專利名稱：乙基對硫磷人工半抗原、人工抗原、抗體制備法及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種乙基對硫磷人工半抗原、人工抗原、特異抗體制備方法及其用途，屬于農藥免疫化學技術領域。
背景技術：
乙基對硫磷是一種應用廣泛的高毒有機磷酸酯類殺蟲劑，主要用于防治水稻、棉花、玉米等農作物上的多種害蟲。乙基對硫磷毒性分級屬高毒類，有“三致”作用。侵入途徑分為吸入、食入、經皮吸收。誤食被乙基對硫磷污染的食物(包括瓜果、蔬菜、乳品、糧食以及被毒死的禽畜、水產品等)，對人體健康危害極大，急性中毒表現為抑制膽堿酯酶活性，造成神經生理功能紊亂；慢性中度癥狀一般并不很明顯，臨床表現多為神經衰弱綜合癥，部分患者可出現毒蕈堿樣和煙堿樣癥狀，少數患者還可有屈光不正、視野縮小、色覺障礙等視覺功能損害，可有神經-肌電圖改變和腦電圖異常。
由于乙基對硫磷毒性較高，近年來已被禁止在蔬菜、水果上使用，但在農產品的進出口貿易、食品和環境安全的監督檢測中，乙基對硫磷等一類高毒化合物仍然是常規檢測的重要污染物。而且，乙基對硫磷與其它農藥的復配也日益增多。迫切需要能夠快速檢測農產品中乙基對硫磷的殘留量的方法，以保證人民群眾的健康安全，以及我國農產品的順利出口。
傳統的檢測乙基對硫磷的方法有氣相色譜(GC)，液相色譜(HPLC)或質譜(MS)等，樣品前處理過程復雜、工作量大、儀器昂貴、要求有熟練的技術人員及較長的分析周期，而且微量的目標分析物容易丟失，難以滿足大量樣本和現場快速檢測的需要。免疫分析為乙基對硫磷的快速殘留分析提供了一個新的分析檢測途徑。

發明內容
針對現有技術中存在的不足之處，本發明提供乙基對硫磷人工半抗原、人工抗原、特異抗體制備方法及其用途，該抗體用于快速、準確檢測乙基對硫磷的殘留量。
本發明為達到以上目的，是通過這樣的技術方案來實現的提供一種乙基對硫磷(PA)人工半抗原，其分子結構式為
其中n＝1～6。
上述乙基對硫磷人工半抗原，優選的分子結構式為 其化學名稱為4-(O-乙基-O-4-硝基酚硫代磷酰基)氨基丁酸(簡稱為PB)；或 其化學名稱為6-(O-乙基-O-4-硝基酚硫代磷酰基)氨基己酸(簡稱為PC)。
這種乙基對硫磷(PA)人工半抗原制備方法的步驟為1)按投料比無水乙醇三氯硫磷為3∶1，在三口燒瓶中投入三氯硫磷，冰浴下攪拌緩慢滴加無水乙醇，加畢，繼續在0～4℃下反應1h，0℃冰水洗滌，即得產物O-乙基硫代磷酰二氯。
2)按投料比三乙胺∶O-乙基硫代磷酰二氯∶對硝基苯酚＝6.7∶1.3∶1，在三口燒瓶中投入三乙胺后，再投入溶解于20mL乙腈的O-乙基硫代磷酰二氯溶液，然后加入溶解于15mL乙腈的對硝基苯酚溶液，室溫下攪拌反應1h。布氏漏斗抽濾，過無水硫酸鈉，濃縮揮發乙腈，得淡黃色油狀物。經硅膠柱層析純化得產物O-乙基-O-4-硝基酚硫代磷酰一氯。
3)按投料比氫氧化鈉∶氨基丁酸∶O-乙基-O-4-硝基酚硫代磷酰一氯＝2.5∶1.2∶1。在三口燒瓶中投入溶解于15mL二氧六環的O-乙基-O-4-硝基酚硫代磷酰一氯，加入微量催化冰浴攪拌下緩慢滴加10mL的氫氧化鈉和氨基丁酸的混合水溶液。滴加完畢后，升溫至20℃，反應4h。反應完畢后，用0.1mol/L稀鹽酸調節反應液pH值至4.0左右，用氯仿3×20mL提取，合并氯仿提取液，過無水硫酸鈉，濃縮揮發氯仿，得淡黃色油狀物。經硅膠柱層析純化得產物4-(O-乙基-O-4-硝基酚硫代磷酰基)氨基丁酸(PB)或6-(O-乙基-O-4-硝基酚硫代磷酰基)氨基己酸(PC)。
本發明還提供了一種乙基對硫磷人工抗原，其分子結構式為
其中n＝1～6。
上述乙基對硫磷人工抗原，優選的分子結構式為 本發明還提供了一種乙基對硫磷特異性抗體，其是用分子結構式為 其中n＝1～6的乙基對硫磷人工抗原免疫兔子或白鼠所得到的、能與乙基對硫磷發生特異性免疫反應的單克隆或多克隆免疫球蛋白G。
本發明還提供了上述乙基對硫磷半抗原的用途是用作動物免疫的抗原體系的原料。
本發明還提供了上述乙基對硫磷特異性抗體的用途用于檢測食品、農產品和環境樣品中乙基對硫磷的殘留量。
作為本發明的乙基對硫磷特異性抗體的用途的改進環境樣品為土壤樣品或水樣品。
本發明通過設計合成乙基對硫磷人工半抗原和人工抗原，經免疫動物產生特異性抗體，以抗原抗體特異性免疫學反應為基礎，并引入標記物來放大顯示這一反應，則可用于樣本測定。其選擇性取決于免疫學反應的特異性，其靈敏度取決于抗體的親合性和標記物的可檢性。因此，可快速準確地分析檢測乙基對硫磷在樣本中的殘留量。這種方法靈敏度高、特異性強，最低檢測限可達6ug/L，樣品前處理簡單，便于進行現場監控，可以與常規方法互為補充。
具體實施例方式
1 乙基對硫磷人工半抗原的合成基于乙基對硫磷本身不具備能與蛋白質結合的特征基團，必須通過引入連接臂的方法才能與蛋白質偶聯免疫兔子得到抗體。
為了讓半抗原的結構特征充分暴露，可在P原子位點上接上一個連接臂。據此以三氯硫磷為起始原料，同時以無水乙醇、對硝基苯酚，氨基丁酸或氨基己酸等為原料，經過三步反應，合成了半抗原4-(O-乙基-O-4-硝基酚硫代磷酰基)氨基丁酸(簡稱為PB)或6-(O-乙基-O-4-硝基酚硫代磷酰基)氨基己酸(簡稱為PC)。產物PB和PC純化后分別經質譜(ESI)和核磁共振氫譜(1H-NMR)鑒定，并與類似已知的化合物數據比較確證。
主要半抗原的結構如下 2 人工抗原的合成免疫原的合成采用碳二亞胺法。將0.2mmol的半抗原PB(或PC)溶解在N，N-二甲基甲酰胺中，加入1.5當量的二環己基碳二亞胺和3當量的N-羥基琥珀酰亞胺，室溫下反應過夜，離心，取上清液加入到10～20mg/mL的牛血清蛋白碳酸鹽緩沖溶液中，攪拌反應1～6小時，裝入透析袋，分別用蒸餾水和0.01mol/L的PBS緩沖溶液透析3～5d，分裝保存于-20℃的冰箱中。
包被抗原的合成利用混合酸酐法。將0.25毫摩爾半抗原PB(或PC)溶解在N，N-二甲基甲酰胺中，加入60μL正三丁胺和30μL氯甲酸丁酯，室溫下反應1～2小時，反應液加入到10～20mg/mL的卵清蛋白(OVA)碳酸鹽緩沖溶液中，攪拌反應1～4小時，裝入透析袋，分別用蒸餾水和0.01mol/L的PBS緩沖溶液透析3～5d，分裝保存于-20℃的冰箱中。
按照合成乙基對硫磷免疫原和包被抗原時反應物和產物的比例，分別取反應物和產物進行紫外(200nm～400nm)分析。偶聯物與半抗原PB、PC、BSA和OVA的吸收峰相比，發生了明顯的變化，表明人工抗原PB-BSA、PB-OVA、PC-BSA、PC-OVA的合成是成功的。
經計算半抗原與蛋白質的結合比如下PB-BSA 10～30∶1PC-BSA 15～30∶1PB-OVA 2～10∶1 PC-OVA 3～8∶13 抗體的制備及乙基對硫磷酶聯免疫分析方法的建立兩種免疫原復合物(PB-BSA、PC-BSA)按常規方法各免疫了三只兔子。從加強免疫第二次開始，在每次免疫后第8天于兔子耳緣靜脈采血，血清經適當稀釋后用間接ELISA測定效價。待第4次免疫時，兔子獲得了高效價的抗體，經純化制成凍干粉后的效價分別為2.2×106、1.8×106。
利用乙基對硫磷抗原抗體免疫反應和酶促反應建立乙基對硫磷酶聯免疫分析法。在檢測分析蔬菜與水果等樣品中乙基對硫磷殘留時具有很高的特異性和靈敏度，與類似化合物的交叉反應率低，同時操作方法簡單快速，不需要復雜的前處理過程，一次可同時檢測大批樣品，成本低廉，對操作人員的要求低，便于進行現場監控，可以與常規方法互為補充。
實施例1、半抗原PB的合成1)將三氯硫磷80.0g(0.46mol)裝入三口燒瓶中，磁力攪拌，冰浴下-5℃時開始緩慢滴加無水乙醇79.35mL(1.38mol)，加畢，繼續在0～4℃下反應1h，0℃冰水洗滌產物，過無水硫酸鈉，即得產物O-乙基硫代磷酰二氯。
2)按投料比三乙胺∶O-乙基硫代磷酰二氯∶對硝基苯酚∶＝6.7∶1.3∶1，在三口燒瓶中投入三乙胺20g后，O-乙基硫代磷酰二氯6.23g(27.8mmol)溶解于20mL乙腈，對硝基苯酚3.0g(21.6mmol)溶解于15mL乙腈中，兩種溶液一起轉入三口燒瓶中，室溫下攪拌反應1h。布氏漏斗抽濾，過無水硫酸鈉，濃縮揮發乙腈，得淡黃色油狀物。經硅膠柱層析純化得產物O-乙基-O-4-硝基酚硫代磷酰一氯。
3)按投料比氫氧化鈉∶氨基丁酸∶O-乙基-O-4-硝基酚硫代磷酰一氯＝2.5∶1.2∶1。在三口燒瓶中投入O-乙基-O-4-硝基酚硫代磷酰一氯3.16g(11.25mmol)溶解于15mL二氧六環，加入微量催化劑。氫氧化鈉1.13g(28.13mmmol)與1.27g(12.38mmol)氨基丁酸配成10mL的混合水溶液。冰浴攪拌下緩慢滴加此混合水溶液至三口反應瓶中。滴加完畢后，升溫至20℃，反應4h。反應結束后，用0.1mol/L稀鹽酸調節反應液pH值至4.0左右，用氯仿3×20mL提取，合并氯仿提取液，過無水硫酸鈉，濃縮揮發氯仿，得淡黃色油狀物。經硅膠柱層析純化得產物4-(O-乙基-O-4-硝基酚硫代磷酰基)氨基丁酸(PB)。
取上述合成的產物分別經ESI、1H-NMR和IR測定其分子結構。該物質的ESI分子離子峰為349[M-H]-，由此可知該物質，分子量為348。1H-NMR(CDCl3)為δ8.23(2H，d，J＝8.8，ArH)，7.37(2H，d，J＝8.0，ArH)，4.21(2H，m，CH2OP)，3.40(1H，m，NH)，3.18(2H，m，CH2NH)，2.47(2H，m，CH2COOH)，1.87(2H，m，CH2CH2CH2)，1.38(3H，t，J＝6.8，CH3)。
從以上分析綜合可知，所合成的產物為目標物。
實施例2、半抗原PC的合成1)將三氯硫磷80.0g(0.46mol)裝入三口燒瓶中，磁力攪拌，冰浴下-5℃時開始緩慢滴加無水乙醇79.35mL(1.38mol)，加畢，繼續在0～4℃下反應1h，0℃冰水洗滌產物，過無水硫酸鈉，即得產物O-乙基硫代磷酰二氯。
2)按投料比三乙胺∶O-乙基硫代磷酰二氯∶對硝基苯酚∶＝6.7∶1.3∶1，在三口燒瓶中投入三乙胺20g后，O-乙基硫代磷酰二氯6.23g(27.8mmol)溶解于20mL乙腈，對硝基苯酚3.0g(21.6mmol)溶解于15mL乙腈中，兩種溶液一起轉入三口燒瓶中，室溫下攪拌反應1h。布氏漏斗抽濾，過無水硫酸鈉，濃縮揮發乙腈，得淡黃色油狀物。經硅膠柱層析純化得產物O-乙基-O-4-硝基酚硫代磷酰一氯。
3)按投料比氫氧化鈉∶氨基丁酸∶O-乙基-O-4-硝基酚硫代磷酰-氯＝2.5∶1.2∶1。在三口燒瓶中投入O-乙基-O-4-硝基酚硫代磷酰一氯2.88g(10.23mmol)溶解于15mL二氧六環中，加入微量催化劑。氫氧化鈉1.02g(25.58mmmol)與1.61g(12.28mmol)氨基己酸配成10mL的混合水溶液。冰浴攪拌下緩慢滴加此混合水溶液至三口反應瓶中。滴加完畢后，升溫至20℃，反應4h。反應結束后，用0.1mol/L稀鹽酸調節反應液pH值至4.0左右，用氯仿3×20mL提取，合并氯仿提取液，過無水硫酸鈉，濃縮揮發氯仿，得淡黃色油狀物。經硅膠柱層析純化得產物6-(O-乙基-O-4-硝基酚硫代磷酰基)氨基己酸(PC)。
取上述合成的產物分別經ESI、1H-NMR和IR測定其分子結構。該物質的ESI分子離子峰為377[M-H]-，由此可知該物質，分子量為376。1H-NMR(CDCl3)為δ8.24(2H，d，J＝8.8，ArH)，7.38(2H，d，J＝8.8，ArH)，4.20(2H，q，CH2OP)，3.41(1H，s，NH)，3.10(2H，m，CH2NH)，2.38(2H，m，CH2COOH)，1.41～1.67(6H，m，3×CH2)，1.39(3H，m，CH3)。
從以上分析綜合可知，所合成的產物為目標物。
實施例3、人工抗原的合成3.1免疫原的合成與純化免疫原的合成利用碳二亞胺法。將0.2mmol半抗原PB，溶解在1mL的N，N-二甲基甲酰胺中，加入1.5當量的二環己基碳二亞胺和3當量的N-羥基琥珀酰亞胺，室溫下反應過夜，離心，取上清液100～800μL緩慢加入到4mL10mg/mL的牛血清蛋白(BSA)碳酸鹽緩沖溶液中，在磁力攪拌下反應1～6小時，裝入透析袋，先用蒸餾水透析2～4次，然后用0.01mol/L的PBS緩沖溶液透析3～5d，分裝保存于-20℃的冰箱中。
3.2包被抗原的合成與純化包被抗原的合成利用混合酸酐法。將0.25mmol半抗原PB溶解在1mL的N，N-二甲基甲酰胺中，加入60μL正三丁胺和30μL氯甲酸丁酯，室溫下反應1～2小時，反應液100μL～800μL加入到5mL10mg/mL的卵清蛋白(OVA)碳酸鹽緩沖溶液中，在磁力攪拌下反應1小時，然后裝入透析袋，先用蒸餾水透析3次，然后用0.01mol/L的PBS緩沖溶液透析3～5d，分裝保存于-20℃的冰箱中。
3.3人工抗原的鑒定按照合成乙基對硫磷免疫原和包被抗原時反應物和產物的比例，分別取反應物和產物進行紫外(200nm～400nm)掃描。
經計算半抗原與蛋白質的結合比如下PB-BSA 10～30∶1PB-OVA 2～10∶1。
因此，所得人工抗原為 實施例4、人工抗原的合成4.1免疫原的合成與純化免疫原的合成利用碳二亞胺法。將0.2mmol半抗原PC，溶解在1mL的N，N-二甲基甲酰胺中，加入1.5當量的二環己基碳二亞胺和3當量的N-羥基琥珀酰亞胺，室溫下反應過夜，離心，取上清液100～800μL緩慢加入到4mL10mg/mL的牛血清蛋白(BSA)碳酸鹽緩沖溶液中，在磁力攪拌下反應1～6小時，裝入透析袋，先用蒸餾水透析2～4次，然后用0.01mol/L的PBS緩沖溶液透析3～5d，分裝保存于-20℃的冰箱中。
4.2包被抗原的合成與純化包被抗原的合成利用混合酸酐法。將0.25mmol半抗原PC溶解在1mL的N，N-二甲基甲酰胺中，加入60μL正三丁胺和30μL氯甲酸丁酯，室溫下反應1～2小時，反應液100μL～800μL加入到5mL10mg/mL的卵清蛋白(OVA)碳酸鹽緩沖溶液中，在磁力攪拌下反應1小時，然后裝入透析袋，先用蒸餾水透析3次，然后用0.01mol/L的PBS緩沖溶液透析3～5d，分裝保存于-20℃的冰箱中。
4.3人工抗原的鑒定按照合成乙基對硫磷免疫原和包被抗原時反應物和產物的比例，分別取反應物和產物進行紫外(200nm～400nm)掃描。
經計算半抗原與蛋白質的結合比如下PC-BSA 15～30∶1PC-OVA 3～8∶1。
因此，所得人工抗原為 實施例5、抗體的制備
5.1免疫動物制備抗血清實驗選用半周歲左右，體重為2-3公斤，健康的雄性家兔。每種免疫原免疫三只兔子(由浙江省中醫學院負責兔子的飼養工作)，分別編號為兔子1-6。
實驗免疫劑量基礎免疫為1.0mg/kg(以兔子體重計)，加強免疫劑量為1.5mg/kg。用生理鹽水分別稀釋適量人工抗原復合物，加入等體積弗氏完全佐劑充分乳化，直至滴入冷水中乳滴不分散。末免用生理鹽水稀釋免疫原直接用于免疫。采用背部皮下多點注射與大腿肌肉注射相結合的方法。3～4周后進行加強免疫，以后每隔2周再次加強免疫，加強免疫時采用弗氏不完全佐劑。從第三次免疫開始，每次免疫后第8～10天，從兔子心臟或耳緣靜脈采血，測定效價和特異性。待免疫血清效價合格后，就進行采血。
本實驗采用心臟取血法。每只兔子可得血80mL左右。采血后，先待收集在三角燒瓶中的血液凝固后，然后用接種針沿三角燒瓶邊緣將血塊與玻璃脫離，放置于37℃溫箱中半小時，再放到4℃冰箱中3～4小時，待血塊收縮后，用吸管將血清吸入試管中，以3000rpm離心15分鐘，分離出血清。
5.2抗體的純化與鑒定一般采用辛酸-硫酸銨鹽析法，也可采用蛋白A柱層析。辛酸-硫酸銨鹽析法是一個經典的方法。辛酸在偏酸性的條件下能將血清中除IgG以外的蛋白質都沉淀下來中，上清液中只有IgG。辛酸加入因抗體的來源不同而不同，人血清為70μl/ml，兔血清為75μl/ml，小鼠血清為40μl/ml，小鼠腹水為33μl/ml。這種方法IgG的回收率達90％以上。
5.3抗體效價測定兩種免疫原復合物(PB-BSA、PC-BSA)按常規方法各免疫了三只兔子。從加強免疫第二次開始，在每次免疫后第8天于兔子耳緣靜脈采血，血清經適當稀釋后用間接ELISA測定效價。待第4次免疫時，兔子獲得了高效價的抗體，經純化制成凍干粉后的效價分別為2.2×106、1.8×106。
實施例6、乙基對硫磷酶聯免疫吸附測定方法建立與鑒定6.1乙基對硫磷ELISA測定方法的原理采用間接競爭酶聯免疫分析方法。它是將農藥分子與大分子載體(如蛋白質)偶聯制得的復合物作為包被抗原吸附于固相載體(96孔酶標板)上，制備成固相抗原，然后加入待測農藥和相應抗體，固相抗原中的農藥，待測農藥，與抗體進行競爭結合反應，待測農藥含量多，被結合在固相抗原上的抗體就少，反之結合在固相抗原的抗體多，反應后加入酶標二抗(只能與結合在固相抗原上的抗體相結合)，最后用底物進行顯色加以測定，當抗體量一定時，加入的待測農藥量越多，與固相抗原結合的抗體就越少，顯色反應就減弱，抑制率增高，反之，則顯色反應增強，抑制率減低，因而可根據已知量農藥的標準線和待檢樣品的抑制率，推算出待測農藥的濃度。
6.2最佳抗體工作濃度和包被抗原復合物濃度的確定選擇包被抗原PB-BSA、抗PB-BSA抗體和抗PC-BSA抗體用方陣滴定法，同時稀釋抗體和固相抗原包被液。
6.3標準曲線和檢測靈敏度6.3.1標準曲線的制備，其基本的操作步驟如下6.3.1.1包被1)包被抗原溶液的配制從低溫冰箱中取出PB-OVA偶聯復合物，使之完全解凍后，稀釋成相應工作濃度。
2)微量反應板的包被96孔聚苯乙烯微量反應板用PBST洗滌后，每孔加入上面所配的抗原包被液100μL，于37℃溫箱中溫育2h。
6.3.1.2封閉取出包被好的微量反應板，甩掉包被液，用PBST洗滌后，每孔加入2.0％的脫脂奶200μL，于37℃溫箱中溫育0.5h。
6.3.13點板1)配制乙基對硫磷的標準溶液取乙基對硫磷標樣配制100ppm的標準溶液，從中取出200μL，待溶劑甲醇揮發后，加入2mLPBS溶液，使之成10ppm溶液，稀釋成若干(5～8)個濃度。
2)乙基對硫磷抗體稀釋液的配制從冰箱中取出已經配制成適當濃度的抗體(抗PB-BSA抗體或抗PC-BSA抗體)，用PBS稀釋成工作濃度。
3)點板取出經封閉的板，經200μl PBST洗滌3次后，每孔加入系列濃度的乙基對硫磷標準液50μL，再加入抗體稀釋液50μL，對照孔加入PBS50μL和抗體稀釋液50μL。放入37℃溫箱中溫育1h，棄去孔內液體，用200μl PBST溶液洗滌3次。
6.3.1.4加酶標二抗每孔加入經1∶1000稀釋的羊抗兔辣根過氧化物酶PBS溶液100μL，放入37℃溫箱中1小時，用PBST溶液洗滌3次，甩干。
6.3.1.5顯色每孔加入底物OPD-過氧化氫溶液100μL，37℃溫箱中溫育15min，用50μL 2M H2SO4終止反應。在酶聯儀上測定490nm波長下的吸光值。根據抑制率與農藥濃度之間的半對數關系作圖即得到標準曲線。
ELISA方法的標準曲線以抑制率與農藥濃度的半對數曲線表示，抑制率以下式計算 式中ODmax為不加藥時的吸光值，ODx為農藥x時的吸光值，ODmin為空白對照孔的吸光值。
6.4抗體的特異性抗血清的特異性就是指它同特異性抗原結合的能力與同該抗原類似物結合能力的比較。常用交叉反應活性作為評價的重要標準。交叉反應越小，抗血清的特異性則越好。
將乙基對硫磷及其類似物做系列稀釋，分別與同一種抗體競爭反應，按制6.3的方法制作標準曲線，并在曲線上找出抑制率50％的劑量和類似物抑制率50％時的用量，然后計算出各類似物的交叉反應率。
實施例7、水稻樣品快速測定7.1提取方法7.1.1水樣水樣(或經過濾)可直接檢測。
7.1.2土壤和植物(水稻)樣品(1)可分別稱取土壤樣品、稻米(將稻米和稻殼分離，并搗碎)、水稻稻桿(剪成＜1cm長)或其它植物樣品，各10g，裝入三角瓶中。
(2)配制三個不同水平的乙基對硫磷甲醇溶液。藥液濃度為10ppm、1ppm、0.1ppm，分別從中取1mL加入到每類樣品中，重復2次，余下的作對照。
(3)一定時間后，在樣品中加入50mL的甲醇放在國際型振蕩器上振蕩提取30分鐘。
(4)振蕩完畢后，提取液用布氏漏斗抽濾，用30mL的甲醇沖洗濾渣，抽濾完畢后，移入到250mL的容量瓶中。
(5)用旋轉蒸發器濃縮至2mL左右，用PBS定容至10mL。
即以上的樣品為添加進已知量的乙基對硫磷標準樣品。
7.2樣品的ELISA法測定已包被好的板每孔加入系列已知添加濃度的樣品液50μL，再加配制好的抗體溶液50μL，對照孔加入100μL抗血清，蓋好板，37℃溫育1小時，棄去孔內液體，其余步驟同實施例6中的6.3。
樣品測定結果如表1所示
表1 乙基對硫磷的樣品添加回收率測定結果

按照本方法檢測樣品最終所得的結論是用該方法檢測水樣、植物樣品或土壤樣品，靈敏度高，定性定量準確，測定簡便快速，檢測成本低。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發明不限于以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
權利要求
1.一種乙基對硫磷人工半抗原，其特征在于它的分子結構式為 其中n＝1～6。
2.如權利要求1所述的乙基對硫磷人工半抗原，其特征在于n＝3，分子結構式為
3.如權利要求1所述的乙基對硫磷人工半抗原，其特征在于n＝5，分子結構式為
4.一種乙基對硫磷人工抗原，其特征在于它的分子結構式為 其中n＝1～6。
5.如權利要求4所述的乙基對硫磷人工抗原，其特征在于n＝3，分子結構式為
6.如權利要求4所述的乙基對硫磷人工抗原，其特征在于n＝5，分子結構式為
7.一種乙基對硫磷特異性抗體，其特征在于是用分子結構式為 其中n＝1～6的乙基對硫磷人工抗原免疫兔子或白鼠所得到的、能與乙基對硫磷發生特異性免疫反應的單克隆或多克隆免疫球蛋白G。
8.一種如權利要求1～3所述的乙基對硫磷半抗原的用途，其特征在于是用作動物免疫的抗原體系的原料。
9.一種如權利要求7所述的乙基對硫磷特異性抗體的用途，其特征在于用于檢測食品、農產品和環境樣品中乙基對硫磷的殘留量。
10.如權利要求9所述的乙基對硫磷特異性抗體的用途，其特征在于所述環境樣品為土壤樣品或水樣品。
全文摘要
本發明公開了一種乙基對硫磷人工半抗原和一種乙基對硫磷人工抗原，以及該種人工抗原所制成的乙基對硫磷特異性抗體。本發明的乙基對硫磷特異性抗體，用于檢測食品、農產品和環境樣品中乙基對硫磷的殘留量。
文檔編號G01N33/53GK1900086SQ20061005253
公開日2007年1月24日 申請日期2006年7月19日 優先權日2006年7月19日
發明者朱國念, 劉毅華, 桂文君, 程敬麗, 金茂俊, 郭逸蓉 申請人:浙江大學