專利名稱：帶有多個能共價結合生物分子的官能基團的表面固定化多電解質的制作方法
技術領域：
本發明屬于多電解質化學領域。
背景技術：
作為解決寡核苷酸的“點陣列”的診斷使用帶來的許多問題的一個選擇方案(這些問題略述于2002年8月23日提交的美國申請No.10/204,799、WO01/98765“使用特異-應用的隨機顆粒陣列的多分析物分子分析”)，通過把寡核苷酸探針結合于編碼的微珠顆粒上，形成優選的陣列，其中編碼顆粒由聚合物樹脂制成。見于提交于2002年10月15日的美國專利申請No.10/271,602“通過同時探查和酶介導檢測的多態性位點多重分析”和之前的申請No.10/204,799。然后編碼的顆粒-探針結合體裝配在2D分析格式中，并放到與樣品接觸，預期樣品含有亞序列與探針互補的靶多核苷酸，其中樣品中的靶多核苷酸預先用熒光標記。由熒光分析信號的存在確定探針與靶之間的結合。產生陽性分析信號的特定探針可以通過解碼陣列確定。
有許多已知的和商業上的方法用于連接寡核苷酸探針和微珠。已經設計了大量方案用于把寡核苷酸探針共價固定化于微粒，這在公開文獻或商業上都可得到。傳統的共價固定化技術使用官能化的珠子(即，用活性基團如氨基、羧基、甲苯磺酰基、乙醛基、環氧基、酰肼及其它基團官能化珠子)，連接到寡核苷酸探針末端的互補官能團上(Marie K.Walsh，XinwenWang and Bart C.Weimer，Optimizing the immobilization of single-strandedDNA onto glass beads，J.Biochem.Biophys.Methods 2001；47221-231)。通常，這種結合設計導致不適宜的空間構向和立體障礙問題。可以由引入間隔分子提高這種共價固定化探針的雜交性能(Edwin Southern，Kalim Mirand Mikhail Shchepinov；Molecular Interactions on Microarrays.NatureGenetics Supplement，21，1999，pp.5-9)，然而，通常是難以實現和不實用的。
因此，一種可操作和強的探針結合化學作用對優化基于微珠陣列的分析是重要的。這種化學作用必須允許探針以高效率與顆粒結合，以便保持珠子表面上的探針濃度一致，同時反應也必須不改變探針-靶結合的效率。而且，反應必須具有最小的批之間變異率。在通常使用的一個方法中，官能化的微粒用中性抗生物素蛋白(Neutravidin)(Pierce，Rockford，IL)、鏈霉抗生物素蛋白(streptavidin)或抗生物素蛋白包被，這些蛋白是生物素結合蛋白，從而介導生物素化探針的固定。
抗生物素蛋白-生物素相互作用是高度特異的，是最強的已知反應之一(在含水溶液中締合常數(KA)為1015M-1級)，并且提供珠子表面固定化蛋白與生物素化探針分子之間幾乎不可逆的鍵。見于上述美國專利申請No.10/271,602。以下描述的結合探針到多電解質的方法優于這些已知方法，因為證明它們能夠引導更多寡核苷酸與珠子聯結。
發明概要具有多個暴露官能團的多電解質固定化到一個表面上，目的是結合一個生物分子，所述多電解質的每個官能團能夠與一個分子共價結合。生物分子可以是例如核酸，如胺官能化的寡核苷酸。多電解質可以包括，如使用共價固定化方法結合于官能化表面的BSA(牛血清白蛋白)，此方法如，與甲苯磺酰基-活化的微粒表面的反應。這樣反應后，蛋白質上暴露的活性官能團，諸如胺、羧基、巰基、羥基，運用適當的化學作用，能進一步用于共價結合感興趣的寡核苷酸在一個實施例中，在末端位置(3’或5’末端位置)以胺類修飾的寡核苷酸(如，氨基修飾的寡核苷酸)由一個EDAC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亞胺)反應與BSA共價結合(見于，如，D.Seligal et al.，AnalyticalBiochemistry 21887091(1994))。共價反應導致在寡核苷酸末端的胺基與BSA的羧基之間形成一個酰胺鍵。反應見于圖1。
官能化的表面可以是一個珠子或微粒的表面，此珠子或微粒由大量材料中的任意材料組成，材料包括聚合物、聚合樹脂、玻璃、橡膠或其它能官能化以固定多電解質的材料。進行試驗以比較BSA-包被的珠子與另一種范例多電解質人類血清白蛋白(“HSA”)，以及中性抗生物素蛋白。雜交試驗的結果表示，BSA-包被的珠子能夠把更高濃度的寡核苷酸聯結到珠子上。


圖1表示利用EDAC反應BSA與官能化的珠子的結合，和寡核苷酸探針與BSA的結合。
圖2表示來自寡-官能化BSA偶聯的珠子的雜交信號，作為用于偶聯胺化探針的量的一個函數。一個完全匹配的探針聯結于兩套BSA-偶聯的珠子。BSA與第一套珠子在65℃偶聯，與第二套在37℃偶聯。在第一套珠子上觀察到較高的雜交效率(較高的信號)，BSA在65℃對其偶聯。第三套珠子在65℃與BSA偶聯，并與一個不匹配的陰性對照探針官能化，表現出可以忽略的雜交，從而表示信號的增強不是非-特異性結合增加的結果。
圖3表示偶聯于珠子的BSA的滴定結果。如圖2所示，偶聯BSA的珠子在較高溫度下的雜交效率比在較低溫度下的大，這顯示于靶位上結合于BSA-偶聯的珠子的一個寡核苷酸探針接觸的雜交信號的差異，其中BSA與一套珠子在37℃偶聯，而BSA與另一套珠子在65℃偶聯。(見實例4)圖4表示BSA與甲苯磺酰基官能化的珠子在不同溫度下偶聯效率的差異，參照雜交分析法確定，其中寡核苷酸探針結合于固定于珠子上的BSA，然后與互補的熒光標記靶反應。(見實例6)圖5表示在65℃或更高溫度培養大約1小時，對BSA與甲苯磺酰基活化珠子的偶聯反應，BSA與珠子表面的結合效率不受影響，這顯示于靶位上結合于BSA-偶聯的珠子的一個寡核苷酸探針接觸的雜交信號的差異。(見實例7)圖6A顯示BSA包被的甲苯磺酰基官能化珠子與中性抗生物素蛋白-包被的甲苯磺酰基官能化珠子相比，在結合了探針和與一個靶雜交之后，給出更均一和更強的雜交信號。(見實例8)圖6B顯示圖6A中信號的變異系數。
圖7顯示當包被在甲苯磺酰基官能化珠子上的多電解質是HAS而不是BSA時，雜交有顯著差異，其中寡核苷酸探針分別結合于固定于珠子上的BSA或HSA，然后與互補的熒光標記靶反應。
發明詳述實例1制備BSA-包被的甲苯磺酰基官能化珠子在10mL PBS中溶解50mg BSA而制備濃度為5mg/mL的BSA溶液。向一個15mL離心管中加入2.0mL PBS-T。轉移1mL濃度為1％固體(10mg)熒光著色的珠子到此離心管中，并由渦旋轉動而充分混合。通過3,500rpm離心4+/-0.5分鐘沉淀珠子，并倒出上清液。向管中加入3.0mL PBST并由渦旋轉動而充分混合，把珠子再次-懸浮。通過3,500rpm離心4+/-0.5分鐘再次沉淀珠子，并倒出上清液。向珠子加入3.0mL BSA溶液(5mg/mL)并由渦旋運動而充分混合。把離心管放在37℃培養箱中的振蕩器上，使珠子在250rpm振蕩下反應過夜。
然后，通過3,500rpm離心4分鐘沉淀珠子，并倒出上清液。然后通過向離心管加入3.0mL PBS-T洗滌珠子，并在渦旋混合器上混合。之后再次把珠子以3,500rpm離心4+/-0.5分鐘，并倒出上清液。然后重復洗滌和離心步驟。
加入3.0mL貯存緩沖液(含有0.1％NaN3的0.1M PBS)，并在渦旋混合器上混合。再次把珠子以3,500rpm離心4+/-0.5分鐘，倒出上清液。然后在1ml貯存緩沖液中渦旋運動再次懸浮珠子。珠子濃度為1％固體(10mg/mL)，在4-6℃貯存。它們易于通過EDAC反應聯結含有-胺的生物材料(如，BSA)，如以下實例3中所述。
實例2制備BSA-包被的羧基官能化珠子BSA與羧基化顆粒的偶聯如下實現。轉移100μl濃度為1％固體的羧基化顆粒到一個2ml Eppendorf管中。然后由離心沉淀珠子，移去上清液。之后，用1ml MES(細節)緩沖液(pH4.5)洗滌珠子一次。用MES緩沖液分別制備BSA儲存液(5mg BSA/mL)和EDC儲存液(20mg/mL)。向珠子沉淀加入100μl BSA儲存液，渦旋轉動充分混合懸浮液。之后，向珠子懸浮液加入400μl EDC儲存液，渦旋轉動混勻并在室溫下通過底-頭-底的混合方式反應1小時。培養1小時后，向懸浮液加入100μl PBS-T，離心珠子。用1ml PBS-T由離心-再分散循環洗滌小球2次，最后珠子懸浮在100μl貯存緩沖液(含有0.1％疊氮化鈉，NaN3的0.1M PBS)并貯存于4-6℃。
實例3把胺化的寡核苷酸探針偶聯到BSA珠子的EDAC反應胺化的寡核苷酸探針與珠子的偶聯，制備如同實例1和2，如下實現。取一系列1.5ml Eppendorf管并且做標記，用于區分微粒的類型和將要偶聯的寡核苷酸探針類型。之后，向每個管中加入500μl PBST，然后加入100μl濃度為1％固體的BSA偶聯的珠子。用渦旋混合器混合10秒鐘而充分混合。然后9,500rpm離心2+/-0.5分鐘，沉淀珠子，倒出上清液。向沉淀加入等分的500μl 0.05M MES緩沖液(pH4.5)，并由渦旋運動充分混合。然后把珠子在9,500rpm離心2+/-0.5分鐘，并倒出上清液。向珠子加入等分的500μl 0.05M用MES緩沖液制備的EDAC(使用前制備)，并由渦旋運動充分混合。然后，加入10μL濃度100μM氨基修飾的DNA探針(如，探針MS-508N25，購自Integrated DNA Technologies，Inc.，CoralvilleIA)到各個含有珠子懸浮液的離心管，充分混合。使此反應在室溫下(20-25℃)以底-頭-底的混合方式進行1小時。
培養后，向各管加入100μL PBS-T，并由渦旋運動混合。然后以9,500rpm離心2+/-0.5分鐘沉淀珠子，倒出上清液。用500μl PBS-T通過離心-再分散循環的方式洗滌珠子2次。
把珠子再次懸浮于100μL PBST，得到終濃度為1％的固體，在4-6℃貯存以便進一步的使用。
寡核苷酸官能顆粒的雜交性能(試驗步驟見實例4)作為用于添加寡聚物的量(100μM/200μg顆粒的0.25、0.5、1、2、4、8μl)的一個函數表示于圖2。于是上述量100μM/lmg的10μl代表飽和濃度。BSA與珠子的偶聯在較高溫度表現較高雜交性能，這些后面有詳述。
實例4使用寡核苷酸官能化珠子的雜交分析1.在8個不同芯片上裝載珠子混合物。儲備的熒光標記DNA靶溶液(MS508-90mer-CY5)制備于雜交緩沖液(1×TMAC)中。從儲備靶溶液制備8個不同系列稀釋溶液。然后向8個單獨芯片加入20μl每種系列稀釋的靶溶液。
2.把含有這些芯片的一個載玻片放到雜交加熱器/振蕩器中，并在100rpm和55℃培養20分鐘。
3.移去載玻片并冷卻到室溫，用移液管移去雜交液。
4.向各芯片加入20μl的1×TMAC，用移液管吸取釋放溶液的方式洗滌芯片8到10次。
5.移去洗滌液，向各芯片加入5ml封片液(1×TMAC)，使用一個蓋玻片在熒光顯微鏡下讀出分析信號(CY5)。
6.繪制雜交信號(CY5)與DNA探針濃度的滴定曲線。
滴定曲線的例子表示于圖3。
實例5進行試驗以比較向珠子-探針懸浮液兩次加入EDAC的效果(已知EDAC在酸性pH下很快水解)，以評價這是否導致探針與BSA層結合的增加。首先在以下每種條件(10μl 100μM探針/100μl 1％珠子)下，探針MS-508-N25偶聯于BSA-包被的珠子。反應1小時后，從1×管移去一半珠子，加入新的EDAC，然后在此管中反應再進行1小時。然后對非-匹配的探針SSP36重復整個過程。每套珠子和非-特異性珠子集中在一起，裝配在一個芯片上，然后在雜交條件下，所有套珠子都與靶MS508-40mer-Cy5接觸。然后紀錄結果，并總結在表II。加入2次EDAC提供了更高的雜交信號。
表II

實例6BSA在不同溫度下偶聯于甲苯磺酰基活化珠子及它們的雜交特性向5個15mL離心管中各加入2.0mL PBST和1mL濃度為1％固體(10mg)熒光著色的珠子，并由渦旋運動充分混合珠子。通過以3,500rpm離心4+/-0.5分鐘而沉淀珠子，倒出上清液。然后把珠子再次懸浮于3.0mLPBST中，渦旋運動充分混合珠子，再次以3,500rpm離心4+/-0.5分鐘沉淀珠子。倒出上清液。
向各試管加入2mL PBS(pH7.2)和1mL BSA溶液(PBS中50mg/mL)并由渦旋運動充分混合。培養箱中對各試管的環境溫度設置如下管A-22℃、管B-37℃、管C-50℃、管D-65℃、管E-75℃，并使珠子在指定溫度下以底-頭-底的混合方式與BSA反應14小時。然后把各管冷卻到室溫，通過以3,500rpm離心4分鐘而沉淀珠子，倒出上清液。向管中加入3.0mL PBST洗滌珠子，由渦旋混合器混合，在3,500rpm離心4+/-0.5分鐘沉淀珠子。倒出上清液。
加入1mL貯存緩沖液(含有0.1％NaN3的PBS)，并將試管置于渦旋混合器上混合。珠子濃度為1％固體(10mg/mL)。BSA偶聯的珠子在4-6℃下貯存。
由上述EDAC偶聯方法，把25-mer MS-508N25生物素化的寡核苷酸探針與各套珠子偶合。然后在雜交條件下，每套珠子與用于探針的固定濃度的標記靶(用Cy-5標記的90-mer寡核苷酸)接觸。珠子上標記的量與珠子上探針濃度相關。
如圖4所示，偶聯于BSA的珠子在較高溫下表現更多與顯示在珠子表面的寡核苷酸探針的靶結合。這表示，這種珠子表面上探針濃度更高，這可能是因為在65℃，BSA變性并展開，呈現更多可用于結合探針的位點。
實例7不同培養時間對BSA與甲苯磺酰基官能化珠子偶聯的比較進行一個試驗以研究BSA與甲苯磺酰基官能化珠子偶聯反應的時間過程。在進行如上述實例1和實例5的同樣步驟之后，12個單獨管，每個含有一種BSA-甲苯磺酰基顆粒反應混合物，培養于65℃烘箱中，同時1個對照管培養于37℃。在每一個預定培養階段之后取出一個管，以實例3中列出的方法洗滌并用一個寡核苷酸探針(包括一個對照探針)偶聯。然后，進行雜交反應并記錄實驗強度(見實例4)。結果表示于圖5，說明BSA偶聯反應基本上在少于1小時內完成。
實例8與常用生物素-抗生物素蛋白寡核苷酸偶聯和中性抗生物素蛋白包被化學作用的比較進行一個試驗以比較寡-結合的、BSA-官能化珠子與生物素化的寡-聯結的中性抗生物素蛋白珠子的捕獲和雜交效率。使用實例1中列出的步驟，在37℃把蛋白質偶聯于珠子表面。然后，生物素化的(也胺化的)寡聚物偶合于顆粒(如實例3中)，和一個同源的靶實行雜交分析。
取兩種不同編碼但卻是相同的BSA包被顆粒，一種匹配探針結合于一個組，一種非-匹配探針結合于另一個組。類似地，取兩種其它中性抗生物素蛋白-官能化珠子并結合于匹配和非匹配的生物素化探針。
實驗結果表示于圖6A和圖6B。明顯的是，BSA包被比使用中性抗生物素蛋白捕獲化學作用提供了更均一(較低CV)和更高的信噪比(認為非匹配探針的雜交強度是噪音)。
實例9與HSA包被比較HSA(人類血清白蛋白)在那些用于BSA與甲苯磺酰基-官能化顆粒偶聯的相同條件下進行偶聯。然后HSA官能化顆粒與寡核苷酸探針偶聯，并雜交(滴定)于熒光標記的模式DNA靶(如實例4中)。結果表示于圖7。結果說明，對結合寡核苷酸探針，HSA包被不如BSA包被有效，盡管事實上，像BSA一樣，HSA具有可用于結合寡核苷酸探針的許多官能羧基基團。
實例10BSA偶聯的批之間變異3批各為10mg的珠子分別在65℃偶聯BSA 14小時，其中BSA-珠子比是5(W/W，mg/mg)。偶聯的反應體積是3mL。作為對照，1批珠子在37℃偶聯于BSA。基于偶聯于珠子的DNA探針與同源靶的雜交強度而確定偶聯效率。雜交在55℃1×TMAC中進行20分鐘，靶是濃度為400nM的MS508-90mer-CY5。實驗讀出的整體時間是200ms。結果表示于表I。
表I


65℃批次的強度一致地比在37℃偶聯的批次的強度高，并且批之間變異率很小。
上述術語、表述和實例僅僅是范例而非限制，本發明只由以下的權利要求限定，并包括權利要求的主旨的所有等價物。
權利要求
1.一種固定化于一個表面的多電解質，具有多個暴露的官能團用于與生物分子共價結合。
2.根據權利要求1所述的多電解質，其中所述官能團是羧基或胺基。
3.一種包括多電解質的，其中所述多電解質固定化于一個表面并共價結合于一種核酸。
4.根據權利要求3所述的產物，其中所述多電解質是一種蛋白質，并且所述表面是用甲苯磺酰基活化的。
5.根據權利要求3所述的產物，其中所述蛋白質是BSA，并且所述核酸是一種寡核苷酸。
6.根據權利要求4所述的產物，其中所述寡核苷酸是通過EDAC反應形成的酰胺鍵結合于所述蛋白質的。
7.根據權利要求5所述的產物，其中所述寡核苷酸是在其5’末端生物素化的。
8.根據權利要求3所述的產物，其中所述表面是一種微粒的表面，這種微粒是由一種聚合物、一種聚合樹脂、玻璃或橡膠組成的。
9.一種方法，包括把一種核酸共價結合到固定化于一個表面上的一種多電解質。
10.根據權利要求9所述的方法，其中所述核酸是在5’末端用一個胺基團官能化或生物素化的一種寡核苷酸。
11.根據權利要求9所述的方法，其中所述多電解質是一種蛋白質，包括BSA，并且在固定蛋白質之前，表面用甲苯磺酰基活化。
12.根據權利要求11所述的方法，其中所述多電解質是由所述多電解質的COOH官能團通過一個EDAC反應結合于所述表面的。
13.根據權利要求10所述的方法，其中所述寡核苷酸是由一個EDAC反應結合于所述蛋白質的，從而在所述寡核苷酸和所述蛋白質之間形成一個酰胺鍵。
14.根據權利要求11所述的方法，其中所述蛋白質是在65℃或更高溫度進行的一個反應中固定化到所述表面。
15.根據權利要求13所述的方法，其中所述表面是一種微粒的表面，這種微粒是由一種聚合物、一種聚合樹脂、玻璃或橡膠組成的。
16.由權利要求9至14中任一權利要求所述的方法形成的一種產物。
全文摘要
具有多個暴露官能團的多電解質固定化到一個表面上，目的是結合于一個生物分子，其中每個基團能夠與一個分子共價結合。生物分子可以是例如核酸，如胺官能化的寡核苷酸。多電解質可以包括，如使用共價固定化方案結合于官能化表面的BSA(牛血清白蛋白)，此方案如，與甲苯磺酰基－活化的微粒表面的反應。這樣反應后，能進一步使用蛋白質上暴露的活性官能團，諸如胺、羧基、巰基、羥基，以通過適當的化學作用與感興趣的寡核苷酸共價地偶聯。
文檔編號G01N33/53GK1882699SQ200480033807
公開日2006年12月20日 申請日期2004年9月22日 優先權日2003年9月22日
發明者汪新文, 蘇堪塔·本納吉 申請人:佰爾瑞溶液有限公司