專利名稱：：一種檢測甲狀腺球蛋白抗體的化學發光免疫分析測定試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發明屬于醫學臨床血液免疫檢測分析領域,具體的提供了一種檢測靈敏高、試劑穩定性好，操作時間短、步驟簡單且對操作人員無放射性危害的曱狀腺球蛋白抗體化學發光免疫測定試劑盒。
背景技術：
：甲狀腺球蛋白(Tg)是一種相對分子量為660KD的糖蛋白，其抗體(Anti-Tg)是自身免疫性甲狀腺疾病(AITD)的重要標志物，具有較高的診斷意義。Anti-Tg包括IgGl、IgG2、IgG3和gG44個亞目，以IgGl和IgG4占優勢，但IgG2功能活性最高。Anti-Tg與曱狀腺球蛋白(Tg)結合后，通過FC受體與結合抗體的相互作用激活NK細胞而攻擊輩巴細胞，導致曱狀腺細胞^s皮壞。Anti-Tg可以影響Tg抗原的攝取、加工，因而可以增強或抑制非顯性致病性T細胞抗原決定簇的產生及遞呈，進而影響AITD時的細胞免疫。Anti-Tg對致病性曱狀腺球蛋白T細胞抗原決定簇的識別可以呈現中性、抑制或增強效應，這主要取決于Anti-Tg所識別的抗原決定簇有無個體遺傳背景，在某些AITD患者，其凈效應可能是加重疾病以及對非顯性T細胞抗原決定簇自身免疫反應的擴大，從而導致AITD的發生及惡化。Anti-Tg與Tg結合位點上存在著酶的催化位點，因此，Anti-Tg有酶活性，可以催化Tg水解，導致血及曱狀腺中Tg減少。血中Tg的減少可以降低機體免疫系統對Tg的暴露，因而對Tg的自身免疫反應減弱。另一方面，由于曱狀腺激素合成依賴曱狀腺過氧化物酶(TPO)對天然Tg的識別，因此，Tg減少必然導致T3、T4合成減少。值得注意的是，分泌Anti-Tg的B淋巴細胞主要存在于甲狀腺內，當甲狀腺內Anti-Tg積累到一定濃度時，不僅Tg分解增加，也可導致其它與Tg無關的蛋白發生水解，從而可能造成全身性的蛋白作用增強及組織損傷。由于傳統的放射免疫分析方法具有對操作人員有放射性危害、廢棄物處理問題、產品保質期短、操作時間長等問題，而酶聯免疫分析法的靈敏度較低，存在操作步驟繁瑣，操作時間周期長，易造成結果假陽性或假陰性等問題，從而需要人們尋找一種更為安全、靈敏和可靠的免疫檢測分析方法。本發明采用高活性的辣根過氧化物酶(HRP)標記二抗，以雙氧水、魯米諾及增強劑為發光底物，其原理是HA在HRP作用下氧化魯米諾使其達到激發態，當其回到基態時發出420-515nm的光，再通過發光分析儀來檢測光信號。HRP酶促發光10分鐘即可達到發光高峰，可縮短操作時間，同時微孔板反應模式有利于進行樣品的批量檢測，適合于我國的現有國情。
發明內容本發明避免了放射免疫分析中放射性物質對操作人員的放射性危害，解決了放射性廢棄物的處理問題，使產品的保存期更長；與酶聯免疫分析方法相比，操作步驟更加簡化，大大提高了分析方法的靈敏度，并節省了操作時間。因此本發明提供了一種能夠簡便、快速、靈敏、穩定地檢測曱狀腺球蛋白抗體的試劑盒，并且使該試劑盒更適用于小中型醫院的推廣應用。首先，本發明提供了一種化學發光免疫分析測定曱狀腺球蛋白的試劑盒。根據本發明的試劑盒包括曱狀腺球蛋白抗體校準品；曱狀腺球蛋白包被的固相載體；辣根過氧化物酶標記的抗人IgG;化學發光底物液；以及濃縮洗滌液。根據本發明的試劑盒，其中，所述固相載體為微孔板、塑料珠或塑料管。根據本發明的試劑盒，所述化學發光底物液包含A液和B液，其中，所述化學發光底物A液，包括10mM魯米諾、0.3mM4-羥基聯苯、0.05mM4-碘苯硼酸、0.2MpH8.7硼酸-硼砂緩沖液，其pH值為8.0~10.0;所述化學發光底物B液，包括3.5mM過氧化脲、0.1%Tween20、0.2MpH7.2磷酸鹽緩沖液，其pH值為7.0-7.6。根據本發明的試劑盒，所述濃縮洗滌液包括Na2HP04.12H20，87g;NaH2P042H20,3g;NaCl,240g;Tween—20,1.5mL;Proclin300,1.5mL;雙蒸水，定溶至1000mL;調整pH至7.2~7.4。使用時用雙蒸水稀釋30倍。其次，本發明提供了一種制備上述試劑盒的方法。其步驟如下以甲狀腺球蛋白抗體純品配制校準品；制備曱狀腺球蛋白包被的固相栽體；制備辣根過氧化物酶標記的抗人IgG;配制化學發光底物魯米諾或異魯米諾；分裝上述校準品、曱狀腺球蛋白包被的固相載體、酶標記物、化學發光底物液；濃縮洗滌液以及組裝為試劑盒。根據本發明的方法，所述曱狀腺球蛋白包被固相載體包括以下步驟采用0.05MpH值為7.2的磷酸鹽緩沖液與適當濃度的曱狀腺球蛋白混合制成包被液，并將其負載于固相載體上；封閉。具體地，所述包4皮方法可以包括1)包被采用可采用1000mL的0.05MpH值為7.2的磷酸鹽緩沖液，包含2.2g的磷酸二氬鈉、12.9g的磷酸氬鈉和9.Og的氯化鈉去離子水溶液，與適當濃度的曱狀腺球蛋白混合制成包被液，并將其負栽于固相載體上；2)封閉配制封閉液，基于1000mL所述封閉液包含0.2gNaH2P042H20、2.9gNaH2P04.12H20、100mL牛血清和lmLProclin300,所述封閉液的pH值為7.0~7.6，然后將所得封閉液負栽于上述固相載體上。在上述方法中，所述固相載體為微孔板、塑料珠或塑料管，優選的，甲狀腺球蛋白包被的微孔板為48或96孔的微孔板條；在上述方法中，選用過碘酸鹽氧化法偶聯辣根過氧化物酶與抗人IgG;在上述方法中，所述化學發光底物液包含A液和B液，其中，所述化學發光底物A液，包括lOraM魯米諾、0.3mM4-羥基聯苯、0.05mM4-碟苯硼酸、0.2MpH8.7硼酸-硼砂緩沖液，其pH值為8.0~10.0;所述化學發光底物B液，包括3.5mM過氧化脲、0.1%Tween20、0.2MpH7.2磷酸鹽緩沖液，其pH值為7.0~7.6;在上述方法中，所述濃縮洗滌液包括Na2HP04.12H20,87g;NaH2P042H20,3g;NaCl,240g;Tween-20,1.5mL;Proclin300,1.5mL;雙蒸水，定溶至1000mL;調整pH至7.2~7.4。使用時用雙蒸水稀釋30倍；上述試劑盒所述曱狀腺球蛋白抗體純品配制的校準品的原料為標準級，純度不低于90%。本發明的試劑盒應用酶催化發光底物，通過檢測發光底物產生的光信號代替酶聯免疫分析中的顯色底物，具有與酶聯免疫分析同等的特異性，而檢測光信號的靈敏度要比檢測顯色底物的吸光度要靈敏的多。利用本發明的試劑盒進行檢測，靈敏度高，特異性強，檢測范圍寬，操作簡單，無放射性污染，試劑盒成本低，臨床適用性強，更適用于我國中小型醫院的臨床檢測。圖1為實施例1所制備的試劑盒校準曲線的線性圖。具體實施例方式實施例1制備本發明的甲狀腺球蛋白抗體化學發光免疫分析測定試劑盒L、酶標抗體的制備及酶標抗體濃度選定l.抗人IgG用過碘酸鹽氧化法與辣根過氧化物酶偶聯，用PBS充分透析，加等體積甘油，-20。(3以下<呆存。具體的(1)酶的氧化(全過程避光)a)稱取HRP5mg,加雙蒸水250nL溶解；b)稱取NaI045mg，加雙蒸水250pL溶解，配制成20mg/mL的濃度；c)往HRP溶液中逐滴加入NaI(V溶液，邊加邊攪拌；d)將混合好的溶液置于4°C,靜置30min;e)取5mL乙二醇溶于25nL雙蒸水中，逐滴加入上述混合溶液中，邊加邊攪拌；f)室溫靜置30min;g)酶氧化過程完成，HRP終濃度為10mg/mL。(2)抗體的準備與標記(避光)a)調整抗體濃度到約5mg/niL,用0.05MC.B透析去除甘油等雜質，4'C過夜透析，期間換透析液3次；b)將抗體與HRP按1:5混合，于0.05MC.B中透析6小時，依次換透析液；c)用新配制的NaBH4溶液終止反應，搖勻，4'C靜置2小時，每30min搖一次，NaBH4溶液加入量要適中；d)用0.02MPBS緩沖液過夜磁力攪拌透析，期間換一次透析液。(3)HRP酶標記抗體純化a)向完成標記的抗體溶液中逐滴加入等體積的飽和硫酸銨溶液，邊加邊攪拌；b)4。C靜置一小時，8000rpm離心10min，將上清液移至新管，沉淀用等體積PBS重新溶解；c)收集分離的各個組分，提純的HRP-抗體用PBS過夜透析；d)加入等體積甘油，-2(TC保存備用。2.所述酶標抗體稀釋液為:磷酸二氫鈉磷酸氳二鈉氯化鈉食品紅水解明膠Proclin300純化水0.2g2.9g8.8g1.0mL10g1.0mL1000mL3.酶標抗體濃度選定采用方陣法選擇酶標抗體的工作濃度范圍為1:500-5000。二、甲狀腺球蛋白抗體校準品的制備用含100%小牛血清稀釋甲狀腺球蛋白抗體純品配制校準品，濃度點分別為50、125、500、1000、2000IU/mL，S。為稀釋液，分裝成每瓶0.5mL，-20'C保存。三、固相微孔板制備(1)包被采用1000mL的0.05MpH值為7.2的磷酸鹽緩沖液，包含2.2g的磷酸二氫鈉、12.9g的磷酸氫鈉和9.0g的氯化鈉去離子水溶液，與適當濃度的甲狀腺球蛋白混合制成包被液，并將其負載于固相載體上；具體地，包被緩沖液包括以下組分<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>溶解混勻后，調整pH至7.2,加入適量曱狀腺球蛋白混勻，然后加入微孔板各孔中，每孔110pL,4'C過夜。甩掉封閉液，在吸水紙上拍干。(2)封閉，所述封閉液包含以下組分<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>將上述試劑稱量好放入潔凈容器中，加雙蒸水定容，溶解混勻，測定pH值為7.0。每孔分別加入封閉液300pL,室溫放置3小時。甩掉封閉液，在吸水紙上拍干。室溫除濕干燥24小時。封袋貼簽后置2~8'C保存。四、化學發光底物液本發明所使用的辣根過氧化物酶(HRP)的化學發光底物液的配制方法lOOOmL所述化學發光底物A液，包括l.7716g魯米諾、0.051g4-羥基聯苯、0.012g4-石爽苯硼酸、11.4g硼酸、4.9g硼砂，其pH值為8.0~10.0;1000mL所述化學發光底物B液，包括0.329g過氧化脲、lmLTween20、51.58gNa2HP0412眼8.74gNaH2P04■2H20,其pH值為7,0~7.6。使用方法使用前將A液與B液按1:1比例混合后使用。五、洗滌緩沖液的配制方法<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>調整pH至7.2~7.4。使用時用雙蒸7jc稀釋30倍.六、組裝試劑盒將上述步驟所得產品分裝并組裝為試劑盒(附說明書)。隨機抽取樣品經過各項指標檢定合格才能出廠。實施例2~3制備本發明的甲狀腺球蛋白抗體化學發光免疫分析測定試劑盒除以分別以塑料珠、塑料管作為載體，其余均以與實施例l相同的方法制備曱狀腺球蛋白抗體化學發光免疫分析測定試劑盒。實施例4本發明的試劑盒的使用方法以上實施例1制備的曱狀腺球蛋白抗體化學發光免疫分析測定試劑盒的具體使用操作如下1)將包被好的固相栽體(微孔板條)、校準品/待測樣品、化學發光底物液、酶標記抗體從4°C冰箱中取出，放置15min,平衡至室溫；2)將包被好的微孔板條固定在板架上；3)洗滌緩沖液的配制將試劑盒提供的洗滌液緩沖液加雙蒸水30倍稀釋；4)在反應孔中分別加待測樣品和各濃度校準品各50|aL,室溫溫育30min，洗板5次，在吸水紙上拍干；5)每孔(除空白孔以外)各加酶標記物100iuL,于微量振蕩器上振蕩30秒混勾，室溫溫育30min,洗^反5次，在吸水紙上拍干；6)每孔各加化學發光底物100uL，振蕩混勻，室溫(20-28°C)反應5分鐘；7)在化學發光測量儀上依序測量各孔的發光強度(RLU),測量時間1秒/孔；8)分別對校準品濃度和對應RLU取對數，在雙對數坐標圖上建立標準曲線，以校準品濃度為橫坐標，RLU值為縱坐標繪出標準曲線，見附圖1，以各待測血清RLU值即可在標準曲線上查出該血清的曱狀腺球蛋白抗體的濃度；9)打印檢測結果報告。實施例5本發明的試劑盒的方法學檢定按照本領域中常規的制造及檢定規程對實施例1中制備的試劑盒進行檢定，結果見表l:表l試劑盒的技術指標檢測結果檢驗項目檢驗標準檢驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>以上結果表明"曱狀腺球蛋白抗體化學發光免疫分析測定試劑盒"的準確性、特異性、精密性、靈敏度和穩定性均符合要求。實施例6本發明的試劑盒對臨Ajfe樣檢測結果按照實施例4操作步驟對100例臨床診斷血樣進行測定，臨床血樣由65例正常樣本、21例曱尤樣本和14例曱減樣本組成。測定的結果見表2:表2:對100例臨床診斷血樣的測定結果(Anti-Tg單位IU/mL)<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>使用本發明試劑盒對100例臨床診斷血樣進行測定，測定結果顯示65例正常人樣本測值均小于125IU/mL;21例甲亢樣本測值中有10例陽性樣本,陽性檢出率為47.6%;14例曱減樣本測值中有9例陽性樣本，陽性檢出率為64.3%。權利要求1、一種甲狀腺球蛋白抗體化學發光免疫分析測定試劑盒，其特征在于，所述試劑盒組分有甲狀腺球蛋白抗體校準品；甲狀腺球蛋白包被的固相載體；辣根過氧化物酶標記的抗人IgG；化學發光底物液；以及濃縮洗滌液。2、如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述甲狀腺球蛋白包被的固相栽體是微孔板、塑料珠或塑料管。3、如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒使用的固相栽體材料為透明聚苯乙烯、聚乙烯或者聚丙烯。4、如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述化學發光底物液包含A液和B液，其中，所述化學發光底物A液，包括10mM魯米諾、0.3mM4-羥基聯苯、0.05mM4-碘苯硼酸、0.2MpH8.7硼酸-硼砂緩沖液，其pH值為8.0~10.0;所述化學發光底物B液，包括3.5mM過氧化脲、0.1%Tween20、0.2MpH7.2磷酸鹽緩沖液，其pH值為7.0-7.6。5、一種制備權利要求1所述試劑盒的方法，其特征在于，包括以下步驟以甲狀腺球蛋白抗體純品配制校準品；以甲狀腺球蛋白包被的固相載體；用辣根過氧化物酶標記的抗人IgG;配制化學發光底物液；配制濃縮洗滌液；分裝以上各組分并組裝為成品。6、如權利要求5所迷的方法，其特征在于，所述曱狀腺球蛋白包被固相載體的步驟，采用以下方法采用0.050MpH值為7.2的磷酸鹽緩沖液與適當濃度的曱狀腺球蛋白混合制成包被液，并將其負載于固相載體上；配制封閉液，基于1000mL所述封閉液包含0.2gNaH2P042H20、2.9gNaH2P04.12H20、lOOmL牛血清和lmLProclin300，所述封閉液的pH值為7.0-7.6,然后將所得封閉液負栽于上述固相栽體上；干燥密封裝袋后備用。7、如權利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述曱狀腺球蛋白包被的固相載體為微孔板、塑料珠或塑料管。8、如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述化學發光底物液包含A液和B液，其中，所述化學發光底物A液，包括10mM魯米諾、0.3mM4-羥基聯苯、0.05raM4-碟苯硼酸、0.2MpH8.7硼酸-硼砂緩沖液，其pH值為8.0~10.0;所述化學發光底物B液，包括3.5mM過氧化脲、0.1%Tween20、0.2MpH7.2磷酸鹽緩沖液，其pH值為7.0~7.6。9、如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述濃縮洗滌液包括Na2HP04.12H20,87g;NaH2P042H20,3g;NaCl,240g;Tween-20，1.5mL;Proclin300,1.5mL;雙蒸水，定溶至1000mL;調整pH至7.2~7.4，使用時用雙蒸水稀釋30倍。全文摘要本發明提供了一種應用于臨床血液免疫檢測分析領域的甲狀腺球蛋白抗體的測定試劑盒及其制備方法。本發明試劑盒采用化學發光免疫分析技術和抗體間接法反應模式，其優點在于檢測靈敏高、試劑穩定性好，操作時間短、步驟簡單且對操作人員無放射性危害。文檔編號G01N21/76GK101377511SQ20081010414公開日2009年3月4日申請日期2008年4月16日優先權日2008年4月16日發明者于尚永,宋勝利,應希堂,胡國茂,鄭金來,輝靳申請人:北京科美東雅生物技術有限公司