一種蟾酥藥材中蟾蜍甾二烯類成分指紋圖譜的檢測方法及其應用的制作方法
【專利摘要】本發明提供一種蟾酥藥材中蟾蜍甾二烯類成分指紋圖譜的檢測方法，包括主要步驟為：供試品溶液及對照品溶液的制備、測定并獲得供試品溶液和對照品溶液的液相色譜圖，經與對照品溶液的液相色譜圖比較后，得到供試品溶液中5種蟾蜍甾二烯類成分的指紋圖譜。本發明還進一步提供了上述指紋圖譜檢測方法在蟾酥藥材中5種蟾蜍甾二烯類成分含量測定中的應用。本發明通過對蟾蜍甾二烯類成分的指紋圖譜和含量分析，可以反映蟾酥藥材的內在質量，為蟾酥藥材判斷真偽、評價優劣、考察穩定性和一致性提供依據，為蟾酥的臨床用藥提供參考。同時，本發明中所建立的檢測方法快速準確，靈敏度高，可作為蟾酥質量定性定量控制和應用的可靠手段。
【專利說明】一種蟾酥藥材中蟾蜍留二烯類成分指紋圖譜的檢測方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及中藥成分分析檢測【技術領域】，具體涉及一種蟾酥藥材中蟾蜍留二烯類成分指紋圖譜的檢測方法及其應用。
【背景技術】
[0002]2010版《中國藥典(一部)》收載蟾酥作為蟾蜍科動物中華大蟾蜍Bufo bufogar gar i z an s Cantor或黑眶蟾蜍Bufo melanostictus Schneider的耳后腺及皮膚腺分泌的白色漿液經加工干燥后制得的藥材。其性狀呈扁圓形團塊狀或片狀，團塊狀者質堅，不易折斷，斷面呈棕褐色，角質狀，微有光澤；片狀者質脆，易碎，斷面紅棕色，半透明。蟾酥味初甜而后有持久的麻辣感，粉末嗅之作嚏。具有解毒，止痛，開竅醒神的功效，主治癰疽疔瘡，咽喉腫痛，中暑神昏，腹痛吐瀉等疾病，具有非常良好的療效。
[0003]蟾酥中化學成分復雜，含有大量的蟾蜍毒素類化合物，具有顯著地強心活性，化學結構屬于留體類化合物，其母核C17側鏈為六元不飽和內酯環，也稱為蟾蜍留二烯類物化合物。目前，《中國藥典(一部)》收載蟾酥中蟾蜍留二烯類成分的試管顯色反應鑒別和TLC鑒別法，同時，《中國藥典》已收載蟾酥的含量測定方法，以華蟾酥毒基和脂蟾毒配基為含量測定指標性成分，但并未收載蟾酥中其它蟾蜍留二烯類成分的檢測和定量方法，其前處理及HPLC的檢測條件亟待摸索。
[0004]中藥指紋圖譜技術作為一種多組分復雜樣品的有效質量控制方法，能夠反映出待測樣品的整體性和特征性，在中藥的藥材鑒別、生產工藝、質量控制等方面應用廣泛。目前，對于蟾酥的研究多為含量測定方法的研究，并沒有關于采用指紋圖譜對蟾酥中蟾蜍留二烯類成分進行定性的系統性研究。
[0005]目前，現有檢測方法對于蟾酥中蟾蜍留二烯類多種成分一次樣品制備后，并不能一次進樣全面分析。同時，經查閱文獻，現有文獻報道的用于測定蟾酥中蟾蜍留二烯類成分的HPLC方法中多使用乙腈-緩沖鹽系統或甲醇-緩沖鹽系統作為流動相。其中，復雜緩沖鹽系統會使色譜柱使用壽命降低以及溶液配制時的繁瑣耗時。
[0006]因此，有必要采用優化的色譜條件及供試品制備方法，建立了蟾酥中蟾蜍留二烯類成分的指紋圖譜，同時建立了基于指紋圖譜的多成分含量測定方法，以一次樣品制備、一次進樣分析，同時完成定性和定量分析，使指紋圖譜在蟾酥的質量控制中更具意義。

【發明內容】

[0007]鑒于以上所述現有技術的缺點，本發明的目的在于提供一種蟾酥藥材中蟾蜍甾二烯類成分指紋圖譜的檢測方法及其應用，采用優化條件的高效液相色譜方法建立了蟾蜍甾二烯類成分中5種主要活性成分(日蟾毒它靈、蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基)的指紋圖譜，并且同時一次對這5種主要成分進行定量分析。本發明中方法通過指紋圖譜和多成分含量測定可以比較全面的反映蟾酥藥材中蟾蜍留二烯類成分的主要活性成分，進而反映蟾酥藥材的內在質量，為蟾酥藥材判斷真偽、評價優劣、考察穩定性和一致性提供依據。
[0008]為實現上述目的，本發明首先提供一種蟾酥藥材中蟾蜍留二烯類成分指紋圖譜的檢測方法，包括以下步驟:
[0009]較佳的，所述蟾酥藥材中蟾蜍留二烯類成分為日蟾毒它靈、蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基。
[0010]I)供試品溶液的制備:稱取蟾酥細粉，加入甲醇，稱重，超聲提取，冷卻后，再稱重，用甲醇補足失重，搖勻，過濾，取續濾液作為供試品溶液；
[0011]較佳的，所述步驟I)中，超聲提取所加入的甲醇為蟾酥細粉的100?200倍量。優選的，所述超聲提取所加入的甲醇為蟾酥細粉的100倍量。
[0012]具體的，所述超聲提取所加入的甲醇為蟾酥細粉的100?200倍量是指，甲醇加入體積量為所述蟾酥細粉含量的100?200倍，即每0.1g的蟾酥細粉中加入甲醇10?20ml。優選的，當所述蟾酥細粉的含量為0.1g時，所述甲醇的加入量為10ml。
[0013]所述蟾酥細粉和甲醇稱取時，應當精密稱取。
[0014]所述甲醇為100%純甲醇。
[0015]較佳的，所述超聲提取時間為20?45min。優選的，所述超聲提取時間為30min。
[0016]所述過濾是指:取搖勻后溶液的上清液過濾膜，放棄初濾液后，即得續濾液。
[0017]2)對照品溶液的制備:分別精密稱取日蟾毒它靈、蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基對照品適量，加甲醇溶解并定容，搖勻，得到混合對照品溶液；
[0018]較佳的，所述對照品溶液中日蟾毒它靈的CAS號為465-11-2 ;蟾毒它靈的CAS號為471-95-4 ;蟾毒靈的CAS號為465-21-4 ;華蟾酥毒基的CAS號為470-37-1 ;脂蟾毒配基的 CAS 號為 465-39-4。
[0019]較佳的，所述對照品溶液中各成分的含量范圍為:日蟾毒它靈151.2?226.8 μ g、蟾毒它靈225.6?451.2 μ g、蟾毒靈171.6?343.2 μ g、華蟾酥毒基460.0?9200.0 μ g、脂蟾毒配基394.4?788.8 μ g。
[0020]優選的，所述對照品溶液中各成分的含量范圍為:日蟾毒它靈151.2yg、蟾毒它靈225.6 μ g、蟾毒靈171.6 μ g、華蟾酥毒基460.0 μ g、脂蟾毒配基394.4 μ g。
[0021]3)測定:采用相同色譜條件的高效液相色譜法分別測定供試品溶液和對照品溶液，將獲得的供試品溶液的液相色譜圖，與對照品溶液的液相色譜圖進行比較，根據相對保留時間，指認出5個共有特征峰，確認供試品溶液中5種蟾蜍留二烯類成分的特征峰，從而獲得供試品溶液中5種蟾蜍留二烯類成分的指紋圖譜。
[0022]較佳的,如步驟3)所述高效液相色譜法的色譜條件為:色譜柱:Agilent ZorbaxSB-C18 (250mmX4.6mm，5 μ m);柱溫:25 ?30°C，優選 25°C ;檢測波長:296nm ;流速:0.8 ?1.0ml/min,優選0.8ml/min ;進樣量:1?20 μ I,優選10 μ I ;流動相:乙腈-0.5ν/ν%甲酸水溶液，其中，A相為乙腈，B相為0.5ν/ν%甲酸水溶液；分析時間:60min ;梯度洗脫。
[0023]進一步的，所述梯度洗脫以流動相A相:B相體積比為20:50-80:50梯度變化洗脫。
[0024]優選的，所述梯度洗脫的具體程序為:
[0025]O ?20min, A 相:B 相體積比為 20:80_30:70 ；[0026]20 ?25min, A 相:B 相體積比為 30:70-35:65 ；
[0027]25 ?40min, A 相:B 相體積比為 35:65-40:60 ；
[0028]40 ?50min, A 相:B 相體積比為 40:60_50:50 ；
[0029]50 ?60min, A 相:B 相體積比為 50:50。
[0030]本發明的一種蟾酥藥材中蟾蜍甾二烯類成分指紋圖譜的檢測方法在蟾酥藥材中5種蟾蜍留二烯類成分含量測定中的應用。
[0031]一種蟾酥藥材中5種蟾蜍留二烯類成分含量的測定方法，包括以下步驟:
[0032]A)供試品溶液的制備:與蟾酥藥材中蟾蜍留二烯類成分指紋圖譜的檢測方法的步驟I)相同；
[0033]B)對照品溶液的制備:與蟾酥藥材中蟾蜍留二烯類成分指紋圖譜的檢測方法的步驟2)相同;
[0034]C)測定:采用高效液相色譜法在相同色譜條件下分別測定供試品溶液和對照品溶液，并采用外標法計算供試品溶液中5種蟾蜍留二烯類成分的含量。
[0035]較佳的，如步驟C)所述高效液相色譜法的色譜條件為:色譜柱:Agilent ZorbaxSB-C18 (250mmX4.6mm，5 μ m);柱溫:25 ?30°C，優選 25°C ;檢測波長:296nm ;流速:0.8 ?1.0ml/min,優選0.8ml/min ;進樣量:1?20 μ I,優選10 μ I ;流動相:乙腈-0.5ν/ν%甲酸水溶液，其中，A相為乙腈，B相為0.5V/V%甲酸水溶液；分析時間:60min ;梯度洗脫。
[0036]進一步的，所述梯度洗脫以流動相A相:B相體積比為20:50-80:50梯度變化洗脫。
[0037]優選的，所述梯度洗脫的具體程序為:
[0038]O ?20min, A 相:B 相體積比為 20:80_30:70 ；
[0039]20 ?25min, A 相:B 相體積比為 30:70_35:65 ；
[0040]25 ?40min, A 相:B 相體積比為 35:65-40:60 ；
[0041]40 ?50min, A 相:B 相體積比為 40:60_50:50 ；
[0042]50 ?60min, A 相:B 相體積比為 50:50。
[0043]較佳的，所述外標法是指:分別移取一系列不同體積的步驟B)所述混合對照品溶液，采用高效液相色譜儀進樣分析，獲得混合對照品溶液中蟾蜍留二烯類5種主要活性成分含量與峰面積的線性關系，以每一種活性成分色譜峰面積對應其相應的含量(μ g)，繪制相應的標準工作曲線，計算得到各標準工作曲線的回歸方程。再將供試品溶液采用高效液相色譜儀檢測，將獲得的供試品溶液中5種蟾蜍留二烯類成分的色譜峰面積，分別代入所述各標準工作曲線的回歸方程中，可得到相應蟾蜍留二烯類成分的含量。
[0044]優選的，所述混合對照品溶液的移取體積為1μ 1、2μ 1、4μ 1、8μ 1、10μ 1、15μ 1、20 μ I。
[0045]如上所述，本發明的一種蟾酥藥材中蟾蜍留二烯類成分指紋圖譜的檢測方法及其應用，采用優化反應條件的高效液相方法建立了蟾酥中蟾蜍留二烯類成分的指紋圖譜，同時此方法又可以對5種蟾蜍留二烯類主要活性成分進行定量分析，可以實現一次樣品制備、一次進樣分析，同時完成定性和定量分析。其中，為了簡化流動相的配制和保護色譜柱，在不影響分離的前提下，我們試驗得到了理想的流動相系統:乙腈-0.5v/v%甲酸水系統，這種流動相系統在梯度洗脫條件下能使被分離化合物保持較好的分離度和峰形。本發明通過對蟾蜍留二烯類指紋圖譜和多成分定量分析，可以比較全面的反映蟾酥藥材的化學組成成分，并且定量分析結果中5種蟾蜍留烯類成分的回歸方程的相關系數R2均大于0.99995，測定方法的精密度、重復性、穩定性良好。本發明的定性定量分析方法進而能夠反映蟾酥藥材的內在質量，為蟾酥藥材判斷真偽、評價優劣、考察穩定性和一致性提供依據。而且，本發明中所建立的檢測方法快速準確，靈敏度高，可作為蟾酥質量控制和應用的可靠手段，并為蟾酥的臨床用藥提供參考。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0046]圖1顯示為本發明的不同提取方法比較液相色譜圖1A、1B、1C
[0047]圖2顯示為本發明的不同提取溶劑比較液相色譜圖2A、2B、2C、2D
[0048]圖3顯示為本發明的不同溶劑體積比較液相色譜圖3A、3B、3C，其中，1:日蟾毒它靈；11:未知JI1:膽毒它靈;IV:膽毒靈；V:華膽醉毒基；V1:脂膽毒配基
[0049]圖4顯示為本發明的不同色譜柱比較液相色譜圖4A、4B、4C、4D
[0050]圖5顯示為本發明的不同流速、柱溫比較液相色譜圖5A、5B、5C
[0051]圖6顯示為本發明的蟾蜍留二烯類中5種成分的指紋圖譜及混合對照品液相色譜圖6A、6B,其中，I:日膽毒它靈、5:膽毒它靈、8:膽毒靈、9:華膽醉毒基、10:脂膽毒配基
[0052]圖7顯示為本發明的蟾蜍甾二烯類中日蟾毒它靈的回歸方程和線性范圍示意圖
[0053]圖8顯示為本發明的蟾蜍甾二烯類中蟾毒它靈的回歸方程和線性范圍示意圖
[0054]圖9顯示為本發明的蟾蜍甾二烯類中蟾毒靈的回歸方程和線性范圍示意圖
[0055]圖10顯示為本發明的蟾蜍甾二烯類中華蟾酥毒基的回歸方程和線性范圍示意圖
[0056]圖11顯示為本發明的蟾蜍甾二烯類中脂蟾毒配基的回歸方程和線性范圍示意圖
【具體實施方式】
[0057]下面結合具體實施例進一步闡述本發明，應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的保護范圍。
[0058]以下實施例使用的材料、試劑和儀器如下:
[0059]蟾酥(上海華宇藥業有限公司);甲醇、乙醇、甲酸(分析純，上海豪申化學試劑有限公司)；乙腈(色譜純，TEDIA公司)；日蟾毒它靈、蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、脂蟾毒配基(供含量測定用，中國藥品生物制品檢定所)；具塞錐形瓶、移液管及其相關玻璃器皿(上海禾汽玻璃有限公司);色譜柱:Agilent Zorbax SB-C18 (250mmX 4.6mm, 5 μ m)、AllitmaC18>KromasiI C18、Waters Symmetry C18 (安捷倫科技有限公司);SB_5200超聲萃取儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；Agilentl260液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)。
[0060]實施例1蟾酥藥材中蟾蜍甾二烯類成分指紋圖譜的測定
[0061]I實驗部分
[0062]1.1樣品前處理
[0063]供試品溶液的制備:精密稱定0.2g的蟾酥細粉，精密加入甲醇20ml，稱定重量，超聲提取，冷卻后，再稱定重量，用甲醇補足失重，搖勻，過濾，取續濾液作為供試品溶液。
[0064]對照品溶液的制備:分別精密稱取日蟾毒它靈、蟾毒它靈、蟾毒靈、華蟾酥毒基、月旨蟾毒配基對照品適量，加甲醇溶解并定容，搖勻，得到混合對照品溶液；其中，各成分的含量范圍為:日蟾毒它靈151.2?226.8 μ g、蟾毒它靈225.6?451.2μ g、蟾毒靈171.6?343.2 μ g、華蟾酥毒基460.0?9200.0 μ g、脂蟾毒配基394.4?788.8 μ g。
[0065]1.2色譜條件
[0066]高效液相色譜法的色譜條件為:色譜柱:Agilent Zorbax SB-C18(250mmX4.6mm,5μπι);柱溫:25?30°C;檢測波長:296nm ;流速:0.8?1.0ml/min ;進樣量:1?20μ I ;流動相:乙腈-0.5ν/ν%甲酸水溶液，其中，A相為乙腈，B相為0.5ν/ν%甲酸水溶液；分析時間:60min ;梯度洗脫。
[0067]梯度洗脫的具體程序為:
[0068]O ?20min, A 相:B 相體積比為 20:80_30:70 ；
[0069]20 ?25min, A 相:B 相體積比為 30:70_35:65 ；
[0070]25 ?40min, A 相:B 相體積比為 35:65-40:60 ；
[0071]40 ?50min, A 相:B 相體積比為 40:60_50:50 ；
[0072]50 ?60min, A 相:B 相體積比為 50:50。
[0073]1.3 測定
[0074]采用外標法，分別吸取體積為10 μ I的混合對照品溶液和供試品溶液，采用高效液相色譜儀進樣分析，將獲得的供試品溶液的液相色譜圖，與對照品溶液的液相色譜圖進行比較，指認共有特征峰，從而獲得供試品溶液中5種蟾蜍留二烯類成分的指紋圖譜。
[0075]2結果與討論
[0076]2.1前處理條件的優化
[0077]2.1.1提取方法的選擇
[0078]分別比較了熱回流、超聲和冷浸提取法，其中，采用熱回流提取方法提取I小時；采用超聲提取方法超聲30min ;采用冷浸提取法冷浸過夜提取。蟾酥藥材在不同提取方法下的色譜圖見圖1。
[0079]由圖1可知，在提取充分的條件下，三種提取方法得到的指紋圖譜全貌差異不大，各色譜峰面積無明顯差異，但是由于超聲處理操作簡便、迅速，因此最佳的提取方式為超聲提取法。
[0080]2.1.2提取溶劑的選擇
[0081 ] 采用相同前處理和高效液相色譜測定方法，分別比較甲醇、乙醇、80 %甲醇、80 %乙醇四種提取溶劑的使用效果，提取溶劑具體結果見圖2。通過主要峰面積比較結果表明，乙醇提取效率較低，后三種溶劑提取效率無明顯差異。由于2010版《中國藥典》收載蟾酥含量測定方法采用甲醇為提取溶劑，且蟾蜍留二烯類成分為脂溶性成分，因此采用甲醇為提取溶劑。
[0082]2.1.3提取時間及溶劑體積的選擇
[0083]采用相同前處理和高效液相色譜測定方法，比較了不同超聲時間、提取溶劑體積對提取效率的影響，以6個主要峰面積為指標進行比較，具體測定結果見圖3、表1、2。結果表明，選擇溶劑體積為100倍量甲醇時，提取化合物峰面積最大；表I中測定結果的RSD值均小于3.0%，其測定結果無明顯差異，因此選擇恰當的提取時間為30min即可提取完全。
[0084]表I不同超聲時間對化合物1- VI峰面積的影響結果
[0085]
【權利要求】
1.一種蟾酥藥材中蟾蜍留二烯類成分指紋圖譜的檢測方法，包括以下步驟: 1)供試品溶液的制備:稱取蟾酥細粉，加入甲醇，稱重，超聲提取，冷卻后，再稱重，用甲醇補足失重，搖勻，過濾，取續濾液作為供試品溶液； 2)對照品溶液的制備:分別精密稱取日膽毒它靈、膽毒它靈、膽毒靈、華膽醉毒基、月旨蟾毒配基對照品適量，加甲醇溶解并定容，搖勻，得到混合對照品溶液； 3)測定:采用相同色譜條件的高效液相色譜法分別測定供試品溶液和對照品溶液，將獲得的供試品溶液的液相色譜圖，與對照品溶液的液相色譜圖進行比較，根據相對保留時間，指認出5個共有特征峰，確認供試品溶液中5種蟾蜍留二烯類成分的特征峰，從而獲得供試品溶液中5種蟾蜍留二烯類成分的指紋圖譜。
2.根據權利要求1所述的一種蟾酥藥材中蟾蜍留二烯類成分指紋圖譜的檢測方法，其特征在于，所述步驟I)中，超聲提取所加入的甲醇為蟾酥的100?200倍量；所述超聲提取時間為20?45min。
3.根據權利要求1所述的一種蟾酥藥材中蟾蜍留二烯類成分指紋圖譜的檢測方法，其特征在于，如步驟2)所述對照品溶液中各成分的含量范圍為:日蟾毒它靈151.2?226.8 μ g、蟾毒它靈225.6?451.2 μ g、蟾毒靈171.6?343.2 μ g、華蟾酥毒基460.0?9200.0 μ g、脂蟾毒配基 394.4 ?788.8 μ g。
4.根據權利要求1所述的一種蟾酥藥材中蟾蜍留二烯類成分指紋圖譜的檢測方法，其特征在于，如步驟3)所述高效液相色譜法的色譜條件為:色譜柱:Agilent Zorbax SB-C18 ；柱溫:25?30°C，優選250C ;檢測波長:296nm ;流速:0.8?1.0ml/min,優選0.8ml/min ;進樣量:1?20 μ 1，優選10 μ I ;流動相:乙腈-0.5ν/ν%甲酸水溶液，其中，A相為乙腈，B相為0.5ν/ν%甲酸水溶液；分析時間:60min ;梯度洗脫。
5.根據權利要求4所述的一種蟾酥藥材中蟾蜍留二烯類成分指紋圖譜的檢測方法，其特征在于，所述梯度洗脫以流動相A相:B相體積比為20:50-80:50梯度變化洗脫。
6.根據權利要求5所述的一種蟾酥藥材中蟾蜍留二烯類成分指紋圖譜的檢測方法，其特征在于，所述梯度洗脫的具體程序為:0?20min，A相:B相體積比為20:80-30:70 ;20?25min, A 相:B 相體積比為 30:70-35:65 ；25 ?40min, A 相:B 相體積比為 35:65-40:60 ；40?50min, A相:B相體積比為40:60-50:50 ；50?60min, A相:B相體積比為50:50。
7.根據權利要求1-6任一所述的一種蟾酥藥材中蟾蜍留二烯類成分指紋圖譜的檢測方法在蟾酥藥材中5種蟾蜍留二烯類成分含量測定中的應用。
8.一種蟾酥藥材中5種蟾蜍留二烯類成分含量的測定方法，包括以下步驟: A)供試品溶液的制備:采用權利要求1-6任一權利要求所述蟾酥藥材中蟾蜍留二烯類成分指紋圖譜的檢測方法的步驟I)制備； B)對照品溶液的制備:采用權利要求1-6任一權利要求所述蟾酥藥材中蟾蜍留二烯類成分指紋圖譜的檢測方法的步驟2)制備； C)測定:采用高效液相色譜法在相同色譜條件下分別測定供試品溶液和對照品溶液，并采用外標法計算供試品溶液中5種蟾蜍留二烯類成分的含量。
9.根據權利要求8所述的一種蟾酥藥材中5種蟾蜍留二烯類成分含量的測定方法，其特征在于，如步驟C)所述高效液相色譜法的色譜條件采用權利要求1-6任一權利要求所述蟾酥藥材中蟾蜍留二烯類成分指紋圖譜的檢測方法的色譜條件。
【文檔編號】G01N30/88GK104034834SQ201410198657
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年5月12日 優先權日:2014年5月12日
【發明者】顧佳敏, 姜鵬, 陳忠樑, 詹常森, 向陽, 朱佳嫻, 許雯雯 申請人:上海和黃藥業有限公司, 菏澤和黃生物資源技術有限公司