一種能夠生產人神經生長因子的轉基因小鼠的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種生產轉基因小鼠進而生產人神經生長因子的方法，屬于分子遺傳 學和細胞生物學領域。
【背景技術】
[0002] 神經生長因子（NGF)是神經營養因子中最早被發現，目前研究最為透徹的，具有 神經元營養和促突生長雙重生物學功能的一種神經細胞生長調節因子，它對中樞及周圍神 經元的發育、分化、生長、再生和功能特性的表達均具有重要的調控作用。NGF包含α、β、 Y三個亞單位，活性區是β亞單位，由兩個118個氨基酸組成的單鏈通過非共價鍵結合而 成的二聚體。目前，臨床使用的NGF多為動物（小鼠）基因表達產物，雖然NGF的生物效應 無明顯的種間特異性，但是有研究表明人的NGF具有顯著高于鼠源NGF的生物學活性。因 此，采用人NGF用于臨床治療具有鼠源NGF無法比擬的優點。目前有采用重組方法生產的 人NGF的報道。但是由于NGF分子結構的特殊性，很難獲得具有生物學活性的重組人NGF。 也有通過轉基因的方法使人NGF在轉基因小鼠體內表達的技術，但是外源基因在小鼠的基 因組中是隨機整合，其表達水平變化比較大。另外，在純化過程中，會同時獲得人NGF和鼠 NGF，因此純度達不到要求。
[0003] 基因敲入技術是一項利用同源重組的原理，在小鼠的胚胎干細胞（ES細胞）中定 位整合外源基因，使外源基因可以在小鼠體內表達的技術，在外源基因定位整合的同時，可 以將整合位點小鼠的內源基因完整或者部分取代，成為一種特定基因人源化的轉基因小鼠 模型。目前這種技術已經用于基因表達調控的研究
[0004] 目前利用基因敲入技術已獲得多種特定基因人源化的基因敲入小鼠模型。例如 人alpha-珠蛋白的基因敲入模型。通過分別在人alpha-珠蛋白基因的5' -端和3' -端 連接小鼠 alpha-珠蛋白基因的5' -端和3' -端DNA序列，構建同源重組載體，然后將載體 導入小鼠的ES細胞，載體上的小鼠 alpha-珠蛋白基因的5' -端和3' -端DNA序列和小鼠 染色體上的alpha-珠蛋白基因 5' -端和3' -端DNA序列發生2次同源重組，從而將人的 alpha-珠蛋白基因序列定位整合在小鼠的alpha-珠蛋白基因位置上，同時將小鼠內源性 的alpha-珠蛋白基因刪除。這樣，小鼠的紅細胞中就可以表達人的alpha-珠蛋白基因，其 表達水平與小鼠內源性alpha-珠蛋白基因的表達相當。
[0005] 如果通過基因敲入的方法，采用人的NGF基因在小鼠基因組中定位替換鼠的NGF 基因，可以使人NGF基因在小鼠內源性NGF的表達調控序列控制下表達，在純化時也不會有 鼠源NGF的污染。但是利用常規基因敲入技術獲得NGF基因敲入的小鼠存在很多的困難或 風險，例如，在基因敲入的過程中需要在ES內發生2次同源重組，經過2次篩選，一次正的 篩選，一次負的篩選，才能獲得陽性克隆。同源重組載體進入ES細胞內后，可以隨機插入小 鼠基因組的任何序列，造成假陽性結果，導致小鼠內源性NGF基因不能正確的刪除。
[0006] 2007年Barrangou等人首次發現并證明細菌可以利用Cas/CRSPR系統對抵抗噬 菌體入侵。2008年Marraffini等人又發現細菌CRISPR系統能阻止外源質粒的轉移，首次 利用實驗驗證了 Cas/CRISPR系統的功能。CRISPR/Cas系統的作用特性與限制性核酸內切 酶相似，它對序列的特異性切割，主要依賴crRNA與Cas蛋白形成的核糖核蛋白復合物識別 靶序列上的PAM以及protospacer。根據CRISPR/Cas系統這一特性將它設計為人工的核 酸內切酶（Engineered endonuclease，EEN)，用它來對科學家感興趣的基因位點進行修飾。 釀濃鏈球菌（Streptococcus pyogenes SF370)的Type II型系統是被改造的最為成功的人 工核酸內切酶，已經在人類細胞、小鼠、斑馬魚中成功實現了基因組定點修飾。
[0007] 為解決基因重組現有技術存在的上述問題，本發明人意欲通過利用Cas-9/CRSPR 介導的基因組編輯技術，提供一種同源重組位點準確，成功率高的同源重組方法，以獲得整 合有人NGF基因的轉基因小鼠，并進而提供一種制備具有商生物效能人NGF的方法。

【發明內容】

[0008] 基于現有技術在NGF的制備領域存在諸多的問題，發明人設計利用Cas-9/CRSPR 介導的基因組編輯技術，在小鼠 NGF成熟肽基因內部把小鼠的染色體DNA切斷，依靠細胞自 身的同源重組修復能力，利用同時轉入的人工合成的融合基因（帶有鼠 NGF信號肽、前體 肽、人NGF成熟多肽）作為修復模板，一次完成小鼠 NGF成熟多肽基因的刪除和人NGF成熟 多肽基因的定位敲入。不僅可以在ES細胞上完成，還可以直接對小鼠的受精卵進行顯微注 射，建立人NGF成熟多肽基因敲入小鼠，進而通過該轉基因小鼠生產人NGF。
[0009] 為此，本發明首先提供了一種通過同源重組技術生產轉基因小鼠的方法，所述小 鼠染色體中編碼神經生長因子的基因被一個或多個拷貝的編碼人神經生長因子的基因原 位取代，所述方法包括如下步驟：
[0010] (1)構建含有人神經生長因子的編碼基因的同源重組載體，該同源重組載體能與 小鼠胚胎干細胞中鼠 NGF基因發生同源重組；優選地，步驟（1)所述的同源重組載體依次包 含5' -同源重組臂、FRT序列、嘌呤霉素抗性基因表達盒、FRT序列、鼠 NGF信號肽序列、人 NGF基因、鼠 NGF3' -非翻譯區序列、3 同源重組臂。
[0011] 所述兩個同源重組臂（5' -和3' -端的重組臂）的長度為200 - 5000bp，優選的 長度為l〇〇〇bp。5'-同源重組臂的序列可以如SEQ ID NO: 1所示，嘌呤霉素抗性基因 （Puro 基因）表達盒序列如SEQ ID N0:4所示，在其兩側的FRT序列如SEQ ID N0:2所示，FRT序 列用于在FLP酶的作用下刪除抗性基因表達盒。
[0012] 優選地，所述嘌呤霉素抗性基因表達盒受PGK啟動子調控，所述PGK啟動子序列如 SEQ ID NO:3 所示。
[0013] 鼠 NGF信號肽序列如SEQ ID NO: 5所示，人NGF基因序列如SEQ ID NO: 6所示，所 述鼠 NGF3'-非翻譯區序列和3 同源重組臂序列可以如SEQ ID N0:7所示，所述3'-非 翻譯序列包括終止密碼子、PolyA加尾信號以及內含子序列。
[0014] 在一個優選的技術方案中，所述載體還帶有原核細胞的抗生素抗性基因，以便于 在大腸桿菌中篩選陽性克隆。
[0015] 在另一個優選的技術方案中，步驟（1)所述載體是在PBR322質粒基礎上構建的， 所述抗生素抗性基因為氨芐青霉素抗性基因。。
[0016] (2)構建指導RNA模板DNA載體，所述載體在細胞內轉錄出20bp的RNA分子與小 鼠染色體中編碼神經生長因子成熟肽DNA特異性互補，并被Cas蛋白所識別，在互補區域下 游切斷小鼠 NGF基因組DNA。優選地，所述的指導RNA模板DNA載體中，含有兩種DNA編碼 序列分別如SEQ ID N0:8和9的第320-329位核苷酸所示。
[0017] 所述載體含有啟動子序列和終止序列；優選地可以采用U6啟動子進行體內的轉 錄，也可以選擇其它可以進行體外轉錄的啟動子，如T7和Sp6啟動子控制指導RNA的合成。
[0018] (3)構建含有Cas-9 DNA內切酶基因的真核表達載體，所述載體含有編碼入核信 號肽的核苷酸序列；優選地，所述入核信號肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 10所示；更為優 選地，在所述Cas-9 DNA內切酶基因和所述編碼入核信號肽的核苷酸序列之間有一個編碼 如SEQ ID NO: 12所示的柔性多肽的核苷酸序列。進一步優選地，在所述Cas-9 DNA內切酶基 因和所述編碼入核信號肽的核苷酸序列之間編碼柔性多肽的核苷酸序列如SEQ ID NO: 13 所示的。
[0019] (4)將步驟（1)-(3)獲得的3種載體一起轉染入小鼠胚胎干細胞，并篩選發生了同 源重組的細胞；優選地，所述轉染可以為電轉染或者脂質體轉染。優選地，所述小鼠的品系 為C57BL/6J。在同源重組載體整合有Puro基因的基礎上，本步驟中所述的篩選為嘌呤霉素 篩選。
[0020] (5)將步驟（4)獲得的胚胎干細胞顯微注射入小鼠囊胚中，之后移植到假孕母鼠 的子宮中，手術縫合后飼養受孕母鼠，獲得受孕母鼠生產的子代小鼠，對所述子代小鼠進行 基因鑒定，篩選出人NGF基因陽性的小鼠。
[0021] (6)在步驟（5)獲得的人NGF基因陽性小鼠中，通過基因鑒定篩選嵌合率大于 50%的成熟公鼠與未發生同源重組的原品系野生型小鼠進行交配，之后飼養受孕的母鼠， 獲得受孕母鼠生產的子代小鼠。
[0022] (7)使步驟（6)獲得的子代小鼠之間進行交配，通過基因鑒定篩選出純合子轉基 因小鼠。
[0023] 另外，本發明還提供了一種通過轉基因小鼠生產人NGF的方法，所述方法包括：
[0024] (1)通過上述生產轉基因小鼠的方法獲得的轉基因小鼠并進行飼養；
[0025] (2)從上述方法步驟⑴獲得的小鼠的頜下腺中提取人NGF ;
[0026] 本發明方法的優點在于：
[0027] 1)通過外源導入的RNA指導的DNA內切酶定點切割染色體DNA，激活小鼠細胞內 源的重組修復機制，利用人工導入的模板DNA，通過同源重組將人NGF基因成熟多肽的DNA 序列定位替換鼠的NGF基因成熟多肽，形成一個帶有鼠 NGF的表達調控序列、信號肽、前體 肽和人NGF成熟多肽DNA序列嵌合基因。較常規的利用正負雙篩選同源重組基因打靶技術 相比，操作簡單，只需將3種質粒DNA同時轉染ES細胞或者對小鼠的受精卵進行原核注射 就可以，成功率高，可以達到2-5 %，顯著高于普通基因打靶技術的0. 1 %的ES細胞陽性率。
[0028] 2)小鼠細胞在合成人NGF蛋白時，完全利用鼠 NGF的表達調控序列，轉錄出一個帶 有小鼠 NGF信號肽、前體肽和人NGF成熟多肽的嵌合多肽，