針對蛋白藥物的elisa檢測用特異性抗體對的篩選方法
【專利摘要】本發明涉及一種針對蛋白藥物的ELISA檢測用特異性抗體對的篩選方法，其特征在于，包括下列步驟：初步篩選能夠用于ELISA夾心法檢測蛋白藥物的抗體對，包括捕獲抗體和檢測抗體；經過第一次檢測確認所述的捕獲抗體和所述的檢測抗體能夠阻斷蛋白藥物與其作用靶點的結合；第二次檢測確認所述的捕獲抗體和所述的檢測抗體是針對蛋白藥物與其作用靶點的結合表位；第三次檢測確認利用所述的捕獲抗體和所述的檢測抗體對建立ELISA夾心法能用于不同基質中的樣品檢測。本方法能夠比較全面、系統、高效的對蛋白藥物藥代動力學研究的ELISA檢測用特異性抗體對進行篩選。
【專利說明】針對蛋白藥物的ELISA檢測用特異性抗體對的篩選方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及生物制品檢測領域，特別涉及ELISA檢測用特異性抗體對的篩選方法，具體涉及一種針對蛋白藥物的ELISA檢測用特異性抗體對的篩選方法。
【背景技術】
[0002]隨著生物技術的不斷進步，生物大分子蛋白藥物逐漸成為當今藥物發展最為活躍和迅速的研究重點而受到廣泛關注。生物蛋白藥物包括蛋白多肽類似物或衍生物、融合蛋白、單克隆抗體藥物等，是通過細菌、酵母或哺乳動物細胞等表達系統利用基因工程生產所得。在生物蛋白藥物的市場上排在前列的是單克隆抗體類藥物，它能夠特異性的與治療靶點結合，抑制腫瘤細胞生長或殺死腫瘤細胞，副作用相對小分子化藥要小得多。近些年，隨著一些早期的單抗類藥物的專利即將到期，國內外各大藥廠紛紛進行生物仿制藥的研發，形成一陣熱潮。
[0003]在蛋白藥物的研制過程中，臨床前和臨床的藥代動力學研究數據是必不可少的，也被藥監部門認為是十分重要的，因為它直接關系到藥物的安全性和有效性。藥代動力學重點研究藥物在體內的吸收、分布、代謝和排泄，與藥效學和毒理學研究一起構成蛋白藥物藥理學研究和評價的核心。
[0004]藥代動力學研究的關鍵是建立穩定可靠的，能在復雜基質環境中檢測到目標藥物的定量方法，方法學的優劣直接影響研究質量。小分子化學藥物結構簡單，分子量小，常規色譜技術即能夠實現對這一類藥物的定量分析，實現難度不大。大分子蛋白藥物則不然，以單克隆抗體藥物為例，分子量達到150KD，有多聚物及電荷異質體的存在，有復雜的翻譯后修飾，有內源性結構類似物等，這些都給藥物定量方法學的建立帶來了挑戰，用于小分子化藥藥代動力學研究的實驗手段也難以滿足大分子蛋白藥物的要求。
[0005]常見的用于蛋白藥物藥代動力學研究的分析方法包括基于同位素標記的分離分析技術和免疫分析方法，其中基于免疫分析的定量ELISA夾心法則是最常用的。該方法基于抗原/抗體間高親和力的特異性結合，能夠在藥代動力學研究中涉及的樣本如血清、尿液、唾液等復雜基質中實現對蛋白藥物的微量分析。
[0006]建立ELISA夾心法的關鍵是尋找合適的抗體對，即針對同一待測蛋白藥物的捕獲抗體和檢測抗體，抗體對能夠分別與待測抗原的不同表位結合從而形成免疫復合物，通過偶聯在檢測抗體上的酶標記物、熒光標記等顯色基團實現對目標抗原的檢測。常規ELISA夾心法的構建在篩選抗體對時主要關注捕獲抗體與檢測抗體是否能夠同時與待測抗原結合形成穩定的抗體對，與待測抗原之間的結合是否有足夠的親和力，盡量滿足能夠針對待測抗原的不同表位等，使得檢測方法具有較高的靈敏度和較寬的檢測范圍。在針對生物蛋白藥物的藥代動力學研究來進行ELISA方法開發時，研究人員往往利用常規思路來篩選抗體對，并沒有考慮到蛋白藥物藥代動力學研究的特殊性。
[0007]前已述及，蛋白藥物分子量大，結構復雜，是針對人體內的作用靶點來設計的。蛋白藥物注射到體內之后，為了減少機體產生免疫排斥反應，如免疫原性，在進行蛋白藥物設計時會對蛋白藥物的氨基酸序列進行人源化改造，即盡可能使藥物蛋白接近人體自身蛋白，有時也直接用人體自身蛋白的氨基酸序列進行藥物設計。所以很顯然蛋白藥物在人體內會存在許多結構類似物。這些結構類似物會對人體內目標蛋白藥物的ELISA定量檢測造成干擾。
[0008]另一方面，蛋白藥物生產出來存在很多翻譯后修飾，注射到體內也會有降解、代謝、修飾等現象出現，這些“殘缺”的蛋白藥物分子可能無法與體內作用靶點結合而發揮生物學功能。這些“殘缺”的蛋白藥物分子并不是藥代動力學研究進行蛋白藥物定量的目標，但會對“完整”的目標蛋白藥物分子的定量檢測造成干擾。
[0009]此外，即使是同一個抗體分子，在不同基質環境中與同一個蛋白藥物的結合能力是有區別的，以血清為例，正常人血清中存在著大量不同類型的蛋白分子如細胞因子、補體、抗體等，這些都不可避免的會對抗原抗體間的結合造成干擾，所以一般情況下，針對同一抗原抗體反應，在血清中反應的檢測信號值要低于在普通Buffer如PBS中反應的檢測信號值。這些來源于基質環境中的干擾同樣在進行蛋白藥物藥代動力學研究方法學建立過程中是需要考察和克服的。
[0010]正是由于生物蛋白藥物相對于小分子化合物藥物存在著上述這些復雜性和特殊性，針對某蛋白藥物的藥代動力學研究來建立相應的定量分析方法是十分困難的，所構建的ELISA夾心法必須能特異性的檢測目標蛋白藥物分子，捕獲抗體和檢測抗體不僅僅要滿足高親和力和不同表位的要求，對其所針對的表位還要進行選擇，才能克服來自結構類似物以及基質環境的干擾，對目標蛋白藥物分子進行準確定量，并滿足靈敏度和檢測范圍的要求。
[0011]現有的文獻資料并無對生物蛋白藥物藥代動力學研究定量分析ELISA夾心法建立，包括抗體對篩選方法的系統報道，傳統、常規的ELISA抗體對篩選方法并不能滿足復雜基質以及存在大量結構類似物的條件下對目標藥物蛋白進行定量檢測的需求。所以一種能使得整個篩選過程更加系統，篩選得到的抗體對能夠針對蛋白藥物與靶點的結合表位，最大程度的滿足特異性檢測目標蛋白藥物的要求，排除結構類似物以及復雜基質對檢測的干擾，利用篩選得到的抗體對所構建的ELISA夾心法具有較好的靈敏度和檢測范圍，能夠滿足實際針對蛋白藥物包括多肽類、融合蛋白、單克隆抗體藥物等進行臨床前或臨床藥代動力學研究的檢測需求的針對蛋白藥物藥代動力學研究的ELISA檢測用特異性抗體對的篩選方法是十分必須的。

【發明內容】

[0012]本發明的一個目的是針對上述現有技術的不足，提供一種在進行生物蛋白藥物藥代動力學研究時，具有較好的靈敏度和檢測范圍，排除結構類似物以及復雜基質對檢測的干擾的針對該蛋白藥物的定量ELISA夾心法檢測用特異性抗體對的篩選方法。
[0013]為實現上述目的，本發明提供的針對蛋白藥物藥代動力學研究的ELISA檢測用特異性抗體對的篩選方法，其特征在于，包括下列步驟:
[0014]a.初步篩選能夠用于ELISA夾心法檢測蛋白藥物的抗體對，包括捕獲抗體和檢測抗體；
[0015]b.檢測確認所篩選捕獲抗體和檢測抗體能夠阻斷蛋白藥物與其作用靶點的結合；
[0016]c.檢測確認所篩選捕獲抗體和檢測抗體是針對蛋白藥物與其作用靶點的結合表位；
[0017]d.檢測確認利用所篩選捕獲抗體和檢測抗體對建立ELISA夾心法能用于不同基質中的樣品檢測。
[0018]較佳的,所述的ELISA檢測包括但不限于固相反應和液相反應。
[0019]較佳的，所述的蛋白藥物包括但不限于單克隆抗體藥物、融合蛋白、多肽類藥物等
[0020]較佳的，在步驟a中，所述的檢測蛋白藥物的抗體對是針對蛋白藥物的單克隆抗體。
[0021]較佳的，在步驟b中，所述的檢測包括但不限于競爭性ELISA檢測。
[0022]較佳的，在步驟d中，所述的基質包括但不限于鹽離子緩沖液、培養基、人血清、動物血清、尿液、唾液等。
[0023]本發明的有益效果具體在于:采用本發明的方法，能夠在已經初步篩選得到一些可用于ELISA夾心法檢測蛋白藥物的抗體對的基礎上，比較系統全面的進一步篩選得到能夠滿足蛋白藥物藥代動力學研究所需的抗體對。利用篩選所得抗體對所建立的針對藥物蛋白的ELISA夾心法具有較優的靈敏度和檢測范圍，能夠排除結構類似物以及復雜基質環境對ELISA定量檢測的干擾，滿足蛋白藥物包括多肽、融合蛋白、單克隆抗體藥物等進行臨床前或臨床藥代動力學研究的檢測需求。
[0024]本發明在常規ELISA抗體對篩選的基礎上對抗體對的檢測特異性進行進一步篩選，直接針對蛋白藥物與靶點間的作用位點，與此同時還對抗體對在不同基質環境中的檢測情況進行考察。利用最終篩選得到的抗體對構建的ELISA夾心法具有較優的檢測限和檢測范圍，能夠滿足在結構類似物以及復雜基質環境中對目標蛋白藥物的檢測需要，為生物藥物的藥代動力學研究提供實驗工具。
[0025]本方法能夠比較全面、系統、高效的對蛋白藥物藥代動力學研究的ELISA檢測用特異性抗體對進行篩選，篩選得到的捕獲抗體分子和檢測抗體分子是特異性的針對蛋白藥物與作用靶點的結合位點，能夠阻斷蛋白藥物與作用靶點的結合，且不受各種基質環境的影響，基于該抗體對建立的ELISA夾心法在不同基質環境下反應，均具有較優的檢測范圍和檢測限，能夠滿足針對不同多肽類、融合蛋白、單克隆抗體等生物蛋白藥物的臨床前及臨床藥代動力學研究的檢測需求。
【具體實施方式】
[0026]為了能夠更清楚地理解本發明的技術內容，特舉以下實施例詳細說明。
[0027]本發明方法的具體步驟如下:
[0028]步驟一:利用常規ELISA抗體對篩選技術針對目標蛋白藥物進行抗體對篩選，包括捕獲抗體和檢測抗體，篩選得到的抗體對能夠對蛋白藥物進行ELISA檢測，并且具有較優的檢測靈敏度和檢測范圍。這些捕獲抗體或檢測抗體分子都滿足針對蛋白藥物的某特定表位。
[0029]步驟二:將步驟一中篩選得到的捕獲抗體或檢測抗體分別包被在96孔板中，接著加入標記有顯色基團的蛋白藥物，和一定量的蛋白藥物作用的目標靶分子，在96孔板中進行競爭性的結合反應。反應一段時間后考察顯色基團的信號值。該實驗的目的是檢測確認篩選得到的捕獲抗體或檢測抗體是否能夠阻斷蛋白藥物與其作用靶點的結合，挑選阻斷成功的待篩選抗體分子進行后續步驟。
[0030]步驟三:將步驟二中得到的抗體分子進行進一步的篩選確認它們針對的是蛋白藥物與作用靶點間的結合表位。先將抗體分子分別標記生物素和顯色化合物，分別得到標記生物素的抗體分子和標記顯色化合物的抗體分子。根據蛋白藥物與靶點的結合位點出現的位置，選擇合適的蛋白水解酶對蛋白藥物進行酶切，得到含有前述結合位點的蛋白藥物的酶切肽段。然后利用包被親和素的ELISA板，以標記生物素的抗體分子為捕獲抗體，標記顯色化合物的抗體分子為檢測抗體，對含有結合表位的蛋白藥物的酶切肽段進行ELISA檢測，篩選合適的能夠用于該酶切肽段ELISA夾心法檢測的抗體對，滿足具有較優的檢測靈敏度和檢測范圍。
[0031]步驟四:選擇蛋白藥物臨床前或臨床藥代動力學研究檢測過程中可能涉及的不同基質環境，對經步驟三篩選得到的抗體對進行更進一步的篩選。在一般Buffer以及各種基質環境下，利用分別標記生物素和顯色化合物的抗體對，對蛋白藥物進行ELISA檢測，比較不同基質環境下，方法的檢測靈敏度及檢測范圍，挑選受基質環境影響最小的抗體對。
[0032]針對某生物大分子單克隆抗體藥物藥代動力學研究ELISA夾心法檢測用特異性抗體對的篩選。
[0033]1、實驗目的
[0034]針對某大分子單克隆抗體藥物的臨床藥代動力學研究建立ELISA夾心檢測法，在人血清樣品中對該蛋白藥物進行定量分析，該大分子單克隆抗體藥物的作用靶點是某細胞因子。用于ELISA夾心法建立的抗體對來自于通過免疫小鼠雜交瘤融合技術得到的若干針對該單克隆抗體藥物的特異性抗體，從這些抗體中篩選出合適的抗體對構建ELISA分析方法。
[0035]2、實驗過程及結果
[0036]步驟一:利用商品化試劑盒(氨基活化偶聯法)分別對待篩選的針對蛋白藥物的10個特異性抗體Mabl-1O分別偶聯生物素(Biotin)和偶聯辣根過氧化物酶(HRP)，分別檢測是否成功偶聯，接著以包被親和素(Avidin)的ELISA孔板，以偶聯生物素的抗體為捕獲抗體，偶聯HRP標記的抗體為檢測抗體，對一定量的蛋白藥物進行ELISA檢測，考察檢測信號，并從中篩選出能夠用于ELISA檢測用的6組抗體對(Mabl-B，Mab6_H)、(Mab2_B，Mab7_H)、(Mab2-B, Mab8-H)、(Mab3_B, Mab6_H)、(Mab4_B, Mabl-H)、(Mab5_B, Mab6_H)。
[0037]步驟二:待篩選抗體是否能夠阻斷蛋白藥物與作用靶點的結合:對步驟一中篩選得到的5組抗體對，共8個單抗是否具有阻斷蛋白藥物與作用靶點結合的性質進行考察。取包被有羊抗鼠IgG的ELISA板，分別加入8個特異性單抗與羊抗鼠IgG偶聯，并對ELISA板未偶聯蛋白的區域用BSA (牛血清白蛋白)封閉。接著加入標記有辣根過氧化物酶(HRP)的蛋白藥物和一定量的該蛋白藥物作用的目標細胞因子，此時偶聯在ELISA板上的特異性待篩選單抗以及目標細胞因子與帶HRP標記的蛋白藥物競爭性結合，如果待篩選單抗能夠阻斷蛋白藥物和靶點的相互作用，則與待篩選單抗結合的蛋白藥物就較少，相對于沒有加入目標細胞因子的檢測信號則較低。結果見表1，“ + ”越多則代表相對于沒有加入目標細胞因子的情況下，HRP檢測信號越強。可以發現MabS對應的相對檢測結果的信號值較強，說明它并不能阻斷蛋白藥物與靶點的結合，并不是特異性的針對蛋白藥物與靶點的結合表位，不適合用于蛋白藥物的藥代動力學研究。排除抗體對(Mab2-B, Mab8-H)進行下一輪的篩選。
[0038]表1待篩選抗體競爭性ELISA檢測
[0039]
【權利要求】
1.一種針對蛋白藥物的ELISA檢測用特異性抗體對的篩選方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟一:初步篩選能夠用于ELISA夾心法檢測蛋白藥物的抗體對，包括捕獲抗體和檢測抗體； 步驟二:經過第一次檢測確認所述的捕獲抗體和所述的檢測抗體能夠阻斷蛋白藥物與其作用靶點的結合； 步驟三:經過第二次檢測確認所述的捕獲抗體和所述的檢測抗體是針對蛋白藥物與其作用靶點的結合表位； 步驟四:經過第三次檢測確認利用所述的捕獲抗體和所述的檢測抗體對建立ELISA夾心法能用于不同基質中的樣品檢測。
2.根據權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述的ELISA夾心法檢測的過程包括固相反應和液相反應。
3.根據權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述的蛋白藥物包括單克隆抗體藥物、融合蛋白、多肽類藥物。
4.根據權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述的抗體對為針對蛋白藥物的單克隆抗體。
5.根據權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述的第一次檢測的過程包括競爭性ELISA檢測。
6.根據權利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述的不同基質包括鹽離子緩沖液、培養基、人血清、動物血清、尿液以及唾液。
【文檔編號】G01N33/68GK103926411SQ201410161717
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年4月22日 優先權日:2014年4月22日
【發明者】王少雄, 呂品 申請人:王少雄, 呂品