增強免疫測定法中的結合動力學的長剛性間隔物的制作方法
【專利摘要】本發明涉及用于檢測樣品內的靶分子的裝置，其包括用于測量樣品內的靶分子的樣品容器，第一種顆粒，其中所述第一種顆粒用能夠與所述靶分子特異性結合的第一種結合分子功能化，和包含第二種結合分子的表面結構，其中所述表面結構覆蓋平坦傳感器或存在于第二種顆粒上，其中所述第一種顆粒能夠直接或間接結合表面結構的所述第二種結合分子；其中所述第一種和/或第二種結合分子經由長且剛性的接頭分子間接連接至所述第一種和/或第二種顆粒的顆粒表面和/或平坦傳感器表面；其中所述接頭分子的長度和一致性這樣選擇，以便導致所述接頭超過60nm的平均延伸長度；并且其中顆粒簇或結合顆粒的數目與樣品中存在的靶分子的量直接相關或反相關。在進一步方面，本發明涉及檢測樣品內的靶分子的存在或量的方法。本發明還描述了根據本發明的顆粒用于檢測樣品內的靶分子的用途。
【專利說明】增強免疫測定法中的結合動力學的長剛性間隔物
【技術領域】
[0001]本發明涉及用于檢測樣品內的靶分子的裝置，其包括用于測量樣品內的靶分子的樣品容器，第一種顆粒，其中所述第一種顆粒用能夠與所述靶分子特異性結合的第一種結合分子功能化，和包含第二種結合分子的表面結構，其中所述表面結構覆蓋平坦傳感器或存在于第二種顆粒上，其中所述第一種顆粒能夠直接或間接結合表面結構的所述第二種結合分子；其中所述第一種和/或第二種結合分子經由長且剛性的接頭分子間接連接至所述第一種和/或第二種顆粒的顆粒表面和/或平坦傳感器表面；其中所述接頭分子的長度和一致性這樣選擇，以便導致所述接頭超過60nm的平均延伸長度；并且其中顆粒簇或結合顆粒的數目與樣品中存在的靶分子的量直接相關或反相關。在進一步方面，本發明涉及檢測樣品內的靶分子的存在或量的方法。本發明還描述了根據本發明的顆粒用于檢測樣品內的靶分子的用途。
【背景技術】
[0002]普遍和有效的健康護理的需求使得全世界的體外診斷傾向于集成的隨時獲取(random-access)和床邊(point_of care)方案。這樣的方案的實現是迫切的:測試需要為快速、靈敏、定量且精確的。而且，進行測試的平臺必須是容易使用且緊湊的。
[0003]親和測定法利用生物分子捕獲來自樣品的特異性靶分子，并且允許測定其濃度。通常，親和捕獲通過將由捕獲分子涂布的納米顆粒或微粒分散到樣品流體內來實現(Luchini等人，2008，Nano Lett., 8 (1), 350-361)。通常的基于親和力的測定法因此用于大量應用中，例如診斷測定法，研究中的生物分子例如蛋白質、肽和核酸檢測，從而利用親和分子例如抗體，其通常特征在于針對特異性生物分子的高結合親和力。原則上，功能化磁性顆粒吸引至傳感器表面，在其中顆粒可以間接地即由于捕獲的分析物或直接結合至捕獲在表面上印刷的探針例如抗體。結合顆粒數目與樣品中存在的靶分子的量直接相關或反相關。通常，在此類生物傳感器應用中，顆粒可以使用對在表面上接近的顆粒靈敏的任何技術進行檢測，通常此類技術基于光學檢測例如散射光或受抑全內反射(FTIR)的檢測，如例如Bruls 等人，Lab Chip, 2009,9.2504-3510 中描述的。
[0004]W02008/0833A1公開了用于檢測試劑的方法、反應物和儀器。描述了基于常規直接和間接夾心測定法的用于檢測樣品中的一種或多種目的試劑的測定法形式。
[0005]US2004/110220A1公開了用于檢測核酸的方法和裝置。特別地，檢測系統主要基于具有與其連接的寡核苷酸的納米顆粒(納米顆粒-寡核苷酸綴合物)。本文描述的寡核苷酸具有與核酸序列的部分互補的部分(識別部分)，以允許與靶核酸雜交。
[0006]W02009/005552A2描述了用于樣品中的組分的多價結合和定量捕獲的方法和組合物。特別地，描述了常規夾心測定法形式的修飾，以便導致增加表觀Kd的多價“親合力”結合劑。這通過將超過一種抗體或抗原附加至“支架”來實現，所述“支架”可以是主鏈聚合物例如單鏈或雙鏈核酸例如PNA、DNA、RNA等。
[0007]US2009/148863公開了基于功能化納米顆粒的檢測平臺。特別地，納米顆粒包含適合于與生物部分結合的第一種單層組分，其依次可以適合于與分析物結合。納米顆粒表面可以進一步包含第二種單層組分，其促成第一種單層組分在表面上的暴露。納米顆粒經由第一種和第二種單層與捕獲分子例如抗體結合，所述捕獲分子允許實時單一分子檢測。
[0008]EP1441217A2描述了通過經由多種手段固定特異性結合成員(SBM)基于直接進入TIR元件或波導裝置內的光散射檢測。
[0009]US2005/0048599公開了在固定基底上的微生物檢測。結合基于夾心配置的提供且經由標簽結合組分而發生，所述標簽結合組分通過對于靶特異性的手段(例如抗體或適體)使標簽與靶結合。指示劑組分可通過檢測器檢測。
[0010]然而，現有技術的親和測定法的重要缺點是下述事實:具有靶分子與表面結合的功能化顆粒的結合仍是非常緩慢、限制速率和無效的。這種緩慢反應的一個原因尤其在于經由小(例如?IOnm)祀分子使相對大(例如?500nm)的顆粒與表面結合的困難。不均衡在圖3中簡述，舉例說明靶和顆粒的相對大小。因此，不存在顆粒-靶復合物的許多定向，其導致有效結合。盡管當與表面接觸時，顆粒可以旋轉，但結合概率仍相當小。
[0011]因此存在設計新型顆粒-靶結構的強烈需要，所述顆粒-靶結構能夠與表面例如平坦傳感器表面和/或顆粒表面有效結合。

【發明內容】

[0012]本發明解決這些需要且提供用于增強顆粒與表面的結合效率的手段。上述目的特別是通過用于檢測樣品內的靶分子的裝置來實現，所述裝置包括用于測量樣品內的靶分子的樣品容器，第一種顆粒，其中所述第一種顆粒用能夠與所述靶分子特異性結合的第一種結合分子功能化，和包含第二種結合分子的表面結構，其中所述表面結構覆蓋平坦傳感器或存在于第二種顆粒上，其中所述第一種顆粒能夠直接或間接結合表面結構的所述第二種結合分子；其中所述第一種和/或第二種結合分子經由長且剛性的接頭分子間接連接至所述第一種和/或第二種顆粒的顆粒表面和/或平坦傳感器表面；其中所述接頭分子的長度和一致性這樣選擇，以便導致所述接頭超過60nm的平均延伸長度；并且其中顆粒簇或結合顆粒的數目與樣品中存在的靶分子的量直接相關或反相關。
[0013]本發明描述了大顆粒與表面的結合概率如何可以通過使靶連接至具有某一長度的顆粒接頭分子得到顯著增加。令人驚訝的是，可以觀察到長且剛性的接頭或間隔物分子的提供克服如現有技術中使用的顆粒的結合困難，并且因此允許更有效的結合。
[0014]圖4舉例說明本發明潛在的原理。如果連接點定位進一步遠離顆粒，則其中顆粒可以與表面結合的可能定向數目強烈增加。然而，長間隔物分子的使用不一定解決問題。圖5舉例說明即使使用極長接頭，例如PEG分子，分子的柔性也寧可引起導致球狀結構的折疊，并且因此引起來自顆粒表面的捕獲分子的較小延伸。
[0015]不希望與理論結合，觀察到的增加結合效率的一種解釋是用于將結合分子定位遠離顆粒表面的長且剛性的接頭分子顯著增強使顆粒與表面結合的動力學。本申請的本發明人已認識到所得到的末端至末端距離是分子的平均延伸長度、伸直長度和剛性的函數，并且可以證實這些特征顯著促成觀察到的增強結合動力學。
[0016]在使用500nm鏈霉抗生物素蛋白涂布的納米顆粒和剛性dsDNA分子作為多種長度的接頭分子的實驗中，特別地，可以顯示結合顆粒的數目隨著dsDNA-接頭長度增加(參見圖6)。特別地，本發明人可以證實顆粒上的接頭分子長度基本上促成在傳感器表面上的結合顆粒數目。這些發現及本文詳細描述的其他發現已引起改善接頭設計的發展。因此，如本文描述的接頭體系結構負責增強的結合動力學，因此改善基于納米顆粒的親和測定法的速度、功效和精確度。
[0017]在本發明的優選實施方案中，第一種和/或第二種顆粒是磁性顆粒。
[0018]在進一步優選的實施方案中，所述第一種和/或第二種顆粒的直徑是至少約lOOnm。在進一步優選的實施方案中，如上所述的接頭的平均延伸長度是具有至少約IOOnm的直徑的顆粒直徑的至少10%。
[0019]在另外一個優選實施方案中，所述剛性接頭分子具有所述接頭分子的伸直長度的至少20%的平均延伸長度。
[0020]在本發明的另一個優選實施方案中，第一種結合分子是抗體或其片段、適體、配體或互補核酸。
[0021]在本發明的具體實施方案中，所述接頭分子的剛性和長度經由接頭的均方根末端至末端距離V <r2>進行測定，其中〈R2〉根據下式描述
[0022]<R2> = 2P1[1-(P/1) (l_e-1/P)]，
[0023]其中P是聚合物的持久(persistence)長度,并且I是接頭的伸直(contour)長度。
[0024]在本發明的優選實施方案中，接頭分子是或包含核酸分子或非生物聚合物。在特別優選的實施方案中，接頭分子可以選自雙鏈核酸分子例如dsDNA、PNA分子、PNA-DNA雙鏈體和RNA-DNA雙鏈體。
[0025]在另外一個特別優選的實施方案中，雙鏈核酸分子是dsDNA、PNA-DNA雙鏈體或RNA-DNA雙鏈體。
[0026]在本發明的最優選實施方案中，接頭分子是dsDNA。
[0027]在本發明的另一個優選實施方案中，第一種顆粒另外包含直接連接至所述顆粒的表面的排斥表面結構，其中所述排斥表面結構覆蓋顆粒的表面，以便導致顆粒的特定凈電荷和/或立體排斥，并且其中所述排斥表面結構賦予給所述顆粒朝向所述傳感器表面的推送作用。
[0028]在本發明的另外一個優選實施方案中，接頭分子長于所述排斥表面結構。
[0029]在本發明的進一步優選實施方案中，所述排斥表面結構是帶電結構。
[0030]在特別優選的實施方案中，帶電結構是或包含選自下述的分子:核酸例如雙鏈核酸，例如dsDNA、PNA、PNA-DNA雙鏈體、RNA-DNA、水凝膠和聚合物。
[0031]在本發明的進一步特別優選的實施方案中，所述排斥表面結構是立體涂層。
[0032]在本發明的另一個優選實施方案中，接頭分子和/或所述排斥表面結構無法由DNA酶和/或能夠切割雙鏈核酸分子的限制性酶切割。
[0033]在本發明的另一個優選實施方案中，接頭分子進一步包含至少一種短的柔性間隔物。
[0034]在另外一個優選實施方案中，短的柔性間隔物包含單鏈核酸。
[0035]在進一步方面，本發明涉及檢測樣品內的靶分子的存在或量的方法，其包括下述步驟:[0036](a)使樣品和連接至根據本發明的裝置中的第一種顆粒的第一種結合分子接觸；和
[0037](b)使樣品與下述接觸:
[0038]i)能夠連接至平坦表面或第二種顆粒的第二種結合分子，其中第一種結合分子和/或第二種結合分子能夠與所述靶分子特異性結合，或
[0039]ii)連接至平坦表面或第二種顆粒的靶類似物分子；其中所述靶分子能夠干擾第一種結合分子與靶類似物分子的結合；和
[0040](C)借助于第一種結合分子與第二種結合分子的結合，檢測與平坦表面或第二種顆粒結合的第一種顆粒數目，
[0041]其中顆粒簇或結合顆粒的數目與樣品中存在的靶分子的量直接相關或反相關。
[0042]在本發明的進一步優選的實施方案中，施加磁力，使顆粒與所述固體載體或彼此緊密接近，以便促進顆粒聚簇。
[0043]在本發明的進一步優選的實施方案中，所述第二種結合分子與平坦表面或第二種顆粒的連接在第二種結合分子與靶分子結合之前或之后發生。
[0044]在本發明的另一個優選的實施方案中，結合顆粒的檢測經由受抑全內反射(FTIR)或經由在表面附近的來自所述結合顆粒的散射光測量或經由簇形成的光學檢測而發生。
[0045]在進一步方面，本發明描述了如本文定義的顆粒用于檢測樣品內的靶分子的用途。
[0046]在本發明的特別優選的實施方案中，如本文上文描述的裝置、方法或用途背景下提及的靶分子是心肌肌鈣蛋白I (cTnl)、NT-proBNP或甲狀旁腺激素。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0047]圖1顯示FTIR檢測的原理。來自光源的光進入藥筒，由藥筒/流體界面反射且在檢測器上成像。如果顆粒存在于在該界面上產生的倏逝場中，則反射光強度下降。
[0048]圖2顯示使用Magnotech技術的夾心免疫測定法。在小圖(I)中，涂布有針對靶的一抗的磁性顆粒分散于樣品液體中，并且結合靶。在小圖(2)中，頂部和底部線圈以脈沖方式致動磁性顆粒，導致與傳感器表面的結合，其中二抗可以與結合的靶分子結合。在小圖
(3)中，未結合的顆粒從傳感器表面去除，并且使用倏逝場檢測結合顆粒。
[0049]圖3舉例說明夾心在傳感器表面和500nm顆粒(未完全展示)之間的IOnm革巴分子(黑色)的相對大小。左:適當定向以形成鍵的顆粒；右:未適當定向以形成鍵的顆粒。
[0050]圖4舉例說明如果連接點(由黑色小圓圈表示)由顆粒進一步延伸，則其中顆粒可以與表面結合的增加定向數目。
[0051 ] 圖5顯示比較經由PEG接頭(左)或dsDNA接頭(右)連接至表面的抗體延伸的草圖，兩種接頭均具有相同伸直長度。
[0052] 圖6描述顯示根據DNA接頭長度結合的顆粒數目的曲線圖。500nm鏈霉抗生物素蛋白涂布的顆粒與不同長度的dsDNA —起溫育。每種DNA分子含有在DNA分子的一個末端處的一個生物素部分，在分子的另一個末端處的德克薩斯紅分子。將含有顆粒和DNA的溶液注入藥筒內，并且與傳感器表面結合，使用磁吸引涂布有抗德克薩斯紅抗體。通過重復記錄在短磁性洗滌步驟后已與表面結合的顆粒數目，所述洗滌步驟從表面去除未結合顆粒，測定結合速率(以結合顆粒數目/時間單位表示)。
[0053]圖7描述顯示根據DNA接頭長度結合的顆粒數目的曲線圖。細節類似于圖6，然而，使用具有1000nm直徑的顆粒。
[0054]圖8顯示具有接頭分子的高表面密度的顆粒。盡管接頭分子是相對拉伸的，但高立體阻礙將降低接頭移動性。
[0055]圖9描述接頭表面密度對結合動力學的作用。上:測定法形式的草圖:涂布有鏈霉抗生物素蛋白的500nm顆粒(橙色)與單一靶分子結合，所述單一靶分子是在一個末端具有生物素和連接至另一個末端的德克薩斯紅分子的dsDNA鏈(藍色菱形)，其可用于與涂布有抗德克薩斯紅抗體的傳感器表面結合。隨后，不同量的相同長度的無功能dsDNA(但缺乏德克薩斯紅分子)同樣與顆粒結合，并且比較顆粒與傳感器表面結合的能力。中:使用1999bpdsDNA的顆粒裝載實驗，展示在裝載有無功能DNA后的顆粒結合的相對量，與僅具有I種功能DNA分子的顆粒相比較。下:相同曲線圖，但隨后使用497bp DNA。
[0056]圖10顯示預裝載有經由長剛性接頭連接至表面的捕獲分子的顆粒。在測定法過程中，靶分子(菱形)與顆粒結合，并且隨后與表面結合。
[0057]圖11描述預裝載有直接連接至表面的捕獲分子的顆粒。在測定法過程中，靶分子(菱形)與顆粒結合，并且第二種捕獲分子識別靶，所述靶連接至長剛性接頭。接頭的另一個末端連接至識別元件(例如生物素)，其可以與傳感器表面上的相容捕獲分子(例如鏈霉抗生物素蛋白)結合。
[0058]圖12顯示通過特異性相互作用(左)或非特異性相互作用(右)與表面結合的顆粒。
[0059]圖13顯示可能接頭的設計。
【具體實施方式】
[0060]本發明涉及用于檢測樣品內的靶分子的手段和方法。盡管本發明將就具體實施方案而言進行描述，但本說明書并不以限制含義加以解釋。
[0061]在詳細描述本發明的示例性實施方案前，給出對于理解本發明重要的定義。
[0062]如本說明書和所附權利要求中使用的，單數形式的“一個”和“一種”還包括各自的復數，除非上下文另有明確說明。
[0063]在本發明的上下文中，術語“約”和“大約”指示技術人員理解仍確保所討論的特點的技術效應的精確度間隔。該術語通常指示與所示數值±20%、優選±15%、更優選±10%、且甚至更優選±5%的偏差。
[0064]應當理解術語“包含”不是限制性的。為了本發明的目的，術語“由……組成”視為術語“由……包含”的優選實施方案。如果在下文中組定義為包含至少某一數目的實施方案，則這還意欲包含優選僅由這些實施方案組成的組。
[0065]此外，在說明書和權利要求中的術語“第一種”、“第二種”、“第三種”或“(a)”、“ (b) ”、“(C) ”、“ (d) ”等等用于區分相似元件，并且不一定描述順序或時間次序。應當理解如此使用的術語在適當情況下可互換，并且本文描述的本發明的實施方案能夠以與本文描述或舉例說明不同的其他順序操作。
[0066]在術語“第一種”、“第二種”、“第三種”或“(a) ”、“ (b) ”、“ (C) ”、“ (d) ”、等涉及方法或用途或測定法步驟的情況下，在步驟之間不存在時間或時間間隔相干性，即步驟可以同時執行，或在此類步驟之間可以存在數秒、數分鐘、數小時、數天、數周、數月或甚至數年的時間間隔，除非在本文上文或下文所述的在本申請中另有說明。
[0067]應當理解本發明并不限于本文描述的具體方法、方案、反應物等，因為這些可以改變。還應當理解本文使用的術語僅用于描述具體實施方案的目的，并且不預期限制本發明的范圍，其將僅受所附權利要求限制。除非另有定義，本文使用的所有技術和科學術語具有與本領域普通技術人員通常理解相同的含義。
[0068]如上文已闡述的，在一個方面，本發明涉及用于檢測樣品內的靶分子的裝置，其包括用于測量樣品內的靶分子的樣品容器，第一種顆粒，其中所述第一種顆粒用能夠與所述靶分子特異性結合的第一種結合分子功能化，和包含第二種結合分子的表面結構，其中所述表面結構覆蓋平坦傳感器或存在于第二種顆粒上，其中所述第一種顆粒能夠直接或間接結合表面結構的所述第二種結合分子；其中所述第一種和/或第二種結合分子經由長且剛性的接頭分子間接連接至所述第一種和/或第二種顆粒的顆粒表面和/或平坦傳感器表面；其中所述接頭分子的長度和一致性這樣選擇，以便導致所述接頭超過60nm的平均延伸長度；并且其中顆粒簇或結合顆粒的數目與樣品中存在的靶分子的量直接相關或反相關。
[0069]由本發明涵蓋的是優選使用生物傳感器系統用于檢測靶分子的合適裝置。檢測測試樣品或樣品體積中的分析物存在和/或數量的多種分析程序是本領域已知的。通常，此類檢測系統可以是光學檢測顆粒，其由合適的結合分子功能化，以便結合目的分析物。分析物的存在或數量可以由與顆粒結合的分析物數目得出結論。分析物的存在或數量還可以由顆粒簇數目得出結論。在本發明的具體實施方案中，包含如本文描述的裝置的生物傳感器系統可以能夠檢測如與如本文描述的平坦傳感器結合的單一顆粒或顆粒簇的存在，并且通過由磁場發生器生成的磁場致動顆粒。
[0070]如本文使用的“磁場發生器”通常包含用于對樣品室生成磁場的在如本文描述的光磁裝置內的一個或多個磁體，其中所述磁場應將磁性顆粒導向接觸表面。磁場通常具有非零梯度，其允許對磁性(二極)顆粒施加磁力。此類磁力磁場發生器的合適例子或包含磁力磁場發生器的合適系統將是本領域技術人員已知的。在本發明的具體實施方案中，磁場發生器可以是如fculs等人，Lab Chip, 2009,9.2504-3510中所述的磁場發生器，或包含在如Ranzoni等人，2011，Nano Lett.，11，2017 - 2022中所述的系統中或是其的部分。
[0071]通常，磁性顆粒可以通過施加磁場進行致動，從而使得可以加速分析程序。在本發明的具體實施方案中，還涵蓋由于非特異性結合的顆粒的去除，磁場的使用可以減少本底信號。圖2顯示顆粒可以如何致動以從如本文描述的平坦傳感器中有效去除非特異性結合或未結合的顆粒的一個例子。可以以脈沖方式致動的頂部和底部磁體有效去除未結合的顆粒，從而使得結合的顆粒在傳感器表面上檢測到。
[0072]如在本發明上下文中使用的磁性致動可以不同使用，即將樣品中的磁性顆粒排列成鏈，以便加速顆粒成簇。本發明還涵蓋使用磁性致動以振動且旋轉顆粒簇用于測定所形成簇的存在和量。在具體實施方案中，顆粒的磁性致動可以如脈沖的發生，即致動場由脈沖中斷至少一次。就重復脈沖而言的動態致動已發現減少非特異性相互作用且增強結合事件數目。關于使用基于顆粒簇檢測的靶分子檢測的進一步細節和參數將是本領域技術人員已知的，或可以衍生自 Ranzoni 等人，2011，Nano Lett.，11,2017 - 2022。[0073]適合用于本發明的生物傳感器系統可以包括例如包含樣品容器的生物傳感器藥筒、用于感測顆粒的傳感器裝置、檢測系統和任選的磁場發生器。在進一步的實施方案中，該系統可以包括一個或多個另外的功能單位，例如讀出系統例如屏幕或打印機、用于數據庫或計算機系統的界面、校正單元、與高流通量裝置的直接或間接連接性等。由本發明特別涵蓋的是用于快速和即時分析的手提式裝置，其中可以插入包括測定法形式的藥筒。通常，此類裝置包括優選以可充電電池形式的電源、顯示器、無線連接性例如WLAN用于快速數據庫訪問、或對實驗室信息系統的訪問。可以用于本發明的上下文中的示例性生物傳感器系統在 Bruls 等人，Lab Chip, 2009,9.2504-3510 中描述。
[0074]特別優選的是基于在表面附近和在表面上的顆粒的光學檢測的感測裝置。不限制于其，圖1中舉例說明包括光源和光檢測系統的示例性裝置。
[0075]如本文使用的“樣品”指任何樣品，其包括如本文定義的靶分子。此類樣品可以例如包括衍生自或包含下述的樣品:糞、全血、血清、血漿、淚、唾液、鼻液、痰、耳液、生殖器液、乳房液、乳、初乳、胎盤液、羊水、汗(perspirate)、滑液、腹水、腦脊髓液、膽汁、胃液、房水、玻璃體液、胃腸液、滲出液、漏出液、胸膜液、心包液、精液、上呼吸道液、腹膜液、從免疫應答部位收集的流體、從合并的收集部位收集的流體、支氣管灌洗、尿、例如來自所有合適器官(例如肺、肌肉、腦、肝、皮膚、胰腺、胃等)的活組織檢查材料、有核細胞樣品、與粘膜表面相關的流體、毛發或皮膚。另外，可以使用來自環境來源的樣品例如水樣品、肉或家禽樣品，來自潛在污染來源的樣品等。
[0076]如本文使用的術語“靶分子”指由結合分子結合的任何分子，并且可以例如是生物物質例如生物分子，優選生物標記、復合物、細胞級分或細胞。優選地，在本發明的上下文內的靶分子是核酸例如DNA或RNA分子，或者寡核苷酸例如DNA或RNA寡核苷酸。甚至更優選的是靶分子例如肽、多肽或蛋白質、蛋白質或多肽片段、或功能蛋白質或多肽結構域、藥物分子、小分子或維生素。
[0077]靶分子可以直接得自如本文上文描述的樣品。在其他情況下，可以對樣品實施例如基于標準方案的樣品制備技術，包括例如部分純化，其致使靶分子對結合配偶體即如本文定義的親和分子更可接近。例如，可以將血樣離心，以使包括全細胞或膜的級分與血清分離，可以將糞便樣品切片且用生理學可接受的緩沖液和去污劑勻漿化，可以將痰樣品液化且分級。此外，抗生素或殺菌劑可以加入樣品以防止存在的任何生物體的進一步生長。全細胞還可以去除或可以裂解以釋放其內容物。
[0078]如本文使用的“樣品容器”指由任何合適材料如玻璃、任何透明塑料或半導體制成的容器，在其中測量樣品。如本文描述的磁性顆粒可以在樣品引入時已存在于樣品容器中，連同樣品一起引入，或在樣品已注入樣品容器內之后引入。樣品容器可以進一步包括包含第二種結合分子的傳感器表面。優選地，傳感器表面位于樣品容器的底部。在具體實施方案中，樣品容器可以位于可交換藥筒內，例如在與傳感器裝置分離的單獨部件中。由于樣品的可能污染，此類藥筒可以優選是一次性使用的物品，例如通過注入塑型由塑料制成。還涵蓋的是可循環藥筒或可循環藥筒部分，例如藥筒或藥筒部分，其可以進行清潔或滅菌。
[0079]如本文使用的“平坦傳感器”限定在其上發生或檢測到實際傳感器事件的區域。通常，平坦傳感器位于樣品容器的底部。平坦傳感器可以作用于檢測結合顆粒的數目，其與樣品中存在的靶分子的量直接相關或反相關。可以用于本發明背景下的此類平坦傳感器和相應傳感器的例子在Bruls等人，2009，Lab Chip, 9, 3504-3510中提供。
[0080]如本文使用的術語“顆粒”意指物理性質例如體積或質量可以歸于其的局限性小物體。在本發明的上下文中，顆粒包含本領域技術人員已知的任何合適材料或由本領域技術人員已知的任何合適材料組成，例如顆粒可以包含無機或有機材料，或由無機或有機材料組成，或基本上由無機或有機材料組成。通常，顆粒可以包含金屬或金屬合金或有機材料，或者由金屬或金屬合金或有機材料組成，或者基本上由金屬或金屬合金或有機材料組成，或者包含碳水化合物元件，或由碳水化合物元件組成，或基本上由碳水化合物元件組成。涵蓋材料的例子包括瓊脂糖、聚苯乙烯、膠乳、聚乙烯醇、二氧化硅和鐵磁金屬、合金或復合材料。特別優選的是磁性或鐵磁金屬、合金或組合物。在本發明中有用的特別優選的顆粒是超順磁性顆粒。如本文使用的術語“超順磁性”描述磁性形式，其以小鐵磁或鐵磁納米顆粒出現。本領域已知在足夠小的納米顆粒中，磁化可以在溫度的影響下隨機翻轉方向。兩次翻轉之間的時間被稱為Ν?θ?弛豫時間。在不存在外部磁場的情況下，當用于測量納米顆粒磁化的時間比Ν?θ?弛豫時間長得多時，磁化看起來處于平均零即順磁狀態中。在此類狀態中,外部磁場能夠磁化類似于順磁的納米顆粒。然而,磁化率比順磁的那些大得多。在進一步優選的實施方案中，材料可以具有特定性質。材料可以例如是磁性或非磁性的。在其他實施方案中，材料可以是疏水或親水的。在進一步具體實施方案中，顆粒是塑料顆粒。塑料顆粒的例子包括膠乳或聚苯乙烯珠，例如通常用于純化的那些。在另外一個實施方案中，顆粒可以是細胞樣顆粒。如本文使用的術語“細胞樣顆粒”指生物學或半生物學結構，其存在于生物系統中或者具有生物系統或生物系統部分的形式和/或功能。細胞樣顆粒的優選例子是脂質體。
[0081]如本文使用的術語“脂質體”意指例如包含脂質或磷脂膜或層例如雙層的囊泡。通常，脂質體是空心結構，其可以充滿分子，例如藥物分子或藥物組合物，并且可以用于將此類分子遞送至靶部位，例如癌細胞或受感染區域等。脂質體可以優選是由磷脂構成的復合結構，并且可以含有少量其他分子，例如由天然衍生的磷脂與混合脂質鏈(如卵磷脂酰乙醇胺)組成或其他表面活性劑組成。脂質體可以在大小中從納米范圍到數十微米不等。在進一步具體實施方案中，顆粒可以包含瓊脂糖凝膠或瓊脂糖，基本上由瓊脂糖凝膠或瓊脂糖組成，或由瓊脂糖凝膠或瓊脂糖組成。
[0082]此外，顆粒就其轉運和性質而言基本上表現如同整體單元。顆粒可以相應地具有對稱、球狀、基本上球狀或球形形狀，或具有不規則、不對稱形狀或形式。
[0083] 由本發明涵蓋的顆粒大小通常范圍為50nm_50 μ m。優選的是在納米和高達幾微米的微米范圍中的顆粒。在進一步優選的實施方案中，顆粒直徑大于lOOnm。如本文使用的術語“直徑”指任何直線區段，其經過顆粒中心并且其終點在顆粒表面上。在非球形或半球形顆粒的情況下，直徑應理解為最大和最短直線區段的平均直徑，所述最大和最短直線區段經過顆粒中心并且其終點在顆粒表面上。進一步理解如本文定義的顆粒半徑是其如本文上文定義的直徑的一半。特別優選的是納米顆粒，例如具有下述直徑的顆粒:約IOOnm-1O微米，更優選 100nm-3 μ m,甚至更優選 300nm-1000nm,例如 300nm、310nm、320nm、330nm、340nm、350nm、360nm、370nm、380nm、390nm、400nm、410nm、420nm、430nm、440nm、450nm、460nm、470nm、480nm、490nm、500nm、510nm、520nm、530nm、540nm、550nm、560nm、570nm、580nm、590nm、600nm、620nm、650nm、670nm、700nm、720nm、750nm、770nm、800nm、820nm、850nm、870nm、900nm、920nm、950nm、970nm、IOOOnm或兩者之間的任何值。甚至更優選的是具有約500nm直徑的納米顆粒。
[0084]優選地，根據本發明的顆粒由第一種結合分子或第二種結合分子功能化。由本發明的具體實施方案涵蓋的還是進一步包含如本文描述的帶電結構的顆粒。
[0085]在特別優選的實施方案中，材料是磁性材料。在進一步特別優選的實施方案中，如本文上文定義的表面結構存在于其上，或根據本發明的第一種或第二種結合分子連接至其上的實體是磁性納米顆粒。
[0086]在本發明的特別優選實施方案中，材料或顆粒例如納米顆粒可以是超順磁性顆粒，其通常分散于水溶液中，并且保留小電荷，例如負或正電荷，或具有一定ζ電位以確保膠體穩定性，保持顆粒分離且避免非特異性聚簇。
[0087]由本發明涵蓋的是至少兩類顆粒，即第一種和第二種顆粒。
[0088]如本文使用的術語“第一種顆粒”指由第一種結合分子功能化的如本文描述的顆粒。第一種結合分子可以是能夠與目的靶分子特異性結合的任何分子。第一種顆粒因此充當捕獲顆粒。第一種結合分子可以經由如本文定義的長且剛性的接頭分子間接連接至表面。第一種顆粒的表面可以進一步通過另外結構例如如本文描述的帶電結構進行修飾。
[0089]如本文使用的術語“第二種顆粒”指由第二種結合分子功能化的如本文描述的顆粒。由本發明涵蓋的是第二種顆粒包括包含第二種結合分子如本文描述的表面結構。另外由本發明涵蓋的是第二種顆粒可以由于靶分子的結合而與第一種顆粒結合。第二種顆粒因此能夠經由第二種第二種結合分子的結合而結合靶分子。涵蓋的已捕獲靶分子的第一種顆粒與第二種顆粒的結合引起顆粒簇的形成，其可以如本文描述的進行檢測。顆粒簇的數目隨后與樣品中存在的靶分子的量直接相關或反相關。
[0090]如本文使用的術語“結合分子”指對于第二種分子即相互作用配偶體具有結合親和力的任何分子。在本發明的含義中的結合分子通常包含這樣的結合或捕獲部分，其能夠結合如本文定義的特定靶分子例如生物分子或生物標記，或者能夠結合含分子的靶實體，例如病毒、或細胞或細胞片段、或由組織衍生的材料。
[0091]在特別優選的實施方案中，結合分子選自適體，肽，蛋白質，寡核苷酸特別是互補核酸，和分子印跡聚合物、配體或受體，和凝集素，其中所述結合分子優選是抗體或其片段或互補核酸。
[0092]如在結合分子的上下文內使用的“適體”可以是短核酸分子，例如RNA、DNA或PNA分子或本領域技術人員已知的任何其他合適的核酸形式，能夠與如本文定義的祀分子結合，優選與如本文定義的核酸靶分子結合。此外，本發明涵蓋肽適體，即這樣的適體，其能夠與(a)包含一種或多種特定氨基酸序列的一種或多種蛋白質、一種或多種多肽或一種或多種肽特異性結合。通常，(a) 一種或多種肽適體是一種或多種可變肽環，包含例如10 - 20個氨基酸。在本發明的上下文中，在具體實施方案中，一種或多種肽適體可以在一個或兩個末端處連接至支架結構。支架結構可以是任何分子，優選蛋白質例如具有良好可溶性性質的蛋白質。合適的支架分子將是本領域技術人員已知的。待在本發明的上下文中使用的合適支架分子的例子是細菌蛋白質硫氧還蛋白-A。適體肽環可以優選插入支架分子的還原活性部位內。可替代地，葡萄球菌蛋白質A及其結構域和這些結構域的衍生物例如蛋白質Z或脂質運載蛋白可以用作本發明的上下文中的支架結構。核酸或肽適體可以根據本領域技術人員已知的任何合適方法生成，例如經由PCR或分子合成方法或酵母雙雜交方法。
[0093]“肽”由氨基酸鏈組成。如在結合分子的上下文內使用的肽可以包含2 - 35個氨基酸、氨基酸衍生物或其混合物的段，或者可替代地由2 - 35個氨基酸、氨基酸衍生物或其混合物的段組成。肽可以是線性的、分支的、環狀的或其混合物。肽親和分子還可以連接至如本文上文定義的支架結構。
[0094]“蛋白質”是由肽鍵連接的氨基酸聚合物，其可以包含一條多肽鏈或通常以生物學功能方式拼湊的超過一條多肽鏈。如在結合分子的上下文內使用的蛋白質可以包含超過約35個氨基酸、氨基酸衍生物或其混合物的段，或者可替代地超過約35個氨基酸、氨基酸衍生物或其混合物的段組成。蛋白質可以具有線性、分支、環狀形式或由這些形式的混合物組成。蛋白質結合分子還可以連接至如本文上文定義的支架結構。
[0095]如在結合分子的上下文內使用的“寡核苷酸”可以包含下述或可替代地由下述組成:約5 - 120個核苷酸的段，例如10、20、30、40、50、60、70、80、90或100個核苷酸，優選約15-60個核苷酸的段。寡核苷酸結合分子可以優選是RNA、DNA或PNA分子或其混合物。涵蓋的是其為互補核酸分子的結合分子。術語“互補核酸分子”指具有限定序列的分子，其中單鏈彼此互補。本領域已知雙鏈核酸分子的互補鏈由于堿基配對的形成，具有與彼此的強親和力。還涵蓋的是單鏈寡核苷酸序列，其連接至或整合到如本文定義的接頭分子結構內。在特別優選的實施方案中，此類合適接頭還包含核酸分子或由核酸分子組成。單鏈段能夠識別目的互補核苷酸序列，且以高親和力與目的互補核苷酸序列雜交。在此類分析中，靶分子包含與結合分子互補或幾乎互補的寡核苷酸。
[0096]如本文使用的術語“分子印跡聚合物”指這樣的聚合物，其在其后提取的分子的存在下形成，留下互補腔。通常，分子印跡聚合物顯示對于原始分子的一定化學親和力。分子印跡聚合物可以由本領域技術人員已知的任何合適的聚合單位組成。用于其生產的技術包括聚合技術例如堆積、沉淀、乳化、懸浮、分散、膠凝和多步膨脹聚合。特別優選的是分層印跡方法。
[0097]如在結合分子的上下文內使用的“抗體”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特異性結合抗原的抗原結合位點的分子。本發明的免疫球蛋白分子可以具有免疫球蛋白分子的任何類型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、種類(例如IgGl、IgG2、IgG3、lgG4、IgAl和IgA2)或亞類。本發明的抗體可以就它們識別或特異性結合的靶分子(例如本發明的多肽)的一種或多種表位或一個或多個部分而言進行描述或指定。特定表位及其與抗體的相互作用將是本領域技術人員已知的。如本文使用的術語“特異性結合”指抗體與抗原表位的免疫特異性檢測和結合。術語“特異性結合”排除非特異性結合，但不一定排除與其他抗原特別是與包含由本文抗體檢測的相同抗原表位的抗原的交叉反應性。
[0098]抗體可以是多克隆、單克隆、多特異性、人、人源化或嵌合抗體、單鏈抗體，或構成Fab片段、Fab’片段、由Fab表達文庫產生的片段、F (ab’)2、Fv、二硫鍵連接的Fv、小抗體、雙抗體、scFv、sc (Fv) 2、整體免疫球蛋白分子、小模塊免疫藥物(SMIP)、結合-結構域免疫球蛋白融合蛋白、駱駝科抗體、含Vhh抗體、抗獨特型(抗Id)抗體和上述任何的任何一種或多種表位結合片段。最優選地，抗體是本發明的人抗原結合抗體片段，并且包括Fab、Fab’和F (ab’) 2、Fv、單鏈Fvs (scFv)、sc (Fv) 2、單鏈抗體、二硫鍵連接的Fvs (sdFv)和包含VL或VH結構域的片段。
[0099]根據本發明的抗體可以來自任何動物來源包括鳥類和哺乳動物。優選地，抗體是人、鼠(例如小鼠和大鼠)、驢、猴、兔、山羊、豚鼠、駱駝、馬或雞抗體。
[0100]根據本發明的抗體可以是單特異性、雙特異性、三特異性或具有更大的多特異性。多特異性抗體可以對于靶分子的不同表位是特異性的，例如根據本發明的多肽，或可以對于兩種靶分子是特異性的，例如根據本發明的多肽以及異源表位例如異源多肽或固體載體材料。優選的是單特異性抗體。
[0101]如本文使用的術語“配體” 一般指這樣的物質，其與靶分子例如生物分子形成復合物，并且因此可以以高結合親和力與分子特異性結合。特別地，配體可以是能夠與靶蛋白質上的位點結合的信號觸發分子。配體通常與被稱為受體的結合配偶體結合。用于檢測靶分子的受體-配體結合系統是本領域已知的。通常，與受體的配體結合改變化學構象，即受體蛋白質的三維形狀。受體蛋白質的構象狀態決定受體的功能狀態。在本發明的上下文內的合適配體可以包括例如酶底物、酶抑制劑、受體激動劑和抑制劑、激活物例如DNA結合蛋白或神經遞質。
[0102]如本文使用的術語“凝集素”指能夠特異性識別且可逆地結合復雜糖綴合物的碳水化合物部分的蛋白質或糖蛋白，而不改變識別的糖基配體中的任何的共價結構。在本發明的上下文內的合適凝集素的例子包括單價凝集素如細菌和植物毒素，其能夠與細胞壁或膜中的糖部分結合。在本發明的意義內的其他合適凝集素是甘露糖結合凝集素、半乳糖/N-乙酰半乳糖胺(acetylgalactoseamine)結合凝集素、N-乙酰葡糖胺結合凝集素、N-乙酰神經氨酸結合凝集素或巖藻糖結合凝集素。
[0103]如本文使用的術語“第一種結合分子”指能夠與樣品內的靶分子特異性結合的如本文描述的結合分子。第一種結合分子可以通過任何合適方法或以本領域技術人員已知的任何合適方式，經由如本文描述的長且剛性的接頭分子連接至顆粒表面。
[0104]如本文使用的術語“連接至顆粒表面或平坦傳感器表面”指第一種結合分子或第二種結合分子與顆粒表面的共價或非共價結合或偶聯。特別地，此類偶聯可以例如是共價結合、范德華結合或層之間的靜電結合。與表面的連接可以是可逆的或可以是可終止的，例如通過改變pH、溫度、離子濃度、通過用光照明、通過酶促降解或酶促切割等。
[0105]應當理解第一種或第二種結合分子經由長且剛性的接頭分子連接至顆粒表面或平坦傳感器表面。這應意指第一種和/或第二種結合分子兩者均可以與如下文定義的長且剛性的接頭分子偶聯。本發明涵蓋在第一種顆粒和第二種顆粒之間或者在第一種顆粒和平坦傳感器表面之間提供一定距離。本領域技術人員應當立即理解為此目的，至少一種結合分子必須與長且剛性的接頭偶聯，以便提供涵蓋的平均延伸長度。例如，如果第一種結合分子與長且剛性的接頭分子偶聯，則第二種結合分子可以直接連接至第二種顆粒的表面或平坦傳感器表面。如果第二種結合分子與長且剛性的接頭一起提供，則第一種結合分子可以直接連接至第一種顆粒的表面。還可涵蓋第一種和第二種結合分子兩者均與長且剛性的接頭一起提供，以便建立有利距離。在本發明的上下文內，應當理解應避免如圖12(右圖)中所示的情況，其中第一種和第二種結合分子兩者均不與接頭結構一起提供，因為此類排列將導致僅如本文定義的最低限度平均延伸長度，其對于實現涵蓋的結合動力學中的增加將是不足夠的。[0106]在具體實施方案中，第一種結合分子經由長且剛性的接頭分子連接至顆粒表面。在進一步具體的實施方案中，第二種結合分子不經由長且剛性的接頭分子連接至顆粒表面。
[0107]在本發明的具體實施方案中，第一種和/或第二種結合分子與顆粒例如磁性顆粒或顆粒表面或平坦傳感器表面的偶聯、結合或連接可以是直接或間接結合。
[0108]如本文使用的術語“直接結合”意指第一種結合分子具有與顆粒例如磁性顆粒的直接連接，而無中間、橋接或連接物分子或官能團的存在。
[0109]如本文使用的術語“間接結合”意指結合分子不直接連接至顆粒例如磁性顆粒的表面，而是可以經由進一步的中間、橋接或連接物分子例如其他結合分子、接頭分子或帶電結構間接連接。例如，抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白衍生物、(鏈霉)抗生物素蛋白、抗生物素蛋白關聯蛋白質、抗生物素蛋白樣實體例如tamavidinl和2、bradavidin、中性抗生物素蛋白等可以用作顆粒例如磁性顆粒和包含相容結合部分例如生物素的相互作用分子之間的連接物。
[0110]在具體實施方案中，顆粒例如磁性顆粒可以涂布有抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白連接物，或者由抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白連接物覆蓋。用作連接物分子的相互作用對的進一步優選例子是生物素/抗生物素蛋白、任何抗體/抗原對例如抗FITC、FITC、抗德克薩斯紅/德克薩斯紅、抗地高辛(digoxygenin)/地高辛和如本文上文提及的核酸互補鏈。由于幾乎無限制的特定組合的高度多路化，由本發明涵蓋的特別是核酸互補鏈的使用。本領域技術人員還應當理解:由核酸序列組成或包含核酸序列的此類連接物分子可以容易地整合到接頭結構內。
[0111]根據本發明的“表面結構”可以是包含分子的任何結構或者適合于覆蓋表面例如平坦傳感器表面或顆粒表面的分子網絡。涵蓋的表面結構因此作用于已捕獲目的靶分子的第一種顆粒的識別、結合和后續檢測。
[0112]如本文使用的“平坦傳感器”限定在其上發生或檢測到實際傳感器事件的區域。通常，平坦傳感器位于樣品容器的底部。平坦傳感器可以作用于檢測結合顆粒的數目，其與樣品中存在的靶分子的量直接相關或反相關。可以用于本發明背景下的此類平坦傳感器和相應傳感器的例子在Bruls等人，2009，Lab Chip, 9, 3504-3510中提供。
[0113]如本文使用的術語“第二種結合分子”指結合分子，其包含在表面結構內，并且直接或間接連接至如本文描述的平坦傳感器表面或如本文描述的第二種顆粒的表面。第二種結合分子可以是與第一種結合分子相同類型的分子或可以是不同分子。在本發明的優選實施方案中，第一種和第二種結合分子是相同類型或種類的分子。在本發明的具體實施方案中，第二種結合分子是抗體或其片段，優選如本文上文定義的抗體。在本發明的特別優選的實施方案中，第二種結合蛋白能夠特異性識別且結合樣品內的靶分子，然而，在與由第一種結合分子識別的靶分子不同的結合位點或表位處。在進一步優選的實施方案中，第二種結合分子可以是第二種抗體，例如如本文上文定義的抗體，其識別第一種結合分子，例如第一種抗體，其可以是如本文上文定義的抗體。
[0114]如本文使用的術語“所述第一種顆粒能夠直接或間接結合表面的所述第二種結合分子”應意指由第一種結合分子功能化的第一種顆粒由于與靶分子的結合而與第二種結合分子結合。相比之下，不由如本文定義的靶分子介導的第一種顆粒與表面結構的任何其他結合視為非特異性結合。
[0115]在這個上下文中的“直接結合”因此意指充當捕獲分子的第一種結合分子識別且結合靶分子，從而形成捕獲復合物，并且其依次由表面結構的第二種結合分子結合且識別。在這點上，“間接結合”意指第一種顆粒經由一種或幾種捕獲復合物與第二種結合分子結合。還可涵蓋幾種靶分子-結合分子聚集物或復合物介導第一種顆粒與表面結構的第二種結合分子的間接結合，而結合仍視為特異性的，因為它由靶分子介導。
[0116]如本文描述的術語“接頭分子”可以是適合于提供第一種結合分子和/或第二種結合分子與表面的連接的任何結構。技術人員將知道用于使接頭分子與顆粒表面或平坦傳感器表面偶聯的手段和方法。根據本發明的進一步具體實施方案，通過提供平坦傳感器表面的表面結構與具有足夠長的平均延伸的接頭分子，可以實現如本文描述的關于增強結合動力學所需的增加的末端至末端距離。
[0117]為此目的，表面和/或接頭分子可以包含能夠使接頭與表面偶聯的錨定部分。如本文使用的“錨定部分”應理解為在如本文定義的接頭分子和表面或直接在顆粒表面上的一種或多種表面分子之間的連接物。特別有關的因此是如本文描述的任何橋接或連接物分子。例如，抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白衍生物、(鏈霉)抗生物素蛋白、抗生物素蛋白關聯蛋白質、抗生物素蛋白樣實體例如tamavidinl和2、bradavidin、中性抗生物素蛋白等可以用于錨定如本文描述的接頭分子和表面或表面結構。例如，錨定部分可以包含生物素，而表面涂布有鏈霉抗生物素蛋白或由鏈霉抗生物素蛋白功能化。用于使表面涂布有鏈霉抗生物素蛋白的手段和方法是技術人員已知的，或可以衍生自合適的教科書或文獻來源。
[0118]適合作為用于錨定的連接物分子的相互作用對的進一步優選例子是生物素/抗生物素蛋白、任何抗體/抗原對例如抗FITC、FITC、抗德克薩斯紅/德克薩斯紅、抗地高辛/地高辛、如本文上文提及的核酸互補鏈。由于幾乎無限制的特定組合的高度多路化，錨定部分還可以包含核酸互補鏈。本領域技術人員還應當理解:由核酸序列組成的此類連接物分子可以容易地整合到接頭結構內。
[0119]另外由本發明涵蓋的是包含化學基團或由化學基團組成的錨定部分，所述化學基團可以通過偶聯化學共價連接(例如交叉連接)至表面或與表面結合的分子。交叉連接是通過通常被稱為生物綴合的共價鍵化學連接兩種或更多種分子的過程。通常，交叉連接反應物(或交聯劑)是含有兩個或更多個反應末端的分子，其能夠或化學連接至蛋白質或其他分子上的特定官能團，例如蛋白質官能團，例如伯胺(-NH2)、羧基(-C00H)、巰基或羰基(-CH0)，或交聯劑反應基團例如碳化二亞胺(例如EDC)、NHS酯、亞氨酸酯、PFP S旨、羥甲基膦、馬來酰亞胺、鹵代乙酰(溴代或碘代)、吡啶基二硫化物、乙烯砜、酰肼、二氮丙啶(diazirine)、芳基疊氮化物或異氰酸酯(isocyantate)。
[0120]另外由本發明涵蓋的是接頭分子具有一定長度，以便充當間隔物分子，即提供結合分子和顆粒表面的一定距離。應當理解此類距離的提供可以提供幾個其他優點:
[0121]例如，一定距離可以導致顆粒與其他分子和彼此更少的非特異性結合。此外，通常發生的顆粒例如磁性顆粒的非特異性聚簇可以降到最低。
[0122]根據本發明的接頭分子因此可以具有連接物分子的功能和/或間隔物的功能。為此目的，這些聚合分子優選具有一定長度、強度和/或剛性，以便能夠如同聚合纖維起作用。[0123]另外由本發明涵蓋的是例如通過二聚化或更高級別的多聚化以纖維裝配的聚合物的使用。涵蓋的優點是如本文定義的剛性可以得到增加。還涵蓋的是“輔助分子”的使用，其幫助建立具有涵蓋剛性的更高級別結構，其依次導致涵蓋的接頭的平均延伸長度。一個涵蓋的例子是單鏈核酸分子，其可以裝配成二聚螺旋結構，并且其依次可以與輔助分子裝配。其他涵蓋的輔助分子的例子是能夠結合核酸例如ssDNA、dsDNA或兩者(例如DNA結合蛋白)或者ssRNA、dsRNA或兩者的蛋白質(例如RNA結合蛋白)。此類因子或蛋白質的結合可以優選由結合蛋白識別的特異性結合基序引導，所述結合基序可以存在于核酸分子例如dsDNA或ssDNA或ssRNA中。一旦此類結合因子在核酸分子上結合，接頭的剛性就可以得到增強且引起具有增加的平均延伸長度的接頭。此類接頭修飾可以在測定法之前或過程中執行。在本發明的進一步具體實施方案中，輔助分子例如RNA或DNA結合蛋白可以包含蛋白質-蛋白質相互作用結構域，例如SH3、roZ、14-3-3、SH2結構域或本領域技術人員已知的任何其他合適結構域。可以相應地提供包含相容識別結構域或相互作用結構域的次級結合因子，允許包含由輔助分子結合的核酸的復合物裝配，所述輔助分子依次可以由次級相互作用分子結合。在進一步的實施方案中，剛性接頭結構可以以聚合多肽的形式提供，例如基于膠原或膠原樣蛋白質例如Scll、Scl2、SclA或SclC的形式和/或分子同一性。這些分子可以進一步與如本文定義的其他接頭分子或官能團組合。
[0124]在本發明的進一步具體實施方案中，聚合接頭分子可以是能夠在合適條件下自裝配的聚合分子。相應地，結合分子可以與顆粒結合提供，引起聚合物在顆粒表面上的裝配。自裝配可以通過合適參數加以控制，例如聚合所需的單體或聚合單位的濃度、單體或聚合單位的橋接因子的濃度、反應環境的pH、溫度、離子的存在、輔助因子例如蛋白質的存在等。在進一步的實施方案中，自裝配的聚合物可以在此類合適條件的改變下崩解，例如通過改變pH、降低或增加因子或單體的濃度、改變溫度等。
[0125]還可涵蓋接頭分子包含如本文定義的帶電結構或由如本文定義的帶電結構組成，或者可以整合在如本文描述的立體表面結構中。
[0126]在本發明的進一步具體實施方案中，接頭分子可以是線性、環狀或分支樣分子或其混合物。
[0127]在本發明的上下文內的合適接頭分子可以是例如核酸、核糖核酸、肽、多肽、蛋白質、碳水化合物、脂質、聚乙二醇、多糖、樹枝狀聚合物、樹狀分子(dendrons)、納米管或其任何合適衍生物或組合。
[0128]如本文上文定義的核酸分子可以有利地還用作“核酸接頭分子”。這些接頭分子可以包含單鏈和/或雙鏈核酸分子，優選DNA分子，或其任何類型的衍生物。DNA可以例如以例如A-DNA、B-DNA或Z-DNA的形式，或這些形式的任何混合物。接頭分子還可以是PNA、CNA,HNA,LNA或ANA分子，或其任何混合物或組合，或與如本文定義的其他接頭分子例如與任何類型的核酸例如DNA或RNA的任何混合物或組合。
[0129]術語“PNA”涉及肽核酸，即類似于DNA或RNA的人工合成的聚合物，其用于生物學研究和醫學治療中，但未知天然存在。PNA主鏈通常由通過肽鍵連接的重復N-(2-氨乙基)_甘氨酸單位組成。多種嘌呤和嘧啶堿基通過亞甲基羰基鍵連接至主鏈。PNA —般描述為如同肽，具有在第一個(左側)位置處的N末端和在右側處的C末端。雖然DNA和RNA分別具有脫氧核糖和核糖主鏈，但PNA-主鏈由通過肽鍵連接的重復N- (2-氨乙基)-甘氨酸單位組成。本領域已知PNA寡聚物還顯示在與互補DNA結合中的更大特異性。進一步的細節可以衍生自任何合適的文獻來源或教科書，例如Nielsen PE, Egholm M(1999), AnIntroduction to Peptide Nucleic Acid, Curr.1ssues Mol.Biol.1(2):89 - 104。
[0130]術語“CNA”涉及氨基環己基乙酸核酸。此外，該術語涉及環戊烷核酸，即包含例如2’-脫氧卡巴鳥苷的核酸分子。
[0131]術語“HNA”涉及己糖醇核酸，即由標準核堿基和磷酸化的1，5_失水己糖醇主鏈構建的DNA類似物。
[0132]術語“LNA”涉及鎖核酸。通常，鎖核酸是經修飾的并因此是無法接近的RNA核苷酸。LNA核苷酸的核糖部分可以用連接2’和4’碳的額外橋進行修飾。此類橋鎖定在3’內結構構象中的核糖。被鎖定的核糖構象增強堿基堆積和主鏈的預組構。這可以顯著增加熱穩定性，即寡核苷酸的解鏈溫度。
[0133]術語“ANA”涉及阿糖核酸或其衍生物。在本發明的上下文中優選的ANA衍生物是2’ -脫氧 _2’ -氟-β -D-阿糖核苷(2’ F-ΑΝΑ)。
[0134]在本發明的特定實施方案中，核酸接頭分子可以以雙鏈或雙鏈體形式存在，即包含由鏈間的堿基配對結合的核酸分子的鏈和互補或反平行相反鏈，或核酸分子的有義或反義鏈。如本文使用的術語“有義鏈”指包含序列的分子，所述序列與信使RNA拷貝的那種相同，所述信使RNA拷貝是或可以翻譯成蛋白質。在本發明的上下文內的術語另外指包含雙鏈體核酸分子的一條鏈的分子，所述一條鏈與其互補相反鏈不相同。相應地，如本文使用的術語“反義鏈”指包含就如上定義的有義鏈而言的互補或相反鏈的分子。在進一步具體實施方案中，核酸接頭分子可以是雙鏈或雙鏈體核糖核酸分子。可替代地，核酸接頭分子可以包含單鏈核酸或單鏈核糖核酸分子。
[0135]在具體實施方案中，接頭分子是核糖核酸分子，或核糖核酸與任何其他提及的核酸分子或如本文定義的任何其他接頭分子、優選RNA分子或其任何類型的衍生物的任何混合物。RNA可以是以例如p-RNA即吡喃基-RNA的形式或結構上修飾的形式，如發夾RNA或莖環RNA。
[0136]核酸包括核糖核酸分子可以具有如本文定義的不同的堿基組成和/或長度。接頭分子的長度可以取決于下述進行制備:顆粒大小或直徑，如本文定義的帶電結構分子的存在、大小或長度，涵蓋的顆粒總體特定凈電荷(特別是因為如果用作接頭，則核酸分子可以為顆粒提供特定凈電荷)，任何涵蓋的在結合分子和顆粒表面之間的末端至末端距離，或任何涵蓋的接頭分子的柔性、剛性或穩定性。在本發明的特定實施方案中，核酸接頭分子可以是帶電或非帶電分子。如本文使用的術語“非帶電核酸接頭分子”涉及約O的分子凈電荷。
[0137]在本發明的特別優選的實施方案中，接頭分子是或包含選自下述的分子:雙鏈或dsDNA、雙鏈或 dsRNA、PNA、PNA-DNA 雙鏈體和 RNA-DNA 雙鏈體。
[0138]還由本發明的進一步優選實施方案涵蓋的一個有利方面是PNA和PNA/DNA或PNA/DNA雙鏈體無法由核酸酶或蛋白酶容易識別，使得它們對酶促降解抗性。
[0139]在本發明的進一步實施方案中，合適的核酸還可以包含具有不同堿基組成和/或長度的單鏈DNA分子，或由具有不同堿基組成和/或長度的單鏈DNA分子組成。單鏈分子可以例如包含堿基序列的重復，是完全隨機的，或衍生自自然界，或僅具有一種堿基例如AAA等、TTT等、CCC等或GGG等；或包含此類單堿基區域的段，例如僅由A和C或C和T組成。[0140]由于其形式、剛性和構象，肽、多肽或蛋白質可以是合適的接頭。肽分子接頭可以具有不同的氨基酸組成和/或長度。肽分子接頭的長度可以在約3個氨基酸至約35個氨基酸之間改變。還涵蓋的是在所示范圍內的其他長度或任何長度值。肽接頭分子可以例如具有 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35個或更多個氨基酸的長度。氨基酸組成可以在單氨基酸組成之間改變，例如天然產生的氨基酸或其任何衍生物或可合成獲得的氨基酸中的僅一種，和包含或選自所有已知氨基酸的完全隨機的氨基酸組成。還涵蓋的是包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、
13、14或15個或更多個不同氨基酸的組合物。氨基酸可以以相同氨基酸的段存在或以模式或基序的形式提供，或是隨機分布的。
[0141]在具體實施方案中，肽分子接頭分子的長度可以取決于下述進行制備:顆粒大小或直徑，如本文定義的帶電結構分子的存在、大小或長度，涵蓋的顆粒總體特定凈電荷(特別是因為如果用作接頭，則肽分子可以為顆粒提供特定凈電荷)，任何涵蓋的在結合分子和顆粒表面之間的末端至末端距離，或任何涵蓋的接頭分子的柔性、剛性或穩定性。在本發明的特定實施方案中，肽接頭分子可以是帶電或非帶電分子。如本文使用的術語“非帶電肽接頭分子”涉及約O的分子凈電荷。
[0142]蛋白質或多肽接頭分子可以具有不同的氨基酸組成和/或長度。蛋白質或多肽分子的長度可以在約35個氨基酸至約500個氨基酸或更多之間改變。還涵蓋的是在所示范圍內的其他長度或任何長度值。肽分子可以例如具有35、40、50、60、70、80、90、100、120、130、140、150、200、250、300、350、400、450 或 500 個氨基酸或更多的長度。
[0143]在具體實施方案中，蛋白質或多肽分子接頭分子的長度可以取決于下述進行制備:顆粒大小或直徑，如本文上文定義的帶電結構分子的存在、大小或長度，涵蓋的顆粒總體特定凈電荷(特別是因為如果用作接頭，則蛋白質或多肽分子可以為顆粒提供特定凈電荷)，任何涵蓋的在結合分子和顆粒表面之間的末端至末端距離，或任何涵蓋的接頭分子的柔性、剛性或穩定性。在本發明的特定實施方案中，多肽或蛋白質接頭分子可以是帶電或非帶電分子。如本文使用的術語“非帶電多肽或蛋白質分子”涉及約O的分子凈電荷。
[0144]由于其形式、剛性和構象，“碳水化合物分子”可以是合適的接頭。此類碳水化合物可以具有不同的組成和/或長度。分子的長度可以在約5個C原子至約100個C原子或更多之間改變。還涵蓋的是在所示范圍內的其他長度或任何長度值。碳水化合物分子可以例如具有 5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95 或 100個C原子或所示值之間的任何其他數目的C原子的長度。
[0145]在具體實施方案中，碳水化合物接頭分子的長度可以取決于下述進行制備:顆粒大小或直徑，如本文定義的帶電結構分子的存在、大小或長度，涵蓋的顆粒總體特定凈電荷(特別是因為如果用作接頭，則碳水化合物分子可以為顆粒提供特定凈電荷)，任何涵蓋的在結合分子和顆粒表面之間的末端至末端距離，或任何涵蓋的接頭分子的柔性、剛性或穩定性。在本發明的特定實施方案中，碳水化合物接頭分子可以是帶電或非帶電分子。如本文使用的術語“非帶電碳水化合物分子”涉及約O的分子凈電荷。
[0146]由于其形式、剛性和構象，“脂質”可以是合適的接頭分子。脂質構成廣泛的天然存在的分子組，包括但不限于脂肪、蠟、苯乙烯、脂溶性微生物(例如維生素A、D、E和K)、甘油單酯、甘油二酯、磷脂。此類脂質通常由脂質尾和首基構建。合適脂質的例子包括磷脂，例如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰膽堿、卵磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰乙醇胺。特別優選的是磷脂MPPC、DPPC, DPPE-PEG2000或Liss Rhod PE0脂質可以具有不同的組成和/或長度。分子的長度可以在約5個C原子至約100個C原子或更多之間改變。還涵蓋的是在所示范圍內的其他長度或任何長度值。脂質分子可以例如具有約5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、
40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100個C原子或所示值之間的任何其他數目的C原子的長度。
[0147]在具體實施方案中，脂質接頭分子的長度可以取決于下述進行制備:顆粒大小或直徑，如本文定義的帶電結構分子的存在、大小或長度，涵蓋的顆粒總體特定凈電荷(特別是因為如果用作接頭，則脂質分子可以為顆粒提供特定凈電荷)，任何涵蓋的在結合分子和顆粒表面之間的末端至末端距離，或任何涵蓋的接頭分子的柔性、剛性或穩定性。在本發明的特定實施方案中，脂質間隔物分子可以是帶電或非帶電分子。如本文使用的術語“非帶電脂質分子”涉及約O的分子凈電荷。
[0148]在進一步優選的實施方案中，接頭結構還可以包含非生物聚合物或由非生物聚合物組成。如本文使用的術語“非生物聚合物”指這樣的聚合物，其并非來自生物來源(生物聚合體)且是化學合成的。為此目的的合適聚合物已在本領域中得到描述(例如由Ratner，B.D.；Hoffman, A.S.；Schoen, F.J.；Lemons, J.E., Biomaterials Science,第 2 版；編輯；Elsevier:London, 2004)。合適的非生物聚合物的例子是生物可降解的聚合物例如聚(乙醇酸)(PGA)或聚(乳酸)(PLA)、聚(己內酯)(PCL)、聚(N-乙烯-2-吡咯烷酮)(PVP)、聚二噁烷酮(PDS)、或聚(乙二醇)(PEG)或其衍生自兩個(或更多個)單體種類的共聚物也稱為雜聚物。如本文使用的術語“嵌段聚合物”指包含由共價鍵連接的兩個或更多個均聚物亞基的共聚物。具有兩個或三個不同嵌段的嵌段共聚物分別被稱為二嵌段共聚物和三嵌段共聚物。優選的嵌段共聚物包括但不限于聚(丙交酯共乙交酯)共聚物(PLGA)、聚(環氧乙烷)-聚(環氧丙烷)(PEP-PPO)、聚(環氧乙烷)_聚(環氧丙烷)聚(環氧乙烷)(ΡΕΡ-ΡΡ0-ΡΕ0)、聚(環氧乙烷)-嵌段聚(L-丙交酯)(PEG-PLLA)、聚(環氧乙烷)-嵌段聚(己交酯)(PEG-PCL)、聚(乙二醇)-嵌段-聚(α -羥酸)(PEG-PHA)或普流尼克Ρ-105。
[0149]由于其形式、潛在剛性和構象，聚乙二醇分子可以特別用作本發明的上下文中的“聚乙二醇接頭分子”。由本發明涵蓋的聚乙二醇可以具有不同組成和/或長度。優選的聚乙二醇(PEG)變體包括多分散或單分散的PEG分子。特別優選的是單分散的PEG。PEG可以進一步是分支的，例如具有源自中央核心基團的3-10條PGE鏈，是具有源自中央核心基團的10-100條PGE鏈的星形PEG，或是具有移植至不同聚合物或線性PEG主鏈的多重PEG鏈的梳狀PEG。根據PEG的平均分子量，涵蓋的PEG可以是PEG10，000、PEG12, 000、PEG15, 000、PEG20, 000或具有更高分子量的PEG。特別優選的是大于PEG10，000的PEG。
[0150]更小的PEG 分子例如 PEG400、PEG600、PEG800、PEG1000、PEG1500、PEG2000、PEG3350、PEG4000、PEG6000或PEG8000也可以用作接頭結構的部分，例如與如本文定義的一種或多種接頭分子組合。
[0151]在具體實施方案中，聚乙二醇接頭分子的長度可以取決于下述進行制備:顆粒大小或直徑，如本文定義的帶電結構分子的存在、大小或長度，或涵蓋的顆粒總體特定凈電荷(特別是如果使用攜帶電荷的聚乙二醇分子衍生物)，或任何涵蓋的在結合分子和顆粒表面之間的末端至末端距離，或任何涵蓋的接頭分子的柔性、剛性或穩定性。在本發明的特定實施方案中，聚乙二醇接頭分子，特別是其衍生物或其修飾形式，可以是帶電或非帶電分子。如本文使用的術語“非帶電聚乙二醇分子”涉及約O的分子凈電荷。
[0152]“樹枝狀聚合物”或“樹枝狀聚合物接頭分子”可以是任何重復分支、大致球形的大分子。此類樹枝狀聚合物可以具有不同組成和/或長度、和/或支化度。長度可以取決于下述進行制備:涵蓋的總體特定凈電荷，涵蓋的在結合分子和顆粒表面之間的末端至末端距離，涵蓋的接頭分子的柔性、剛性或穩定性，和/或涵蓋的帶電分子數目/顆粒。如由本發明涵蓋的樹枝狀聚合物可以包含低分子量或高分子量種類。根據本發明的樹枝狀聚合物優選是非帶電的，即分子顯示凈電荷O。
[0153]另外由本發明涵蓋的是根據本發明的樹枝狀聚合物作為接頭的部分的使用。為此目的，在特定實施方案中，樹枝狀聚合物可以包含在分子表面上的官能團，例如親水基團，或可替代地具有內部功能性。如為了本發明的目涵蓋的樹枝狀聚合物可以是第1、2、3、4或更高代的樹枝狀聚合物。優選的樹枝狀聚合物包括例如newkome樹枝狀聚合物或arbolol、和聚酰胺胺(PAMAM)。本領域技術人員應當理解樹枝狀聚合物引起可以有利地用于在顆粒表面或平坦表面上提供大體積和立體表面結構的結構，其中如本文上文描述的接頭分子是此類結構的部分或嵌入其中。待在本發明的上下文內使用的進一步變體以及合成方法等將是技術人員已知的，或可以衍生自合適文件，例如〃Dendrimers and other dendriticpolymers", Frechet 和 Tomalia, J.Wiley。
[0154]“樹狀分子”或“樹狀分子接頭分子”應理解為含有單一可化學尋址的樹枝狀聚合物基團，即如本文上文定義的樹枝狀聚合物的焦點。根據本發明的樹狀分子優選是非帶電的，即分子顯示凈電荷O。在本發明的特定實施方案中，樹狀分子可以用作如本文定義的接頭的部分。
[0155]如本文使用的術語“納米管”指碳納米管，即具有圓柱狀納米結構的碳同素異形體。此類納米管可以是單壁納米管或多壁納米管。本發明還涵蓋不同類型、形式和復雜性的富勒烯結構家族的接頭分子，例如球形或橢圓形巴克球(buckyball)形式、巴克球富勒烯、或納米管與巴克球的組合等。根據本發明的納米管或本領域技術人員已知的其他接頭合適的接頭分子優選是非帶電的，即分子顯示凈電荷O。
[0156]根據本發明的接頭分子優選具有一定長度和一致性，以便能夠增加顆粒與表面的結合概率，以導致改善的結合動力學。在現有技術中，接頭或間隔物僅考慮用于結合分子與表面的連接和在結合分子的可接近性方面。然而，先前未描述尤其就來自顆粒的最大延伸而言的接頭長度。由本發明涵蓋的因此是提供具有一定長度的合適接頭分子，其適合于延伸如本文定義的結合分子的連接點進一步遠離顆粒表面或平坦傳感器表面。如圖4中可見的，涵蓋的方法打開增加數目的其中顆粒可以與表面結合的定向。
[0157]另外由本發明涵蓋的因此是如本文定義的顆粒，其中捕獲或結合分子經由具有如本文定義的一定平均延伸長度的接頭分子連接至顆粒表面。在本發明的具體例子中，長且剛性的dsDNA分子作為接頭的使用導致結合分子從表面的顯著平均延伸。涵蓋的方法導致顆粒與如本文定義的平坦傳感器或顆粒表面的結合動力學的顯著增強。如由圖6和7可衍生的，可以證實結合顆粒的數目是接頭長度的函數。在這些例子中，500nm和IOOOnm鏈霉抗生物素蛋白涂布的顆粒與不同長度的dsDNA接頭一起溫育。每種dsDNA接頭分子含有在一個末端處的一個生物素分子和在另一個末端處的德克薩斯紅分子，并且平坦傳感器編碼涂布有抗德克薩斯紅抗體。根據圖6和7的曲線圖顯示隨著dsDNA接頭分子的長度(bp)增加而增加的結合顆粒數目。對于500nm顆粒大于700bp的最佳長度對應于超過240nm的伸直長度和超過140nm的平均延伸長度。如圖7中可見的，最佳接頭長度是lOOObp，對應于對于更大顆粒(例如1000nm) 340nm的伸直長度和約170nm的平均延伸長度。最佳接頭長度因此取決于顆粒大小，并且在本發明的特定實施方案中，可以適合于顆粒大小或顆粒直徑，例如基于本文下文實施例部分中所述的實驗結果。
[0158]如本文使用的，術語“平均延伸長度”定義為接頭的均方根末端至末端距離V〈R2〉，其可以根據蠕蟲狀鏈模型描述為:
[0159]<R2> = 2P1[1 - (P/1) (l-e_1/P)],
[0160]其中P是聚合物的持久長度，并且I是接頭的伸直長度。
[0161]如本文使用的術語“伸直長度”指作為在最大物理可能延伸處的長度的聚合物鏈的伸直長度。
[0162]幾種生物學重要的聚合物可以有效地建模為蠕蟲狀鏈，包括雙鏈DNA和RNA、非結構化RNA和非結構化多肽。Kratky-Porod螺蟲狀鏈模型適合于建模半柔性聚合物，以便估計末端至末端距離和持久長度。然而，技術人員知道例如如下文描述的眾多其他理論模型，以估計末端至末端距離和持久長度。
[0163]如本文使用的術語“持久長度，P”指定量聚合物或串的剛度或剛性的基礎機械性質，并且定義為超過其在切線方向中的相互關系不成立時的長度。在化學中，它還可以定義為在無限長鏈中的鍵i上所有鍵j≥i的投影平均總和(Flory，Paul J.(1969)，Statistical Mechanics of Chain Molecules,New York:Interscience Publishers)。當角度Θ在對位置0(零)的聚合物切線的向量和遠離位置O距離L處的切向量之間時，角度余弦的期望值隨著距離指數下降，
[0164]〈cos Θ > = e ^(L/P)
[0165]其中P是持久長度，并且尖括號指示在所有起始位置上的平均值。柔性聚合物例如PEG可以使用Flory模型(隨機游動)進行描述。
[0166]持久長度還可以使用彎曲剛度Bs、楊氏模量E和聚合物鏈的截面進行定義，如Mofrad, M.R.K, "Cytoskeletal mechanics:models and measurements"，Cambridge UnivPress, 2006中描述的。
[0167]
【權利要求】
1.一種用于檢測樣品內的靶分子的裝置，其包括: (a)用于測量樣品內的靶分子的樣品容器， (b)第一種顆粒，其中所述第一種顆粒用能夠與所述靶分子特異性結合的第一種結合分子功能化，和 (C)包含第二種結合分子的表面結構，其中所述表面結構覆蓋平坦傳感器或存在于第二種顆粒上， 其中所述第一種顆粒能夠直接或間接結合表面結構的所述第二種結合分子；其中所述第一種和/或第二種結合分子經由長且剛性的接頭分子間接連接至所述第一種和/或第二種顆粒的顆粒表面和/或所述平坦傳感器表面；其中所述接頭分子的長度和一致性這樣選擇，以便導致所述接頭超過60nm的平均延伸長度；并且其中所述顆粒簇或結合顆粒的數目與所述樣品中存在的靶分子的量直接相關或反相關。
2.權利要求1的裝置，其中所述第一種和/或第二種顆粒是磁性顆粒。
3.權利要求1或2的裝置，其中所述第一種和/或第二種顆粒的直徑是至少約lOOnm，并且其中所述平均延伸長度是所述直徑的至少10%。
4.權利要求1- 3中任一項的裝置，其中剛性的接頭分子具有所述接頭分子的伸直長度的至少20%的平均延伸長度。
5.權利要求1- 4中任一項的裝置，其中所述第一種結合分子是抗體或其片段、適體、配體或互補核酸。
6.權利要求1- 5中任一項的裝置，其中所述接頭分子是或包含核酸分子或非生物聚合物，優選地所述接頭分子是或包含選自下述的分子:雙鏈核酸分子例如dsDNA、PNA分子、PNA-DNA雙鏈體和RNA-DNA雙鏈體。
7.權利要求1- 6中任一項的裝置，其中所述第一種顆粒另外包含直接連接至所述顆粒的表面的排斥表面結構，其中所述排斥表面結構覆蓋所述顆粒的表面，以便導致所述顆粒的特定凈電荷和/或立體排斥，并且其中所述排斥表面結構賦予給所述顆粒朝向所述傳感器表面的推送作用，其中優選地所述接頭分子長于所述排斥表面結構。
8.權利要求7的裝置，其中所述排斥表面結構是帶電結構，優選包含選自下述的分子:核酸分子，例如dsDNA、PNA、PNA-DNA雙鏈體、RNA-DNA雙鏈體、水凝膠和聚合物；或立體涂層。
9.權利要求7或8的裝置，其中所述接頭分子和/或所述排斥表面結構無法由DNA酶和/或能夠切割雙鏈核酸分子的限制性酶切割。
10.權利要求1- 9中任一項的裝置，其中所述接頭分子進一步包含至少一種短的柔性間隔物，優選包含單鏈核酸的短的柔性間隔物。
11.檢測樣品內的靶分子的存在或量的方法，其包括下述步驟: (a)使所述樣品和連接至根據權利要求1- 10的裝置中的第一種顆粒的第一種結合分子接觸，和 (b)使所述樣品與下述接觸: i)能夠連接至平坦表面或第二種顆粒的第二種結合分子，其中所述第一種結合分子和/或所述第二種結合分子能夠與所述靶分子特異性結合，和任選地 ?)連接至所述平坦表面或所述第二種顆粒的靶類似物分子；其中所述靶分子能夠干擾所述第一種結合分子與所述靶類似物分子的結合；和 (C)檢測與所述平坦表面或所述第二種顆粒結合的所述第一種顆粒數目， 其中所述顆粒簇或結合顆粒的數目與所述樣品中存在的靶分子的量直接相關或反相關。
12.權利要求11的方法，其中施加磁力，使所述顆粒緊密接近所述固體載體，或彼此緊密接近，以便促進所述顆粒聚簇。
13.權利要求11或12的方法，其中所述第二種結合分子與所述平坦表面或所述第二種顆粒的連接在所述第二種結合分子與所述靶分子結合之前或之后發生。
14.如權利要求1- 10中任一項中限定的顆粒用于檢測樣品內的靶分子的用途。
15.權利要求1- 10中任一項的裝置、權利要求11 - 13中任一項的方法或權利要求14的用途，其中所述靶分子是心肌 肌鈣蛋白I (cTnl)、NT-proBNP或甲狀旁腺激素。
【文檔編號】G01N33/553GK103946686SQ201280056479
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2012年11月13日 優先權日:2011年11月16日
【發明者】T·H·埃弗斯, M·科特斯 申請人:皇家飛利浦有限公司