金線蓮炭疽病lamp檢測引物及其可視化檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明金線蓮炭痘病LAMP檢測引物及其可視化檢測用法，專用于金線蓮炭痘病 高特異性、靈敏度可視化快速檢測，同時可用于田間金線蓮炭痘病的早期診斷和病菌的監 測和鑒定，屬于農作物病害檢測、鑒定及防治技術領域。
【背景技術】
[0002] 金線蓮是多年生珍稀中草藥，又名花葉開唇蘭，也有人將其稱為金絲草和金線入 骨消等，具有很高的藥用價值，如清熱涼血、接風利濕、強屯、利尿、固腎、平肝等功效。作為近 年來備受推崇的保健藥材，商家對此開發出了不少相關產品，受到消費者的廣泛喜愛，但野 生金線蓮對生長環境的要求苛刻，加上人工的過度采挖，已面臨滅絕的境地，目前，人工栽 培是解決上述問題的最佳方法。金線蓮的栽培技術也十分成熟，但金線蓮的病害問題也日 益凸顯，金線蓮種植大棚中出現了金線蓮移栽后炭痘病嚴重發生，炭痘病的病原菌為膠抱 炭痘菌，該病菌分類上屬于真菌界，半知菌亞口，腔抱綱，黑盤抱目、黑盤抱科的刺盤抱菌屬 及圓盤抱屬，膠抱炭痘菌菌絲最適宜生長的溫度為28°c，分生抱子產生及萌發的最適溫度 為28°C至32°C，相對濕度為85%。目前金線蓮生產上炭痘病發病面積大，傳染速度快，嚴重 影響到金線蓮的產量和品質。同時，由于目前缺乏有效的病害早期診斷技術，發病后盲目大 量使用藥劑防治也引起金線蓮的農藥殘留，造成食品安全問題。因此，研發出金線蓮病害的 早期快速診斷并進行及時監測，對保障金線蓮健康生產及食品安全至關重要。
[0003] 目前病害檢測方法主要采用傳統的病原分離檢測方法和分子檢測等技術。傳統 檢測方法耗時、耗力，且檢測結果可靠性低，免疫學檢測技術的靈敏度較低，且抗體的制作 過程耗時、復雜，檢測成本高，PCR技術雖然快速、準確，但需昂貴的儀器設備，檢測成本高， 不適宜在基層部口推廣應用。而最近科學家們研發出的環介導等溫擴增（loop-mediated isothermalamplification,LAMP)技術是一種高效率的核酸等溫擴增方法，該方法短時間 內實現產物的大量擴增，靈敏度比PCR高，且操作步驟簡便，無需特殊設備，檢測結果可由 肉眼判斷，極適合于在基層生產部口推廣應用。本研究基于環介導等溫擴增（LAMP)技術， 建立金線蓮炭痘病的可視化檢測，根據LAMP技術原理，選取金線蓮炭痘病菌的核糖體基因 上的內轉錄間隔區（Internal化anscribedSpacer, 口巧勒1序列的6個區域，進而設計出 4條特異性引物，通過對反應體系和反應條件的優化，W巧黃綠素（Calcein)的巧光顯色指 示劑作用，建立可視化LAMP檢測技術。該體系對金線蓮炭痘病檢測具有高的特異性與靈敏 性，檢出限為10fg，比常規PCR靈敏度高1000倍。并在此基礎上研發出可視化快速檢測試 劑盒。該技術是一種操作簡單、靈敏度和特異性高的快速檢測手段；無需特殊儀器設備，同 時開發的快速檢測試劑盒適合田間金線蓮生產中開展實地檢測與監測，從而保障金線蓮健 康生產及食品安全。
[0004] 目前，對植物病害的傳統檢測鑒定方法是首先進行病菌分離，通過對已經分離并 純化的病菌進行培養，觀察，完成形態上的鑒定工作。同時，將病原菌回接到植株中，進行致 病性的驗證。最后，對照已有的分類資料確定引起病害的病原菌的分類和地位。該法作為 最基本的病原菌鑒定方法在一直W來被廣泛使用，有著很強實用性，是病原菌的鑒定及病 害檢測的方法之一，但是該方法受人為因素和環境的影響，對操作者的實驗技能和實際經 驗有很高的要求，十分耗時，無法達到快速檢驗的要求。
[0005] 免疫學檢測技術（Immunologicaltechnology)具有操作簡單、特異性強，W及檢 測時間短的優點，適合開發檢測試劑盒。但其不能對檢測對象進行擴增，所W靈敏度不及核 酸檢測技術高。另外，抗體的制作過程耗時、復雜，提高了檢測的成本。運兩點缺點限制了 免疫學檢測技術的推廣使用。
[0006] 聚合酶鏈式反應（PolymeraseQiainReaction,PCR)是一種利用DNA聚合酶在體 外大量擴增祀序列的技術，該技術是病原檢測最常規的方法之一，廣泛應用于病原鑒定、變 異檢測等分子生物學研究。PCR檢測技術靈敏度高、特異性強，已成為病原菌檢測重要的技 術之一，主要包括常規PCR、巢式PCR(化St-PCR)和實時巧光定量PCR等，主要的缺點是需 要依靠PCR等儀器設備，不利于基層生產上推廣應用。
[0007] 環介導等溫擴增化oop-mediatedIsthermalAmplification,LAMP)技術是由日 本科學家開發的一種最新的簡便、快速、準確及廉價的核酸高效擴增方法（Notomietai.， 2000)。LAMP技術是一種新型的核酸恒溫擴增方法。該技術在等溫條件下，可在短時間內使 產物得到大量擴增，在短短的30min~60min內就能實現1〇9-1〇1°倍的擴增同時具有很高的 靈敏度和特異性，且操作簡便，檢測結果可肉眼判斷，反應結束后用肉眼觀察是否產生焦憐 酸儀沉淀，即可判斷祀序列是否存在。亦可在反應液中加入巧光指示劑，使反應結果的肉眼 觀察更加的方便、直觀和可靠。
[0008] LAMP技術操作簡單、快速高效，而且檢測特異性非常強，其最大的優勢就是在恒 溫條件即可進行擴增反應，無需特殊實驗設備，相較于普通PCR技術，其有很多優點(表1 )。
[0009] 表1.LAMP技術與常規PCR技術比較
綜上，目前植物病害的檢測主要有傳統檢測和分子生物學檢測。其中，傳統檢測法耗 時、耗力，檢測結果可靠性往往比較低；分子生物學檢測法主要有常規PCR、化St-PCR和 qPCR等，PCR方法能快速、準確地檢測病原，但需特定儀器設備，且檢測成本比較高，不適合 基層檢驗檢疫部口的推廣應用，使田間病情難W得到及時、準確的檢測，嚴重阻礙了金線蓮 產業發展。基于目前金線蓮炭痘病在福建省嚴重發生，因此，建立一套簡便、快速、準確、有 效、經濟的金線蓮炭痘病的檢測技術非常重要。此技術可應用于金線蓮炭痘病菌引起病害 顯癥之前的早期監測，對于確定病害防治最佳時期具有重要的作用，為防治策略的制定提 供技術支持。由于LAMP反應簡單、快速、高效、經濟等特征，因而具有極為廣泛的應用前景。 目前LAMP檢測主要應用于人畜病原物、食品安全和環境衛生的檢測，在植物病原菌檢測中 報道極少，金線蓮炭痘病的檢測國內外均未見報道。

【發明內容】

[0010] 本發明的目的是針對現有技術中金線蓮炭痘病的傳統檢測方法所需周期長、檢測 方法特異性差，PCR檢測需要依靠擴增儀等設備，且靈敏度低的問題，提供一種金線蓮炭痘 病的LAMP檢測引物W及結果可靠、易于操作、特異性強、靈敏度高的金線蓮炭痘病的可視 化檢測方法。
[0011] 實現本發明的目的包括下列步驟： 1. LAMP引物的設計 根據金線蓮炭痘病菌核糖體內轉錄間隔區（rDNA-ITS)序列在真菌種間高度變異和種 內穩定性，采用PrimerE邱IorerV4軟件設計了對金線蓮炭痘病菌具有特異擴增作用的 LAMP檢測引物，包括2條外引物（F3和B3)和2條內引物（FIP和BIP)，引物序列分別 為：
2. 金線蓮炭痘病快速檢測體系的建立 LAMP檢測：25yl反應體系中含20mMTris-肥l，10mM(NH4)2S〇4，l〇mMKCl，8mMM拆〇4， 甜菜堿 0. 8 DNA聚合酶為 8U，dNTPs1.0mmol/l，F3 和B3 為 0. 2mmol/l，FIP 和81口各1.6臟〇1/1，巧黃綠素50^111〇1/1，氯化儘500 ^111〇1/1^胖6611-20 0.1%，模板0臟 50~100ng，不足部分用無菌雙蒸水補足；LAMP反應條件為在63-65°C溫育45-60min, 85°C 滅活 5-lOmin。
[0012] 所述的檢測方法為巧光染料目測觀察法或瓊脂糖凝膠電泳法。所述巧光染料目測 觀察法：在LAMP反應后，顯色結果觀察到綠色巧光判斷為陽性，澄色判斷為陰性。所述瓊脂 糖凝膠電泳法：取2y1PCR擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，如果出現LAMP特征性的 梯形帶判斷為陽性，沒有出現擴增條帶判斷為陰性。
[0013] 所述的金線蓮炭痘病LAMP檢測引物在田間金線蓮炭痘病的早期診斷和病菌的監 測和鑒定上的應用。
[0014] 該方法可用于帶菌的植株的高靈敏度快速檢測。建立金線蓮炭痘病快速、簡便、特 異性強、靈敏度高的監測技術體系，對于金線蓮炭痘病顯癥之前的早期監測，確定病害防治 最佳時期具有十分重要的意義。
[0015] 本發明的關鍵性技術是金線蓮炭痘病菌的高效特異擴增的引物序列及其擴增方 法。為了驗證金線蓮炭痘病檢測的特異性，本發明W采集分離的25株金線蓮炭痘病菌和28 種其它病原真菌為供試材料，對檢測的特異性進行LAMP驗證。
[0016] LAMP檢巧U:25yl反應體系中含 20mMTris-肥l，10mM(NH4)2S〇4，l〇mMKCl，8mM M拆〇4,甜菜堿 0. 8mol/L，化f聚合酶為 8U，dNTPsI. 0mmol/L，F3 和B3 為 0. 2mmol/L， 門口和81口各1.6臟〇1/1，巧黃綠素50^111〇1/1，氯化儘500 ^111〇1/1^胖6611-20 0.1%，模板 DNA50~100ng，不足部分用無菌雙蒸水補足；LAMP反應條件為在63-65°C溫育45-60min, 85°C滅活 5-lOmin。
[0017] 除了 25株金線蓮炭痘病菌顯色結果可觀察到綠色巧光或瓊脂糖凝膠電泳檢測出 現LAMP特征性的梯形帶外，檢測了 28種其它真菌菌株的顯色結果為澄色或瓊脂糖凝膠電 泳沒有出現擴增條帶。運說明該引物可被用于生產實踐中金線蓮炭痘病快速可靠的檢測和 鑒定。
[0018] 當在用于金線蓮組織中存在炭痘病菌的檢測時，采用化OH快速裂解法提取金線 蓮炭痘病菌的DNA，具體過程如下：（1)將金線蓮病葉或病莖洗凈、驚干，剪取發病部位；（2) 按Img病葉加入10y1 (0. 5mol/L化0H，0. 5%PVP)計量，將組織充分磨碎成糊，在12,OOOg 離屯、機中離屯、5min; (3)取上清20Ji1與等體積的0. 1mol/L的Tris-肥1 (P冊.0)混合； (4)稀釋10倍、100倍、1000倍液，分別取1y1原液、10倍、100倍、1000倍液作為PCR模 板進行擴增。
[0019] 按如下LAMP反應體系和反應條件用所設計的引物進行檢測： ①LAMP反應體系 25y1 :25y1 反應體系中含 20mMTris-肥 1，IOmM(畑4)25〇4,IOmM KCl，8mMM拆〇4,甜菜堿0. 8mo