優勢來實現細菌漆酶的高通量表達。

【發明內容】

[0003]為了克服現有技術中存在的缺陷，本發明提供一種堿性細菌漆酶在酵母中的高通量表達方法，通過基于語義的模型發現來幫助建模者，更加高效、合理的完成模型的組合建模，從而解決了堿性細菌漆酶在原核表達系統中易形成包涵體及產量、酶活性低的問題。其技術方案如下:
[0004]一種堿性細菌漆酶在酵母中的高通量表達方法，包括以下步驟:
[0005]A、堿性細菌漆酶基因的畢赤酵母表達載體構建
[0006](1)在50 μl的體系中，加入5 μ IlOX限制性內切酶反應緩沖液，并按1μ g DNA:3-5U限制性內切酶的比例加入DNA和限制性內切酶CpoI和Notl，混勻后37°C保溫2_12h，使用該方法分別用相同的限制性內切酶消化切割PPic9K質粒DNA和已擴增的細菌漆酶基因DNA，為了方便純化，在基因終止密碼子后設計一段組氨酸標簽；
[0007](2)用1%瓊脂糖凝膠電泳分離限制性內切酶消化樣品，在紫外燈下用刀片切出目的DNA片段，然后按DNA片段回收試劑盒的方法回收目的DNA片段；
[0008](3)在25 μ I的體系中，加入2.5 μ 110 X T4DNA連接酶反應緩沖液，并按1:5的比例加入限制性內切酶消化過的pPic9k質粒DNA和細菌漆酶基因DNA，再加入1 μ IT4DNA連接酶，16°C水浴4-12h將細菌漆酶基因插入ppic9K質粒上的多克隆位點形成一個重組表達質粒;
[0009]B、陽性轉化子的篩選[0010]利用常規的CaCl2法制備E.coli DHlOB感受態細胞，然后將5_10 μ I連接反應混合物與100 μ IE.coli DHlOB感受態細胞混合，冰浴30min，42°C熱休克1.5min后立即置冰上5min，加入900 μ I新鮮LB培養基后在37°C搖床上培養45min，搖床轉速為150rpm，然后將細菌涂布在含IOOyg / ml氨芐青霉素(Amp)的LB平板上，37°C培養12h，平板上長出的單個菌落即為陽性轉化子；
[0011 ] C、酵母表達載體的線性化
[0012]SalI分別酶切原始載體重組載體ppic9K_laccase, I %瓊脂糖凝膠回收含目的基因的重組線性化載體，15ulddH20-20°C保存備用；
[0013]D、酵母電轉感受態的制備
[0014]挑取單克隆GS115接種于IOmlYro液體培養基中，200rpm / min，30°C搖床培養過夜，以I %接種量轉接至100mlYro液體培養基，30°C搖床過夜OD=L 1_1.3，在41:離心5000rpm, 5min,棄上清,用100ml冰預冷無菌水重懸菌體,重復一次，在4°C離心5000rpm,5min，棄上清，用20ml冰預冷Imol / L的山梨醇重懸菌體，重復I次，山梨醇的量減為5ml，最后在4°C 6000rpm,8min離心棄上清,用400ul冰預冷Imol / L的山梨醇重懸均勻，按IOOul分裝于1.5ml預冷無菌EP管中，零度備用。
[0015]E、重組子的表達鑒定
[0016]挑取MD 平板上的轉化子接于 5ml BMGY:0.1mol / L PB pH6.0, CuSO40.4mmol /L中。，標記菌株后置于30度搖床200rpm / min過夜培養，直到OD6tltl約2.5左右時，8000rpm / min 離心 5 分鐘,去上清,每管以 5ml BMMY:0.1mol / L PB ρΗ6.0, 0.5% 甲醇，CuSO40.4mmol / L重懸，200rpm / min轉速下30度搖床誘導培養，每隔24小時補加5%的甲醇，從第36小時開始以A`BTS檢測漆酶活性，每隔12小時取IOOul菌液，12000rpm / min離心3分鐘后取其上清用于檢測漆酶活性。以選擇漆酶表達量高的酵母重組菌株，漆酶反應體系為:0.02mol / L醋酸-醋酸鈉緩沖液pH3.6，0.5mmol / L ABTS，20ul酵母表達上清，0.2mmol / L CuSO4，補充雙蒸水至lml，以轉化的負對照為本底，在420nm處測定其在3分鐘內催化底物ABTS的umol數；
[0017]F、融合蛋白的純化
[0018]將50ml上清粗酶液與IOmlNi2+離子親和層析樹脂混合，4°C緩慢搖動4_12h，然后將混合物裝柱，柱直徑2mM、柱高10mM，用10倍柱床體積的PBS* (pH7.4)緩沖溶液平衡柱子，流速控制在ImL / min至1.2mL / min,當柱中平衡溶液快接近凝膠柱界面時,封住下端出口，將結合后的填料再次上柱分別用5倍柱體積的1-4040mM Imidazole in PBS Buffer和2倍柱體積的1-45Buffer45mM Imidazole in PBS Buffer洗脫,流速為自然流出，收集洗脫液，每次洗脫時，用1.5ml Eppendorf管收集,每管收集1.5ml ;這一步用來除去與鎳非特異性結合的雜蛋白。分別用用I_250Buffer250mM Imidazole in PBS Buffer洗脫,流速為自然流出，收集洗脫液。收集方法與上相同。目的蛋白在這一步從柱上被洗脫下來，最后用1-1OOOBuffer IM Imidazole in PBS Buffer洗脫,流速為自然流出，不必收集洗脫液；因為這一部與蛋白的純化無關，通常是為了清潔鎳柱。
[0019]收集洗脫峰，目的蛋白經10% SDS-PAGE電泳鑒定，純化后的蛋白經65%硫酸銨沉淀濃縮后再用50mM磷酸緩沖液(pH7.2)透析去除殘余的硫酸銨，在實驗室搖瓶發酵條件下，從IL培養物中可獲得50-80mg純蛋白；[0020]G、酶動力學參數測定
[0021]使用漆酶底物ABTS (2，2’-聯氮基-雙(3_乙基苯丙噻唑啉_6_磺酸))和DMP (2，
6-二甲基苯)檢測，麥芽糖結合蛋白-細菌漆酶融合蛋白具有與未融合的細菌漆酶相似的酶動力學參數，以DMP為底物時，反應體系為50mM TrisHCl (pH8.0)、0.2mM CuSO4和不同濃度的DMP0.2、0.3、0.4、0.6和ImM，以ABTS為底物時，反應體系為50mM醋酸緩沖液(ρΗ3.0)、0.2mM CuSO4 和不同濃度的 ABTS0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 和 2mM,在反應體系中加Λ 1-5 μ I適量稀釋的純酶后啟動反應，用MV-2550型紫外分光光度計在37°C條件下測定477nm，用于DMP，或420nm，用于ABTS的吸收值l_3min，再根據吸收值的改變(ΛΑ)值和消光系數(ε )計算出單位時間內產物的生成量即酶反應速度(u)，DMP在477nm處的消光系數為14.Smr1CnT1, ABTS在420nm處的消光系數為36^-1 cnT1，酶活力定義為在37°C條件下每分鐘氧化Iug底物為I個酶活力單位，然后再根據Lineweaver-Burk雙倒數作圖法I /V= (Km / Vmax) *1 / [S] +1 / Vmax 求出酶動力學參數 Km、Vmax 和 Km / Vmax 值。
[0022]與現有技術相比，本發明的有益效果:
[0023]本發明實現了細菌漆酶在酵母中的穩定高效表達，利用組氨酸標簽簡化了純化步驟，易于操作，一步純化后就可得到教純的蛋白；充分利用畢赤酵母分泌表達優勢的同時還保留了細菌漆酶優良的熱穩定性。由于畢赤酵母是目前公認的食品級安全酵母，故通過該系統發酵產生的漆酶可直接用于食品中的一些應用，如果汁澄清、食品保鮮中。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]圖1是經鎳柱純化后的漆酶，如圖中的箭頭所示；
[0025]圖2是511漆酶pH的穩定性；
`[0026]圖3是DMP為底物時Lineweaver-Burk雙倒數法作圖；
[0027]圖4是ABTS為底物時Lineweaver-Burk雙倒數法作圖。
【具體實施方式】
[0028]下面結合實施例進一步說明本發明的技術方案。
[0029]利用本發明表達的一株假單胞桿菌511漆酶pH穩定性的研究表明，511漆酶pH在
6.5的穩定性最好，20h以后，依然具有90%的活性。ρΗ7.5、ρΗ8.5有很大的穩定性，處理16h依然有超過80%的相對酶活力。在弱酸和弱堿pH環境中也具有一定的穩定性，pH3.0和ρΗ9.5環境中，處理12h仍有75%的活力，處理16h以后有約60%的活力。其中ρΗ9.5處理20小時還有40%左右的相對酶活力。
[0030]以上所述，僅為本發明最佳實施方式，任何熟悉本【技術領域】的技術人員在本發明披露的技術范圍內，可顯而易見地得到的技術方案的簡單變化或等效替換均落入本發明的保護范圍內。
【權利要求】
1.一種堿性細菌漆酶在酵母中的高通量表達方法，其特征在于，包括以下步驟: A、帶有堿性細菌漆酶基因的畢赤酵母表達載體構建 (1)從一株假單胞桿菌基因組擴增得到漆酶編碼基因，命名為5111ac經測序鑒定如:SEQ ID NO:1 所示； (2)在50μ I的體系中，加入5 μ IlOX限制性內切酶反應緩沖液，并按Iyg DNA:3-5U限制性內切酶的比例加入DNA和限制性內切酶CpoI和Notl，混勻后37°C保溫2_12h，使用該方法分別用相同的限制性內切酶消化切割PPic9K質粒DNA和已擴增的細菌漆酶基因DNA，在基因終止密碼子后設計一段組氨酸標簽； (3)用1%瓊脂糖凝膠電泳分離限制性內切酶消化樣品，在紫外燈下用刀片切出目的DNA片段，然后按DNA片段回收試劑盒的方法回收目的DNA片段； (4)在25μ I的體系中，加入2.5 μ IIOXt4DNA連接酶反應緩沖液，并按1:5的比例加入限制性內切酶消化過的pPic9k質粒DNA和細菌漆酶基因DNA，再加入I μ IT4DNA連接酶，16°C水浴4-12h將細菌漆酶基因插入ppic9K質粒上的多克隆位點形成一個重組表達質粒; B、陽性轉化子的篩選 利用常規的CaCl2法制備E.coli DHlOB感受態細胞，然后將5_10 μ I連接反應混合物與IOOulE.coli DHlOB感受態細胞混合，冰浴30min，42°C熱休克1.5min后立即置冰上5min，加入900 μ I新鮮LB培養基后在37°C搖床上培養45min，搖床轉速為150rpm，然后將細菌涂布在含IOOyg / ml氨芐青霉素Amp的LB平板上，37°C培養12h，平板上長出的單個菌落即為陽性轉化子；` C、酵母表達載體的線性化 SalI分別酶切原始載體重組載體ppic9K_laccase, 1%瓊脂糖凝膠回收含目的基因的重組線性化載體，15ulddH20-20°C保存備用； D、酵母電轉感受態的制備 挑取單克隆GS115接種于IOmlYro液體培養基中，200rpm / min，30 °C搖床培養過夜，以I %接種量轉接至100mlYro液體培養基，30°C搖床過夜OD=L 1_1.3，在41:離心5000rpm, 5min,棄上清,用100ml冰預冷無菌水重懸菌體,重復I次，在4°C離心5000rpm,5min,棄上清，用20ml冰預冷Imol / L的山梨醇重懸菌體，重復I次，山梨醇的量減為5ml，最后在4°C 6000rpm,，8min離心棄上清,用400ul冰預冷Imol / L的山梨醇重懸均勻，按IOOul分裝于1.5ml預冷無菌EP管中，零度備用； E、重組子的表達鑒定 挑取MD平板上的轉化子接于5ml BMGY:0.1mol / L PB pH6.0,CuSO40.4mmol / L中，標記菌株后置于30度搖床200rpm / min過夜培養,直到OD6tltl約2.5時,8000rpm / min離心5分鐘,去上清,每管以 5ml BMMY:0.1mol / L PB ρΗ6.0，0.5% 甲醇，CuSO40.4mmol / L重懸，200rpm / min轉速下30度搖床誘導培養,每隔24小時補加5%的甲醇,從第36小時開始以ABTS檢測漆酶活性，每隔12小時取IOOul菌液，12000rpm / min離心3分鐘后取其上清用于檢測漆酶活性，以選擇漆酶表達量高的酵母重組菌株，漆酶反應體系如下:0.02mol /L醋酸-醋酸鈉緩沖液pH3.6，0.5mmol / L ABTS，20ul酵母表達上清，0.2mmol / L CuSO4,補充雙蒸水至1ml，以轉化的負對照為本底，在420nm處測定其在3分鐘內催化底物ABTS的umol 數； F、融合蛋白的純化 將50ml上清粗酶液與10mlNi2+離子親和層析樹脂混合，4°C緩慢搖動4_12h，然后將混合物裝柱，柱直徑2mM、柱高10mM，用10倍柱床體積的PBS* (pH7.4)緩沖溶液平衡柱子，流速控制在ImL / min至1.2mL / min,當柱中平衡溶液快接近凝膠柱界面時,封住下端出口，將結合后的填料再次上柱分別用5倍柱體積的1-40:40mM Imidazole in PBS Buffer和2倍柱體積的1-45Buffer:45mM Imidazole in PBS Buffer洗脫,流速為自然流出，收集洗脫液，每次洗脫時，用1.5ml Eppendorf管收集,每管收集1.5ml,這一步用來除去與鎳非特異性結合的雜蛋白，分別用用I_250Buffer:250mM Imidazole in PBS Buffer洗脫,流速為自然流出，收集洗脫液，收集方法與上相同，目的蛋白在這一步從柱上被洗脫下來，最后用1-1OOOBuffer:1M Imidazole in PBS Buffer洗脫,流速為自然流出，不必收集洗脫液，收集洗脫峰，目的蛋白經10% SDS-PAGE電泳鑒定，純化后的蛋白經65%硫酸銨沉淀濃縮后再用50mM磷酸緩沖液pH7.2透析去除殘余的硫酸銨，在實驗室搖瓶發酵條件下，從IL培養物中可獲得50-80mg純蛋白； G、酶動力學參數測定 使用漆酶底物ABTS (2，2’-聯氮基-雙(3-乙基苯丙噻唑啉-6-磺酸))和DMP (2，6-二甲基苯)檢測，麥芽糖結合蛋白-細菌漆酶融合蛋白具有與未融合的細菌漆酶相似的酶動力學參數，以DMP為底物時，反應體系為50mM TrisHCl pH8.0,0.2rnM CuSO4和不同濃度的DMP0.2、0.3、0.4、0.6和ImM,以ABTS為底物時，反應體系為50mM醋酸緩沖液ρΗ3.0、0.2mMCuSO1和不同濃度的ABTS0.2、0.4、0.6、0.8、1.0和2mM，在反應體系中加入1-5 μ I適量稀釋的純酶后啟動反應，用MV-2550型紫外分光光度計在37°C條件下測定477nm，用于DMP，或420nm，用于ABTS的吸收值l-3 min，再根據吸收值的改變ΛΑ值和消光系數ε計算出單位時間內產物的生成量即酶反應速度υ，DMP在477nm處的消光系數為14.Smr1CnT1，ABTS在420nm處的消光系數為，酶活力定義為在37°C條件下每分鐘氧化I μ g底物為I個酶活力單位，然后再根據Lineweaver-Burk雙倒數作圖法I / v= (Km / Vmax)*I / [S]+l /Vmax求出酶動力學參數Km、Vmax和Km / Vmax值。
【文檔編號】C12N15/81GK103820401SQ201310563136
【公開日】2014年5月28日 申請日期:2013年11月14日 優先權日:2013年11月14日
【發明者】李洋, 王行國, 彭夢, 王慧敏 申請人:李洋