一種金屬離子固定化親和磁球的制備方法及應用
【專利說明】
【技術領域】
[0001]本發明涉及親和磁球技術領域，具體地說，是一種金屬離子固定化親和磁球的制備方法及應用。
【【背景技術】】
[0002]1975年，Porath等利用亞氨基乙二酸(IDA)作為配體固定在以瓊脂糖為基質的填料上利用IDA與過渡金屬銅、镲、鈷或鋅離子的螯合作用，發展了一種IMAC(ImmobilizedMetal-1on affinity chromatography)方法，對表面帶組氨酸、色氨酸或半胱氨酸殘基的蛋白進行吸附純化。這種利用螯合金屬與特殊蛋白相互作用而對蛋白進行富集純化的方法稱為固定金屬離子親和色譜(IMAC)。
[0003]固定金屬離子親和色譜法對蛋白的富集能力的強弱與基體，配體和金屬離子的種類有著重要的關系，配體中與金屬離子作用位點及和特異性蛋白的結合能力直接影響著多肽或蛋白的富集效果。常用的基質有大孔硅膠，交聯瓊脂糖和交聯葡聚糖以及有機聚合物TSK-gel G500PW。硅膠載體剛性好，分離效率高，但在高pH下易溶解，低pH下易產生硅羥基。TSK的機械強度介于硅膠和瓊脂糖或葡聚糖之間，但與金屬螯合配體結合不牢固，使用時金屬離子易泄露。配體的作用是將金屬離子固定在基質上，為此配體既含能與基質共價鍵合的活性基團如-N、-0H、-C1等，又有能與金屬離子配位的多個配位原子。常用的配體主要是亞氨基二乙酸，氮基三乙酸，N，N，N'-三(羧甲基)乙烯二胺等。固定金屬離子通常為具有d層空價電子軌道的過渡金屬如Cu2+、Ni2+、Co2+、Zn2+、Fe3+等，它們與配體形成可與蛋白質結合的金屬螯合配體。
【
【發明內容】
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[0004]本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種以磁性無機物四氧化三鐵為核，雙層有機聚合物包裹的核-殼-殼結構的核殼材料，以及將其應用于對特異性多肽或蛋白進行富集檢測的方法。
[0005]本發明的目的是通過以下技術方案來實現的:
[0006]一種金屬離子固定化親和磁球的制備方法，其特征在于，其具體步驟為:
[0007]第一、2.0?3.0g的三氯化鐵和90?IlOmL的乙二醇和7.0?7.5g的無水乙酸鈉進行均勻混合，在150?250°C進行高溫水解反應，得到四氧化三鐵磁球；
[0008]第二、將200?250mg四氧化三鐵磁球分散在體積比為1: 4?1: 6的乙醇和水的混合溶液中，逐滴加入0.3?0.5mL的3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯機械攪拌I?2天，得到聚合物包裹的磁球；
[0009]第三、將步驟二中得的聚合物包裹的磁球分散在40?50mL的乙腈中，加入200 μ L的稀丙基氯單體和300?350 μ L 二甲基丙稀酸乙二醇醋的交聯劑及10?15mg偶氮二異丁腈引發劑于90?100°C進行回流反應，得到以具有以四氧化三鐵為核，雙層有機聚合物包裹的核-殼-殼結構的磁球；
[0010]第四、將步驟三中得的雙層有機聚合物包裹的核-殼-殼結構的磁球分散在40?50mL的1:1?1: 5的三氯甲烷與三乙胺的混合溶液中，加入200?300mg的亞氨基乙二酸于70?90°C進行回流反應，得到以亞氨基乙二酸進行結構修飾的磁球；
[0011]第五、將步驟四中得到的亞氨基乙二酸進行結構修飾的磁球加入含有0.05?2mol/L的可溶性銅、镲、鈦及其他重金屬離子的溶液中，用氫氧化鈉溶液將溶液pH值調整為6?9，在室溫下實現金屬離子的固定化，得到螯合金屬離子的磁性微球。
[0012]一種特異性多肽或者蛋白的富集檢測方法，其具體步驟為:
[0013](I)將制得的螯合金屬離子的磁球用水溶液進行清洗I?3次，去除游離的金屬離子;
[0014](2)將步驟(I)清洗后的螯合金屬離子的磁球與0.4?0.6mg/L蛋白溶液例如牛血清白蛋白(BSA)和牛血紅蛋白(BHb)進行混合I?2h，利用磁分離對含有組氨酸的多肽或者蛋白進行選擇性富集和快速分離，實現對高豐度的多肽或蛋白進行去除和低豐度的多狀或蛋白的富集；
[0015](3)將步驟(2)中吸附多肽或蛋白的磁球用0.2?0.4g/mL的咪唑溶液進行洗脫，用于檢測或其他應用目的；
[0016](4)可以利用紫外光譜進行檢測，并計算磁球對特異性多肽或蛋白的吸附容量。
[0017]與現有技術相比，本發明的積極效果是:
[0018]本發明的制備的以四氧化三鐵為核，雙層有機聚合物包裹的核-殼-殼結構的核殼材料可以實現對牛血清白蛋白(BSA)和牛血紅蛋白(BHb)的選擇性富集，富集容量可以達到1000mg/g，而且可以利用材料的超順磁性在5min內進行快速的分離。同時，利用此方法制備的材料具有很好的重復使用性，經過再生后對特異性多肽或蛋白依然具有較高的富集能力。
【【附圖說明】】
[0019]圖1是具有以磁性無機物四氧化三鐵為核，雙層有機聚合物包裹的核-殼-殼結構的核殼材料的傅里葉紅外表征圖(a，單層聚合物包裹的磁球；b，雙層聚合物包裹的核-殼-殼結構的磁球)。
[0020]圖2是具有以磁性無機物四氧化三鐵為核，雙層有機聚合物包裹的核-殼-殼結構的核殼材料形貌圖；
[0021]圖2a 為 SEM 圖；
[0022]圖2b 為 TEM 圖；
[0023]圖3是具有以磁性無機物四氧化三鐵為核，雙層有機聚合物包裹的核-殼-殼結構的核殼材料的熱解重量分析表征圖(a，四氧化三鐵磁球；b，雙層聚合物包裹的核-殼-殼結構的磁球)。
【【具體實施方式】】
[0024]以下提供本發明一種金屬離子固定化親和磁球的制備方法及應用的【具體實施方式】。
[0025]實施例1
[0026]取2.7g的六水合三氯化鐵溶于10mL的乙二醇溶液，同時加入7.2g的無水乙酸鈉攪拌混合均勻，將混合溶液轉入高壓反應釜中于200°C進行高溫水熱反應8h，得到四氧化三鐵磁球。
[0027]將200mg的磁球超聲分散在1mL的水，40mL的乙醇和1.5mL的氨水混合溶液中，加入0.3mL的3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯與60°C下機械攪拌24h，得到聚合物包裹的磁球。
[0028]將50mg聚合物包裹的磁球分散在40mL的乙腈中，加入200 μ L的二甲基丙烯酸乙二醇酯和1mg的偶氮二異丁腈混合均勻，逐滴加入300 μ L的烯丙基氯單體，于90°C進行回流反應，得到以具有以四氧化三鐵為核，雙層有機聚合物包裹的核-殼-殼結構的磁球。
[0029]將200mg雙層有機聚合物包裹的磁球分散在50mL的三氯甲烷和50mL的三乙胺的混合溶液中，加入200mg的亞氨基乙二酸于90°C進行回流反應，得到以亞氨基乙二酸進行結構修飾的磁球。
[0030]將亞氨基乙二酸修飾的磁球加入含有2mol/L的硫酸鎳溶液中，用氫氧化鈉溶液將溶液PH值調整為7，在室溫下實現金屬離子的固定化，得到螯合金屬離子的磁性微球。
[0031]將螯合有金屬Ni離子的磁球與0.4mg/L牛血紅蛋白(BHb)溶液進行混合lh，利用永久磁鐵將吸附有BHb的磁球進行分離，去除上清液，移去磁鐵，用0.2g/mL的咪唑溶液進行洗脫，利用磁鐵進行磁分離，得到洗脫液，利用紫外分光光度計在406nm處檢測，計算吸附容量。
[0032]圖1是具有以磁性無機物四氧化三鐵為核，雙層有機聚合物包裹的核-殼-殼結構的核殼材料的傅里葉紅外表征圖。(a，單層聚合物包裹的磁球；b，雙層聚合物包裹的核-殼-殼結構的磁球。)
[0033]圖2是具有以磁性無機物四氧化三鐵為核，雙層有機聚合物包裹的核-殼-殼結構的核殼材料形貌圖(a (SEM)和b (TEM))。
[0034]圖3是具有以磁性無機物四氧化三鐵為核，雙層有機聚合物包裹的核-殼-殼結構的核殼材料的熱解重量分析表征圖。(a，四氧化三鐵磁球；b，雙層聚合物包裹的核-殼-殼結構的磁球)。
[0035]本方法制備的雙層聚合物包裹的磁球基質為有機無機雜化材料，由于被有機高分子包裹，因此，具有較好的化學穩定性，耐酸堿能力強。由于其粒徑小，具有較大的比表面積，因此，有較多的活性位點與亞氨基二乙酸配體結合，對金屬螯合離子有很強的作用能力，能很好的與特異性蛋白相結合，具有較高的富集容量。
[0036]以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍內。
【主權項】
1.一種金屬離子固定化親和磁球的制備方法，其特征在于，其具體步驟為: 第一、2.0?3.0g的三氯化鐵和90?IlOmL的乙二醇和7.0?7.5g的無水乙酸鈉進行均勻混合，在150?250°C進行高溫水解反應，得到四氧化三鐵磁球； 第二、將200?250mg四氧化三鐵磁球分散在體積比為1: 4?1: 6的乙醇和水的混合溶液中，逐滴加入0.3?0.5mL的3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯機械攪拌I?2天，得到聚合物包裹的磁球； 第三、將步驟二中得的聚合物包裹的磁球分散在40?50mL的乙腈中，加入200 yL的烯丙基氯單體和300?350 μ L 二甲基丙烯酸乙二醇酯的交聯劑及10?15mg偶氮二異丁腈引發劑于90?100°C進行回流反應，得到以具有以四氧化三鐵為核，雙層有機聚合物包裹的核-殼-殼結構的磁球； 第四、將步驟三中得的雙層有機聚合物包裹的核-殼-殼結構的磁球分散在40?50mL的1:1?1: 5的三氯甲烷與三乙胺的混合溶液中，加入200?300mg的亞氨基乙二酸于70?90°C進行回流反應，得到以亞氨基乙二酸進行結構修飾的磁球； 第五、將步驟四中得到的亞氨基乙二酸進行結構修飾的磁球加入含有0.05?2mol/L的可溶性銅、镲、鈦離子溶液中，用氫氧化鈉溶液將溶液pH值調整為6?9，在室溫下實現金屬離子的固定化，得到螯合金屬離子的磁性微球。
2.一種特異性多肽或者蛋白的富集檢測方法，其特征在于，其具體步驟為: (1)將制得的螯合金屬離子的磁球用水溶液進行清洗I?3次，去除游離的金屬離子； (2)將步驟(I)清洗后的螯合金屬離子的磁球與0.4?0.6mg/L蛋白質溶液進行混合I?2h，利用磁分離對與金屬離子特異性作用的多肽或者蛋白進行選擇性富集和快速分離，實現對高豐度的多肽或蛋白進行去除和低豐度的多肽或蛋白的富集； (3)將步驟(2)中吸附多肽或蛋白的磁球用0.2?0.4g/mL的咪唑溶液進行洗脫，用于檢測。
【專利摘要】本發明涉及一種金屬離子固定化親和磁球的制備方法及應用，以磁性無機物四氧化三鐵為核制備的雙層有機聚合物包裹的核-殼-殼結構的核殼材料，及其利用其與金屬離子作用對特異性多肽或者蛋白的富集檢測方法。利用高溫水熱反應制備得到磁性四氧化三鐵，采用硅烷基化試劑3-(三甲氧基甲硅烷基)丙基甲基丙烯酸酯對磁球進行包裹，形成單層聚合物包裹的核殼結構磁球，進一步利用沉淀聚合反應得到含有雙層有機聚合物包裹的核-殼-殼結構的磁球。對磁球表面進行修飾，得到以亞氨基乙二酸進行結構修飾的核-殼-殼結構磁球，進一步固定金屬離子，形成親和磁球。在本發明的制備材料中，具有很好的重復使用性，再生后對特異性多肽或蛋白依然具有較高的富集能力。
【IPC分類】B01J20-286, B01J20-30, G01N1-40
【公開號】CN104667899
【申請號】CN201510069196
【發明人】張維冰, 張磊, 陳雅靜, 高小迪, 張凌怡
【申請人】華東理工大學
【公開日】2015年6月3日
【申請日】2015年2月2日