用于檢測特異性免疫球蛋白g類抗體的方法
【專利摘要】本發明涉及用于檢測特異性免疫球蛋白G類抗體的方法。本發明涉及一種用于通過測定確定樣品中的分析物的方法，所述測定可以一步形式進行而無需進行洗滌步驟。該方法包括第一分析物特異性受體和第二分析物特異性受體，其中所述第一分析物特異性受體含有至少一個分析物結合位點（例如顆粒上的多個抗體），所述第二分析物特異性受體能夠選擇性結合至少兩個分析物分子的排列，所述至少兩個分析物分子結合于第一受體。描述了夾心免疫測定，其中所述檢測基于電化學發光。
【專利說明】用于檢測特異性免疫球蛋白G類抗體的方法
[0001]本申請為申請號為200880014780.8的分案申請，要求2007年5月8日的優先權。
[0002]本發明涉及一種用于通過一步方式進行而無須洗滌步驟的測定確定樣品中的分析物的方法。
[0003]作為對引入外來物質的應答，哺乳動物生物體的免疫系統產生抗體，抗體又名免疫球蛋白。它們充當針對外來物質的防御，外來物質也稱為抗原。所述免疫球蛋白可以分為五種不同的類型。人們將免疫球蛋白區分為M、G、A、E和D類。這五種免疫球蛋白類型的區別在于重鏈的組成，所述重鏈分別稱為μ、Y、α、ε和δ鏈。
[0004]每個免疫球蛋白類型在生物體中具有不同的功能。M類免疫球蛋白在第一次與抗原接觸(所謂的初次免疫)的過程中發生。然而，隨著感染的進行，這些免疫球蛋白的濃度快速降低。G類免疫球蛋白首先在初次免疫的過程中緩慢地形成，并且在以同樣的抗原進行第二次感染時大量存在。A類免疫球蛋白在生物體粘膜表面被發現，負責局部防御過程。E類免疫球蛋白主要負責過敏反應。迄今為止，D類免疫球蛋白的精確功能仍是未知的。
[0005]血液中各免疫球蛋白類型以非常不同的濃度存在。因此，G類免疫球蛋白(IgG)是正常人血清中最豐富的類型，比例為約75%，相當于8-18mg/ml的血清含量。第二最常見的免疫球蛋白是IgA，其平均血清濃度為0.9-4.5mg/ml。M類免疫球蛋白以0.6-2.8mg/ml的濃度存在，D類免疫球蛋白以0.03-0.4mg/ml的濃度存在。IgE抗體的比例是最低的；它們僅以0.02-0.05 μ g/ml的濃度存在于血清中。
[0006]在現有技術中描述了多種用于檢測針對抗原具有特異性的特定類型的抗體的方法。因此，樣品中特定類型的抗原特異性抗體的檢測經常通過將特異性抗體結合到包覆有所述特異性抗原的固相上進行。通過將特異性地針對特定類型的人Ig的抗體結合到待檢測的Ig分子上，來檢測對所述抗原具有特異性并且正結合于所述固相的免疫球蛋白(Ig)。為針對人Ig的抗體提供標記，通過該標記進行檢測。然而，這樣的測試過程(間接測試形式)只有在如下情況下才是可能的:如果在與針對人Ig的類別特異性的標記抗體反應之前，通過洗滌除去所有非特異性、未結合的Ig。因此，一步測試方法，例如自動化系統經常需要的方法，不可能是這種形式的。
[0007]所謂的橋測試(bridge test)開啟了在一步測試中進行抗體檢測的可能性。在EP-A-O 280 211中描述了橋測試的概念。在這種方法中，將能夠特異性結合待測定抗體(例如抗原)的第一結合配偶體(partner)結合于固相。待測定抗體則與結合于固相的抗原結合。另一種具有標記的特異性抗原也存在于測試混合物中。通過該標記來檢測所述抗體。如果不同類型但具有相同特異性的免疫球蛋白存在于樣品中，則該測試不能在不同類型之間進行區分。
[0008]EP O 944 838 BI披露了一種橋測試檢測方法，該方法能夠選擇性確定樣品中的抗原特異性IgG抗體，該樣品中也含有具有相同特異性的IgM。為此，所述抗原以單體形式使用。所述單體抗原具有如下效果:具有相同特異性的IgM抗體不能與所述抗原反應或僅能與其微弱地反應。
[0009]特異性抗體測試在感染血清學中至關重要，在所述感染血清學中，檢測了針對病原體的抗原結構的免疫反應。雖然用于獲得病原體的抗原的不同來源是現有技術(原核和真核系統中的重組表達；病原體的控制性培養，從天然來源分離抗原)，但并不總是可以獲得單體形式的抗原，從而以一步形式進行IgG-選擇性免疫測定。
[0010]EP O 957 360 BI描述了在用于測定分析物的方法中使用類風濕因子來降低Hook效應。
[0011]EP I 098 198 Al描述了一種用于測定人IgG抗體的免疫測定。在該案例中，使用了一種特殊的單克隆抗體，其針對結合于抗原的人IgG的Fe片段的構象表位。該抗體用于選擇性檢測IgG，并且可以區分結合于抗原的IgG和不結合抗原的IgG。然而，未結合的IgG的存在會干擾并導致信號損失。
[0012]EP I 653 233 Al描述了一種用于測定IgG類型的抗原特異性抗體的測試方法，其中使樣品與結合了抗原的固相接觸。在該方法中，使用單克隆抗體，該單克隆抗體區分未特異性結合于固相的免疫球蛋白和結合于所述抗原的免疫球蛋白。使樣品與固相接觸后，將其洗去并隨后施加單克隆抗體。
[0013]在專利申請WO 99/15898 (Chien等)中描述了一種用于以一步形式檢測抗原特異性免疫球蛋白G的免疫測定，其可以使用自動分析儀進行。其中，使用了對人免疫球蛋白G的恒定部分具有特異性的抗體。在該測定中，存在游離的非特異性IgG的顯著干擾，沒有充分區分游離的IgG與復合的IgG。
[0014]因此，現有技術的用于檢測IgG的一步法不能夠充分區分游離的IgG與結合的IgG。為了區分具有相同特異性的IgG和IgM，抗原必須是單體的，而這是一個經常不能滿足的要求。
[0015]因此，本發明的目的在于開發一種用于檢測樣品中的分析物、特別是G類免疫球蛋白的抗原特異性抗體的方法，該方法可以一步法進行，從而其可以有利地用于自動化系統。此外，本發明的目的為至少部分地克服現有技術的缺點。為此，有必要充分區分游離的分析物與結合的分析物。
[0016]第一方面，本發明涉及一種確定樣品中的分析物的方法，該方法包括以下步驟:
[0017](a)使樣品與第一分析物特異性受體和第二分析物特異性受體接觸，其中兩種受體之一結合于固相或能夠結合于固相，而另一種受體攜帶產生信號的基團或能夠結合于產生信號的基團，以及
[0018](b)通過確定所述固相上產生信號的基團，檢測所述分析物的存在或/和量，
[0019]其特征在于第一分析物特異性受體含有所述分析物的至少兩個結合位點，而第二分析物特異性受體能夠選擇性地結合于至少兩個分析物分子的排列，所述至少兩個分析物分子結合于第一受體。
[0020]意外地發現，樣品中存在類風濕因子并不干擾本發明的方法。
[0021 ] 本發明的方法適于檢測樣品中的任何分析物。優選的是，所述分析物是抗原特異性抗體，例如G、M、A、D或/和E類的抗原特異性抗體。更優選，所述分析物是G類抗原特異性抗體，例如針對病原體、腫瘤抗原或/和自身抗原的G類抗原特異性抗體。
[0022]含有分析物的樣品優選為液體樣品。所述液體樣品可以是任何液體樣品，例如含水的樣品。樣品可以是生物樣品或/和臨床樣品例如體液如血液、血清、尿、唾液、膿等等。樣品可以更優選含有類風濕因子。[0023]在優選實施方式中，所述第一和第二分析物特異性受體彼此不同。
[0024]在本發明的方法中，第二受體能夠選擇性結合至少兩個分析物分子的排列，所述至少兩個分析物分子結合于第一受體。“至少兩個分析物分子的排列”意為至少兩個分析物分子一起具有如下結構:第二受體可以選擇性結合于該結構，即其可被第二受體識別，并且第二受體可以將其與單一分析物分子、特別是未結合于第一受體的單一分析物分子區分開。“能夠選擇性結合”也表示與單一分析物分子相比，第二受體可以更強地結合于至少兩個分析物分子的排列。排列還可以是包含結合于第一受體的至少兩個分析物分子(特別是抗體)的免疫復合物。第一受體可以包含具有至少兩個表位的抗原。
[0025]“排列”優選含有彼此“聚集”并結合于第一受體的至少兩個分析物分子。在本發明意義上，“聚集的”或“聚集”表示結合于所述受體的分析物分子彼此處于某一距離，選擇這樣的距離使得第二分析物特異性受體結合所述至少兩個分析物分子，其中所述至少兩個分析物分子結合于第一受體。因此，結合于第一受體的分析物分子在空間上彼此接近。通過所述受體中結合位點之間的距離來確定結合于第一受體的分析物分子之間的距離。在本發明的意義上，“聚集的”或“聚集”包括結合于第一受體的分析物分子彼此不是化學結合或者彼此之間具有化學鍵例如共價鍵或非共價鍵例如氫鍵或抗原-抗體結合。
[0026]第一分析物特異性受體含有針對所述分析物的至少兩個結合位點。第一分析物特異性受體可以含有至少兩個不同的結合位點、至少兩個相同的結合位點或者不同的和相同的分析物結合位點的組合。
[0027]在另一種進一步優選的實施方式中，第一受體是寡聚體受體或多聚體受體。在本發明的意義上，“寡聚體”或“多聚體”表示第一受體含有針對所述分析物的多個結合位點，優選至少3個、至少4個、至少5個、至少10個、至少20個、至少50個或至少100個結合位點。第一受體優選含有多至200個、多至100個、多至50個、多至20個、多至10個或者多至5個結合位點。在本發明的意義上，“寡聚體”或“多聚體”也包括如下含義:第一受體可以是寡聚體或者結構單元(building block)的多聚體，其中各結構單元可以沒有結合位點、具有一個結合位點或者多個結合位點。“寡聚體”或“多聚體”還包括“低價的”或“多價的”。
[0028]在進一步優選的實施方式，以受體前體的形式提供第一受體。優選地，提供至少兩種受體前體。受體前體優選地彼此聯合或者彼此結合以形成第一受體。所述受體前體可以具有如下性質:它們可以在本發明方法的步驟(a)中彼此聯合或結合，以形成第一受體。它們也可以具有如下性質:它們可以在本發明方法的步驟(a)之前彼此聯合或結合。所述至少兩種受體前體可以具有如下性質:兩種受體前體的任一種包含針對分析物的所有結合位點或者兩種受體前體均包含針對分析物的至少一個結合位點。
[0029]所述至少兩個受體前體可以彼此聯合或通過化學鍵彼此結合，其中所述鍵可以是共價鍵或非共價鍵。本領域技術人員已知的任何結合系統都可以用于所述聯合或結合。優選本文中描述的X/抗-X結合系統，例如抗生物素蛋白(avidin) /抗生蛋白鏈菌素(streptavidin)生物素系統。因此，所述至少兩個受體前體中的一個可以含有生物素基團，而另一個受體前體含有抗生物素蛋白或者抗生蛋白鏈菌素基團。例如，攜帶針對所述分析物的至少一個結合位點的生物素化分子例如肽可以通過結合于涂敷有抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素的珠或與所述珠聯合而形成第一受體，其中所述受體含有針對所述分析物的至少兩個結合位點。所述珠也可以是生物素化的，并且攜帶至少一個結合基團的分子可以與抗生物素蛋白或者抗生蛋白鏈菌素聯合。
[0030]因此，第一受體可以包含珠，該珠攜帶針對所述分析物的至少兩個結合位點的排列。優選第一受體包含珠，該珠包含至少10個、至少50個或至少100個結合位點。
[0031]在本發明方法的另一進一步優選的實施方式中，第一受體包含抗原，該抗原含有至少兩個表位作為針對分析物的結合位點。在該實施方式中，所述分析物是抗體，優選G、M、A、D或/和E類抗體，更優選G類抗體。
[0032]本發明的抗原可以是寡聚體或多聚體抗原。所述至少兩個表位可以是相同的或不同的。所述抗原可以包含至少兩個不同的表位、至少2個相同的表位或相同的和不同的表位的組合。所述抗原可以包含重復表位。所述抗原可以包含多個表位，優選至少3個、至少4個、至少5個、至少10個、至少20個或至少50個表位。所述抗原可以含有多至100個、多至50個、多至20個、多至10個或者多至5個表位。
[0033]本發明的抗原可以具有任何具有不同的結構特征和組成的表位。所述抗原可以包括微生物、細胞、細胞器、細胞區室(compartment)或其裂解物或制備物例如膜制備物。所述抗原可以是分離自天然來源的抗原或通過在原核或/和真核生物中重組表達或/和通過化學合成而制備的抗原。抗原的寡聚化或多聚化可以任選地通過天然組裝或聚集、或者靶向吸附或共價連接、或吸附或共價綴合而進行。
[0034]在進一步優選的實施方式中，所述第二分析物特異性受體包含抗體。更優選具有類風濕因子樣性質的抗體，其可優選地結合聚集的或寡聚化免疫球蛋白而不是單一的免疫球蛋白。
[0035]同樣地優選第二受體包含抗體，所述抗體對于結合分析物具有低親和力。本發明抗體的親和力定義為抗體上的各抗原結合位點和各表位之間的所有非共價相互作用的強度。具有低親和力的抗體微弱結合并快速解離，而高親和力抗體則結合更強，并且可以保持結合更長的時間。
[0036]結合位點處的親和力不總是反映抗原-抗體相互作用的實際強度，例如具有至少兩個結合了分析物分子(例如抗原特異性抗體)的表位的作為第一受體的本發明的抗原和例如作為第二受體的具有多個結合位點的抗體之間的相互作用的實際強度。在一個位點上抗原和抗體的抗原結合位點之間的相互作用增加了同一抗體的第二抗原結合位點處反應的可能性，這可導致相互作用配偶體的交聯。多價抗體和抗原之間的這種多重相互作用的強度稱為抗體親抗原性(avidity)。在這方面，高抗體親抗原性補償了例如在五聚體免疫球蛋白IgM的情況下的低親和力。
[0037]在一種優選實施方式中，第二受體是包含至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個和特別優選10個或更多互補位的抗體。
[0038]在本發明中，第二受體更優選包含針對所述分析物具有低親和力和高抗體親抗原性的抗體，例如包含至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個并且特別優選10個或更多互補位的抗原特異性抗體。更優選的第二受體是免疫球蛋白IgM或IgG免疫球蛋白彼此交聯的抗原特異性抗體。抗體<h-agg.1gG>IgM是最強烈優選的。
[0039]本發明的低親和力抗體的親和系數為高于10_8M、優選高于10_7M、更優選高于10-6Μ。[0040]本發明的作為第二受體的低親合力抗體優選地識別分析物分子，尤其是抗原特異性抗體，其例如以足夠的密度、以排列或/和作為聚集體結合于第一受體。未結合的分析物分子或松散且不規則分布的非特異性結合于第一受體的分析物分子優選不被識別或僅以微不足道的程度被識別。因此，本發明的這種第二分析物特異性受體能夠選擇性結合其上結合了至少兩個分析物分子的第一受體。
[0041]IgM類抗體具有一般的類風濕抗體類的性質，即它們優選地結合免疫球蛋白類IgG的抗原特異性結合抗體，因為它們僅識別在免疫測定的多聚體抗原上足夠密集地包裝的抗原特異性抗體。非復合的、游離的免疫球蛋白G，具體而言其對抗原不具有特異性，不被識別或僅以微不足道的程度被識別。
[0042]通過這樣的方式，可以例如在存在具有相同抗原特異性的其他類型的免疫球蛋白的情況下以及還在存在非特異性IgG而不損失靈敏度(這將損害所述測定)的情況下檢測抗原特異性IgG。使用本發明的第二受體實現了特異性結合抗原的免疫球蛋白G和非抗原特異性的游離IgG之間待實現的高辨別力。此外，本發明的第二受體優選識別在本發明的抗原上特異性結合并彼此鄰近定位的免疫球蛋白分子，并且可以被寡聚化，但其不識別或以微不足道的程度識別游離的、未復合的抗原特異性免疫球蛋白。
[0043]因此，確保了以一步形式在存在過量存在的天然產生的、非抗原特異性IgG分子的情況下檢測樣品中的G類抗原特異性免疫球蛋白。
[0044]“一步法”理解為表示分析物與本發明的反應物的反應可以在一種反應混合物中進行，特別是不需通過一或多個洗滌步驟來將所述混合物的組分彼此分開。
[0045]“一步法”或“在一種反應混合物中的反應”包括下列可能性:同時/連續將反應物添加至反應混合物(樣品)，或/和同時/連續添加其他輔助物質(例如緩沖液、鹽等)。
[0046]優選的“一步法”是無需洗滌步驟而進行的。
[0047]在另一個優選實施方式中，本發明方法中的步驟(a)是在一種反應混合物中進行而無需洗滌步驟。更優選，步驟(a)和(b)是在一種反應混合物中進行而無需洗滌步驟。本發明方法實現了以一步形式檢測免疫球蛋白G類的抗原特異性抗體。這些抗體試驗在體外診斷傳染病和自身免疫疾病中非常重要。
[0048]在其它實施方式中，本發明方法可以包含洗滌步驟。
[0049]在最優選的實施方式中，本發明方法中的第一受體為本發明的抗原，第二受體為類風濕因子樣抗體、特別是M類免疫球蛋白，而分析物為抗原特異性免疫球蛋白G。因此，多個特異性免疫球蛋白G結合于抗原結合配偶體是可能的，這轉而引起IgG分子的寡聚化，即兩個或多個IgG可以在空間上彼此鄰近，從而能夠結合類風濕因子樣受體。
[0050]在另一種進一步優選的實施方式中，本發明方法為診斷方法，特別是用于檢測生物樣品，特別是臨床樣品中的抗體的診斷方法。在本發明的診斷方法中，例如可以檢測針對抗原(例如病毒或微生物)、腫瘤抗原或/和自身抗體的抗體。特別地，可以檢測抗病毒例如風疹、CMV、HAV, HBV、HCV的抗體。
[0051]在本發明的方法中，抗體片段也可以用作受體。抗體的片段化是本領域技術人員已知的，并按照常規方法進行。蛋白酶剪切和/或重組產生的片段的實例包括Fab、Fiah' )2、Fab'、Fv和單鏈抗體(scFv)，其含有V[L]和/或V[H]結構域，具有肽接頭。所述scFv可以共價或非共價連接以形成具有兩個或多個結合位點的抗體。本發明的抗體可以是多克隆抗體、單克隆抗體、可以通過重組產生的嵌合抗體或人源化抗體。優選的是第二受體是單克隆抗體。
[0052]本發明的抗體優選是單克隆抗體、特別是IgM類，其具有針對IgG、特別是人IgG的低親和力和高抗體親抗原性。通過高抗體親抗原性，該抗體可以選擇性地確保通過多點結合而在復合狀態下識別人IgG。
[0053]根據本發明，兩種受體中的一種結合于固相或能夠結合固相，而兩種受體中的另一種攜帶產生信號的基團或能夠結合于產生信號的基團。在一個優選實施方式中，第一受體結合于固相或能夠結合固相，而第二受體攜帶產生信號的基團或能夠結合于產生信號的基團。在另一優選實施方式中，第二受體結合于固相或能夠結合固相，而第一受體攜帶產生信號的基團或能夠結合于產生信號的基團。
[0054]本領域技術人員熟悉的所有產生信號的基團均可用作產生信號的基團。優選使用直接可檢測的基團，例如化學發光基團、熒光基團或放射性基團，或者金屬溶膠(metalsole)、乳膠或金顆粒。產生信號的基團可以本領域技術人員已知的方式被檢測到。
[0055]能夠結合的第一或第二受體優選是可溶的，并優選攜帶起到結合受體作用的標記。X/抗-X結合系統的配偶體優選作為標記，例如組合的配偶體選自生物素/抗生物素蛋白、生物素/抗生蛋白鏈菌素、生物素/抗生物素(antibiotin)、半抗原/抗半抗原、抗體的Fe片段和針對該Fe片段的抗體、抗抗體或碳水化合物和凝集素。結合系統的另一反應配偶體結合于載體或結合于產生信號的基團。結合系統的配偶體可以按照本領域技術人員已知的常規方法被結合。在這方面，共價結合以及吸附結合是適宜的。
[0056]在進一步的實施方式中，標記是本文中所描述的產生信號的基團。優選，使用直接可檢測的基團作為標記。用于標記受體的方法已知為現有技術。通過測量產生信號的基團，可以本身已知的方式直接檢測標記。
[0057]標記也可以通過間接的方式進行檢測。在這種情況下，進一步的結合配偶體特異性結合受體、受體上的標記、抗原或/和抗原上的標記，而該結合配偶體自身則綴合于產生信號的基團。
[0058]本發明方法的最優選實施方式是一種通過以一步形式進行免疫測定來檢測樣品中的免疫球蛋白G類的抗原特異性抗體的方法，該方法包括以下步驟:
[0059](a)使含有對抗原具有特異性的免疫球蛋白G類抗體的樣品與第一受體和第二受體接觸，所述第一受體包含寡聚體或多聚體形式的抗原并攜帶產生信號的基團，所述第二受體選擇性結合抗原結合的、聚集的免疫球蛋白G并攜帶標記，其中接觸條件為形成由抗原、特異性結合抗原的免疫球蛋白G和第二受體組成的免疫復合物；
[0060](b)使來自(a)的反應混合物與固相接觸，所述固相含有針對第二受體的標記的固定化結合配偶體，其中接觸條件為來自(a)的免疫復合物通過所述第二受體結合于所述固相；
[0061](C)通過所述產生信號的基團檢測來自(b)的結合復合體。
[0062]本發明方法的另一種最優選實施方式是通過以一步形式進行免疫測定來檢測樣品中的免疫球蛋白G類的抗原特異性抗體的方法，該方法包括以下步驟:
[0063](a)使含有對抗原具有特異性的免疫球蛋白G類抗體的樣品與第一受體和第二受體接觸，所述第一受體包含寡聚體或多聚體形式的抗原，其中第一受體攜帶標記，所述第二受體選擇性結合抗原結合的、聚集的免疫球蛋白G并攜帶產生信號的基團，其中接觸條件為形成由抗原、特異性結合抗原的免疫球蛋白G和第二受體組成的免疫復合物；
[0064](b)使來自(a)的反應混合物與固相接觸，所述固相含有針對第一受體的標記的固定化結合配偶體，其中接觸條件為來自(a)的免疫復合物通過所述第一受體結合于所述固相；
[0065](C)通過所述產生信號的基團檢測來自(b)的結合復合體。
[0066]本發明的另一主題是試劑盒，其適用于包括優選實施方式的本文中所描述的本發明方法。
[0067]優選試劑盒包含第一分析物特異性受體和第二分析物特異性受體，其中兩種受體之一結合于固相或能夠結合于固相，而另一種受體攜帶產生信號的基團或能夠結合于產生信號的基團，其特征在于第一分析物特異性受體含有至少兩個針對分析物的結合位點，而第二分析物特異性受體能夠選擇性結合至少兩個分析物分子的排列，所述至少兩個分析物分子結合于第一受體。
[0068]更優選的是本發明的試劑盒中第一分析物特異性受體和第二分析物特異性受體配制成用于一種反應混合物中。
[0069]一種更強優選的實施方式涉及試劑盒，其中第一受體結合于固相或能夠結合固相，而第二受體攜帶產生信號的基團或能夠結合于產生信號的基團。
[0070]另一種也是更強優選的實施方式涉及試劑盒，其中第二受體結合于固相或能夠結合固相，而第一受體攜帶產生信號的基團或能夠結合于產生信號的基團。
[0071]在進一步優選的實施方式，第一受體也可以受體前體的形式提供于本發明的試劑盒中。結合本發明方法，在本文中描述了受體前體。特別地，所述試劑盒可以含有珠作為受體前體和另外的受體前體例如肽。
[0072]本發明的試劑盒也可以包含珠作為第一受體，該珠包含至少10個、至少50個或至少100個結合位點。
[0073]本發明的另一方面涉及分析物特異性受體在確定樣品中的分析物的方法中的用途，其中所述分析物特異性受體含有至少兩個針對分析物的結合位點。該方法優選為本文中描述的方法、更優選為本文中描述的診斷方法。
[0074]本發明涉及以下實施方式:
[0075]1.用于確定樣品中的分析物的方法，包括以下步驟:
[0076](a)使樣品與第一分析物特異性受體和第二分析物特異性受體接觸，其中兩種受體之一結合于固相或能夠結合于固相，而另一種受體攜帶產生信號的基團或能夠結合于產生信號的基團，以及
[0077](b)通過確定所述固相上產生信號的基團檢測所述分析物的存在或/和量，
[0078]其特征在于
[0079]所述第一分析物特異性受體含有所述分析物的至少兩個結合位點，而所述第二分析物特異性受體能夠選擇性地結合于至少兩個分析物分子的排列，所述至少兩個分析物分子結合于所述第一受體。
[0080]2.第I項的方法，其特征在于所述分析物是抗原特異性抗體，特別是免疫球蛋白G類抗原特異性抗體。[0081]3.第I或2項的方法，其中所述第一受體結合于固相或能夠結合固相，而所述第二受體攜帶產生信號的基團或能夠結合于產生信號的基團。
[0082]4.第I或2項的方法，其中所述第二受體結合于固相或能夠結合固相，而所述第一受體攜帶產生信號的基團或能夠結合于產生信號的基團。
[0083]5.第I至4項任一項的方法，其中所述結合于第一受體的至少兩個分析物分子是聚集的。
[0084]6.第I至5項任一項的方法，其特征在于所述第一受體含有針對所述分析物的至少兩個不同的結合位點、至少兩個相同的結合位點或不同的和相同的結合位點的組合。
[0085]7.前述任一項的方法，其特征在于所述第一受體是寡聚化或多聚化受體。
[0086]8.前述任一項的方法，其特征在于所述第一受體包含抗原，所述抗原含有至少兩個表位作為所述分析物的結合位點。
[0087]9.前述任一項的方法，其特征在于所述第一受體包含珠。
[0088]10.前述任一項的方法，其中所述第一受體以受體前體的形式提供。
[0089]11.第10項的方法，其中所述受體前體具有這樣的性質:它們可以在本發明方法的步驟(a)中或步驟(a)之前彼此聯合或結合，以形成所述第一受體。
[0090]12.前述任一項的方法，其特征在于所述第二受體是類風濕因子樣抗體。
[0091]13.前述任一項的方法，其特征在于所述第二受體是具有至少兩個互補位的抗體。
[0092]14.前述任一項的方法，其特征在于所述第二受體是免疫球蛋白M類的抗體。
[0093]15.前述任一項的方法，其中所述第二受體是針對所述分析物具有低親和力和高抗體親抗原性的抗體。
[0094]16.前述任一項的方法，其特征在于所述第二受體是單克隆抗體。
[0095]17.前述任一項的方法，其中步驟(a)在一種反應混合物中進行而無需洗滌步驟。
[0096]18.前述任一項的方法，其為診斷方法。
[0097]19.試劑盒，其包含第一分析物特異性受體和第二分析物特異性受體，其中兩種受體之一結合于固相或能夠結合于固相，而另一種受體攜帶產生信號的基團或能夠結合于產生信號的基團，
[0098]其特征在于:
[0099]所述第一分析物特異性受體含有至少兩個針對所述分析物的結合位點，而所述第二分析物特異性受體能夠選擇性結合至少兩個分析物分子的排列，所述至少兩個分析物分
子結合于第一受體。
[0100]20.第19項的試劑盒，其中所述第一分析物特異性受體和第二分析物特異性受體配被制成用于一種反應混合物中。
[0101]21.第19或20項的試劑盒，其中所述第一受體結合于固相或能夠結合固相，而所述第二受體攜帶產生信號的基團或能夠結合于產生信號的基團。
[0102]22.第19或20項的試劑盒，其中所述第二受體結合于固相或能夠結合固相，而所述第一受體攜帶產生信號的基團或能夠結合于產生信號的基團。
[0103]23.分析物特異性受體在用于確定樣品中的分析物的方法中的用途，所述分析物特異性受體含有至少兩個針對所述分析物的結合位點。
[0104]24.第23項的用途，其用于診斷方法。[0105]本發明通過以下實施例進行說明。各實施例包含本發明的數據和使用現有技術方法獲得的比較數據。
實施例
[0106]實施例1:根據本發明方法檢測人血清中的抗風疹特異性免疫球蛋白G，并比較本發明方法與含有洗滌步驟的以間接測試形式進行的現有技術的免疫測定的靈敏性
[0107]1.1.本發明方法
[0108]使用自動化Elecsys 201 O分析儀(Roche Diagnostics GmbH)免疫學檢測原
血清中的抗風疹IgG。使用本發明的抗體作為捕獲抗體進行測量。該抗體的生物素綴合物固定化在涂敷了抗生蛋白鏈菌素的磁珠表面上，因此結合來自樣品的結合于多聚體樣粒子(RLP)的抗風疹IgG。通過結合于RLP的釕化單克隆抗體檢測該復合物。Elecsys_:K'_2010中的信號檢測是基于電化學發光。
[0109]在鉬電極上激發后，在存在特異性免疫球蛋白分析物和620nm發射光的情況下將生色的釕復合物結合于固相。以任意單位表示光信號。使用來自具有混合滴度和兩個血清轉化板的板的抗風疹IgG陽性樣品進行測量。
[0110]1.2現有技術
[0111]進行現有技術的兩步免疫測定(Cobas Core,風疫IgG recomb II)用于比較。
[0112]具有混合滴度的板
[0113]
【權利要求】
1.用于確定樣品中的分析物的方法，包括以下步驟: (a)使樣品與第一分析物特異性受體和第二分析物特異性受體接觸，其中兩種受體之一結合于固相或能夠結合于固相，而另一種受體攜帶產生信號的基團或能夠結合于產生信號的基團，以及 (b)通過確定所述固相上產生信號的基團檢測所述分析物的存在或/和量， 其特征在于 所述第一分析物特異性受體含有所述分析物的至少兩個結合位點，而所述第二分析物特異性受體能夠選擇性地結合于至少兩個分析物分子的排列，所述至少兩個分析物分子結合于所述第一受體。
2.權利要求1的方法，其特征在于所述分析物是抗原特異性抗體，特別是免疫球蛋白G類抗原特異性抗體。
3.權利要求1或2的方法，其中所述第一受體結合于固相或能夠結合固相，而所述第二受體攜帶產生信號的基團或能夠結合于產生信號的基團。
4.權利要求1或2的方法，其中所述第二受體結合于固相或能夠結合固相，而所述第一受體攜帶產生信號的基團或能夠結合于產生信號的基團。
5.權利要求1至4任一項的方法，其中所述結合于第一受體的至少兩個分析物分子是聚集的。
6.權利要求1至5任一項的方法，其特征在于所述第一受體含有針對所述分析物的至少兩個不同的結合位點、至少兩個相同的結合位點或不同的和相同的結合位點的組合。
7.前述權利要求任一項的方法，其特征在于所述第一受體是寡聚化或多聚化受體。
8.前述權利要求任一項的方法，其特征在于所述第一受體包含抗原，所述抗原含有至少兩個表位作為所述分析物的結合位點。
9.前述權利要求任一項的方法，其特征在于所述第一受體包含珠。
10.前述權利要求任一項的方法，其中所述第一受體以受體前體的形式提供。
【文檔編號】G01N33/68GK103777024SQ201410045863
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2008年5月6日 優先權日:2007年5月8日
【發明者】M.布羅諾爾德, C.馬克特-哈恩, F.多尼, R.博爾哈根, B.烏普邁耶 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司