專利名稱：酶促化學發光底物、其合成方法及酶促化學發光底物系統的制作方法
技術領域：
本發明屬于免疫診斷技術領域，特別涉及一種適用于過氧化物酶(辣根過氧化物酶HRP)或HRP標記的抗原抗體配合物痕量檢測的酶促化學發光底物、其合成方法及酶促化學發光底物系統。
背景技術：
20世紀70年代中期Arakawe首次報道用發光信號進行分析檢測，即利用發光的化學反應(chemiluminescence，CL)和生物反應(bioluminescence，BL)分析超微量物質，特別是用于臨床免疫分析中檢驗超微量活性物質。化學發光免疫分析(chemiluminescence immunoassay，CLIA)因靈敏度高(attomole即10-18mol)、快速、簡便、測試中不使用有害、試劑，成為非放射性免疫分析法中最有前途的方法之一。
化學發光指化學反應引起的發光現象，發光原理是在一個反應體系中的A、B兩種物質，通過化學反應生成一種激發態的產物(C*)，在其回到基態的過程中，釋放出的能量轉變成光子(能量hγ)，從而產生發光現象。其反應式為，(h是普朗克常數，γ為發射光子的頻率)。
化學發光反應的首要條件是反應體系必須提供足夠的激發能，其活化焓(ΔH)應介于170～300kJ/mol之間，才能在可見光區域觀察到化學發光現象；化學發光反應的第二個條件是吸收了化學能后處于激發態的分子必須以光子的形式將能量釋放出來，或者將能量轉移至另一個分子，使該分子被激發，當被激發的分子回到基態時，將以光子的形式釋放能量。
目前，酶促化學發光檢測主要有兩大體系。一是堿性磷酸酶(alkalinephospharase，AP)催化的AMPPD(金剛烷衍生物)發光；一是辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)催化的魯米諾(Luminol)及其衍生物發光。由于AP較難獲得高純度制品，價格比HRP高約20倍；部分正常組織含有AP，某些病理情況下血中AP增加，也會對測定產生影響。并且AP催化AMPPD的發光反應是水解反應，發光強度較低，起光較慢，但是具有較長的平臺期。目前AP所催化的底物技術仍處于專利的保護期。而HRP價廉易得，比活性可高達4500U/mg，HRP常用于生物分子、激素、腫瘤標志物的標記，約有60％的ELISA檢測采用。并且HRP催化Luminol的發光反應是氧化-還原反應，該反應發光強度比AP系統有所提高，起光也較迅速，但缺點是該反應為閃光型化學發光，發光信號易衰減，一般發光在5分鐘后迅速下降，30分鐘后信號全部消失，直接影響其在檢測中的應用。

發明內容
本發明目的在于提供一種發光信號強、持續時間長、常溫保存期長的酶促化學發光底物、其合成方法及酶促化學發光底物系統。
為大上述目的，本發明采用如下技術方案酶促化學發光底物，其特征在于，其通式如下 其中，R1為鹵素，R2為含有3-8個C原子的烷基羧酸鹽、烷基磺酸鹽或者烷基銨鹽。
R1為F、Cl、Br、I，R2為-(CH2)3SO3-Na+、-(CH2)N+(CH3)Br-、-(CH2)4SO3-Na+、-(CH2)3CO2H、-CH2CH(CH3)CH2SO3-Na+、-CH2CH(CH3)CH2N(CH3)3+Cl-。
酶促化學發光底物合成方法，以鄰二甲苯為原料，依次經過硝基化、鹵化，然后在酸性條件下加入高錳酸鉀氧化，生成含有鹵素和硝基的鄰苯二甲酸，再在苯環上引入烷基磺酸鹽，生成物與肼及次硫酸鹽反應制得高效發光劑。
酶促化學發光底物系統，由A、B兩組成分組成，A組主要由酶促化學發光底物、增強劑、氨基酸組成，B組主要由氨基酸氧化酶和穩定劑組成，酶促化學發光底物通式為
其中，R1為鹵素，R2為含有3-8個C原子的烷基羧酸鹽、烷基磺酸鹽或者烷基銨鹽。
R1為F、Cl、Br、I，R2為-(CH2)3SO3-Na+、-(CH2)N+(CH3)Br-、-(CH2)4SO3-Na+、-(CH2)3CO2H、-CH2CH(CH3)CH2SO3-Na+、-CH2CH(CH3)CH2N(CH3)3+Cl-。
增強劑為羥基香豆素、沒食子酸或其衍生物，氨基酸為酪氨酸或色氨酸，穩定劑為亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉或維生素C。
酶促化學發光底物中R1＝-Cl，R2＝-(CH2)3SO3-Na+，濃度為0.2-8.0mM；增強劑為羥基香豆素或/和沒食子酸，濃度分別為0.1-10mM、0.05-4.5mM；氧化劑為氨基酸和氨基酸氧化酶，濃度分別為2-40mM、5-100mM。
A組還含有PH9.4的緩沖劑，B組還含有表面活性劑和PH6.5的緩沖劑。
本發明酶促化學發光底物在苯環上引入長鏈烷基磺酸鹽類，大大降低了氧化還原反應的活化能，起光迅速，在2分鐘內達到發光平臺，同時發光劑的穩定性大大增強，且易溶于水，易于配制。與化學修飾前，發光的量子效率提高了數倍。氧化劑由氨基酸及氨基酸氧化酶提供，并分別配制于A，B液中。當A，B二者混合后，產生均速的H2O2。適當調整二者的濃度，在一定的時間范圍內，H2O2的產生速率可保持不變，這就使化學發光反應速率也保持穩定，故平臺期大大延長(約120分鐘)，這在臨床應用中具有獨特的優勢。在HRP的催化下，底物系統發生氧化還原反應，產生光子。在B組成分中還加入了穩定劑如抗氧劑亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉或維生素C，可有效延長發光液的保存期(長達12個月)。
對本發明進行的相對發光光子數測定試驗如下化學發光儀選自AUTHOS公司的LUCY3系列化學發光儀；HRP購自SIGMA公司，RZ＞3.0；所用酶促化學發光檢測試劑盒均為自產。
由于該復合增強劑的加入，使發光信號大大增強。與市售某國產發光底物相比結果如下(同時用500pg SA-HRP加入100UL底物液做實驗)相對發光光子數(RLU)本發明配制工作液 1246.53市售國產化學發光液120.25本發明的發光值為1246.53，某國產化學發光液的相對發光值為120.25，相對發光值增加了10.36倍。
同時在發光系統中還加入了非離子表面活性劑如吐溫-20及金屬螯合物如DTPA、EDTA或EDTP等，可降低發光液的本底噪音。以空白酶標板孔做兩種發光劑的背景信號相對發光光子數(RLU)本發明配制工作液8.63市售國產化學發光液 23.56兩種發光液的背景噪音相比，下降了3倍。
利用本高效穩定化學發光底物系統測定(TSH)試驗如下應用雙抗體夾心法檢測血清中TSH含量。TSH由α亞基和β亞基組成。
試驗步驟1、包被將純化的抗-α亞基的單克隆抗體包被于微孔板上，制成固相抗體。用0.1mol/L碳酸鹽緩沖液將抗體稀釋到5ug/ml，取100UL加入不透光板式微孔中，4度過夜。次日用0.01mol/LPH7.4PBS洗滌三次，加入150UL的封閉液(0.01mol/LPH7.4PBS+3％BSA+5％蔗糖)，4度過夜。次日甩干，干燥備用。
2、用辣根過氧化物酶標記抗-β亞基的單克隆抗體。
3、測定往包被板的微孔中加入TSH(標準品或待測樣品)及酶標抗體，在37℃條件下，溫育60分鐘；特異性地形成“固相抗體-抗原-酶標抗體”復合物，洗去未結合的酶標抗體。
4、每孔加混合后的底物100μl，室溫反應5分鐘。
5、化學發光檢測儀檢測發光強度。
本次實驗測量結果(TSH)標準品的濃度及相應的發光值如下表

對標準濃度及發光值分別取對數后作線性回歸圖，得標準品濃度與相應發光值間的相關系數R2＝0.9993，由于使用本發明底物系統，檢測線性范圍大大提升。利用本發明化學發光底物系統最低檢測限可達0.15μlU/ml，線性范圍可達0.10～100μlU/ml。
利用本高效穩定化學發光底物系統測定定量檢測孕酮(Progesterone)試驗如下應用競爭性固相酶免疫測定技術檢測血清中的孕酮含量。病人標本中的孕酮與酶標孕酮競爭結合包被板上固定和有限的抗體位點。
測定過程中，在微孔板各孔中分別加入標準品或血清樣品后，再加入孕酮抗體和酶標孕酮混勻溫育，則標準品或血清樣品中所含的孕酮與酶標孕酮競爭結合固相抗體，形成固相抗體—抗原或固相抗體—酶標抗原復合物，洗滌除去未結合的抗原和酶標抗原后，加入化學發光底物，其發光強度與血清中的孕酮含量成反比。測定每孔發光值，以系列標準品的發光值為縱坐標(Y軸)，以標準品的濃度值為橫坐標(X軸)作圖，即得到標準曲線。血清樣品中孕酮含量可相應從該標準曲線上查得。
操作步驟(用同一批試劑對比某市售底物與本發明中的底物作對比)1、取出兩條包被條重復做實驗。每孔分別加入10μl標準品或血清樣品。(標準品為6個，濃度分別為0，0.5，1，2.5，10，20ng/ml)2、每孔分別加入抗體溶液50μl。
3、每孔分別加入酶結合物50μl。
4、在微量振蕩器上振蕩30秒使其混合均勻。
5、貼封膜后，在室溫條件(18～25℃)溫育60分鐘。
6、甩去孔內混合物，用工作濃度洗液洗滌微孔5次。每次沖洗后將水分甩盡，最后在吸水紙上拍干。切勿擦拭反應孔內壁。
7、每孔加入混合后的底物50μl，室溫(18-25℃)反應5分鐘。
8、使用化學發光儀檢測各孔發光值。
從實驗結果不難看出，本發明發光底物系統對低值的分辨力大大增強，靈敏度也進一步提高。
本次實驗數據(孕酮P)標準品濃度及檢測發光值如下表

從實驗結果看，本發明所用的底物的發光值超過市售發光值3倍，對低值的分辨力明顯大增強，故靈敏度有了很大提高。


圖1為試驗1所得樣品標準濃度與發光值線性回歸圖；圖2為試驗1所得樣品標準濃度與發光值線性回歸圖；具體實施方式
實施例、酶促化學發光底物系統由A、B兩組成分組成，其中A液中酶促化學發光底物為
其中，R1＝-Cl，R2＝-(CH2)3SO3-Na+，濃度為0.15mM；羥基香豆素濃度為0.59mM；沒食子酸濃度為0.35m；色氨酸濃度為1.5mM；Tris-Hcl緩沖液濃度為0.2M；PH＝9.4。B液中氨基酸氧化酶濃度為0.85mM；吐溫-20濃度為0.8％(V/V)；DTPA濃度為0.5mM；維生素C濃度為0.12mM；乙酸-乙酸鹽緩沖液濃度為0.2M；；PH＝6.5。
權利要求
1.酶促化學發光底物，其特征在于，其通式如下 其中，R1為鹵素，R2為含有3-8個C原子的烷基羧酸鹽、烷基磺酸鹽或者烷基銨鹽。
2.如權利要求1所述的發光底物，其特征在于，R1為F、Cl、Br、I，R2為-(CH2)3SO3-Na+、-(CH2)N+(CH3)Br-、-(CH2)4SO3-Na+、-(CH2)3CO2H、-CH2CH(CH3)CH2SO3-Na+、-CH2CH(CH3)CH2N(CH3)3+Cl-。
3.酶促化學發光底物合成方法，其特征在于，以鄰二甲苯為原料，依次經過硝基化、鹵化，然后在酸性條件下加入高錳酸鉀氧化，生成含有鹵素和硝基的鄰苯二甲酸，再在苯環上引入烷基磺酸鹽，生成物與肼及次硫酸鹽反應制得高效發光劑。
4.酶促化學發光底物系統，其特征在于，由A、B兩組成分組成，A組主要由酶促化學發光底物、增強劑、氨基酸組成，B組主要由氨基酸氧化酶和穩定劑組成，酶促化學發光底物通式為 其中，R1為鹵素，R2為含有3-8個C原子的烷基羧酸鹽、烷基磺酸鹽或者烷基銨鹽。
5.如權利要求4所述的系統，其特征在于，R1為F、Cl、Br、I，R2為-(CH2)3SO3-Na+、-(CH2)N+(CH3)Br-、-(CH2)4SO3-Na+、-(CH2)3CO2H、-CH2CH(CH3)CH2SO3-Na+、-CH2CH(CH3)CH2N(CH3)3+Cl-。
6.如權利要求4或5所述的系統，其特征在于，增強劑為羥基香豆素、沒食子酸或其衍生物，氨基酸為酪氨酸或色氨酸，穩定劑為亞硫酸鈉、亞硫酸氫鈉、焦亞硫酸鈉或維生素C。
7.如權利要求6所述的系統，其特征在于，酶促化學發光底物中R1＝-Cl，R2＝-(CH2)3SO3-Na+；增強劑為羥基香豆素或/和沒食子酸，濃度分別為0.1-10mM、0.05-4.5mM；氧化劑為氨基酸和氨基酸氧化酶，濃度分別為2-40mM、5-100mM。
8.如權利要求7所述的系統，其特征在于，A組還含有PH9.4的緩沖劑，B組還含有表面活性劑和PH6.5的緩沖劑。
全文摘要
酶促化學發光底物其合成方法及酶促化學發光底物系統，屬于免疫診斷技術領域。酶促化學發光底物系統由A、B兩組成分組成，A組主要由酶促化學發光底物、增強劑、氨基酸組成，B組主要由氨基酸氧化酶和穩定劑組成，酶促化學發光底物通式為右式，其中，R
文檔編號G01N21/76GK1880957SQ20051001768
公開日2006年12月20日 申請日期2005年6月14日 優先權日2005年6月14日
發明者付光宇, 馬建軍, 李桂林, 李彬, 吳學煒, 楊增利, 秦耘, 苗蘭芳, 苗擁軍 申請人:鄭州安圖綠科生物工程有限公司