基于lamp技術檢測罌粟的引物、試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種基于LAMP技術檢測罌粟的引物、試劑盒及檢測方法，本發明基于LAMP技術檢測罌粟的引物,其特征在于包括：正向外引物F3：5'?TCGATGAAAAATTCCCTGAAC?3'；反向外引物B3：5'?CACGTTTAGGGGTACTGAT?3'；正向內引物FIP和反向內引物BIP；本發明的目的是為了克服現有技術中的不足之處，提供一種快速、簡便、高效、準確性高、特異性強、靈敏性高，基于LAMP技術檢測罌粟的引物；本發明另一個目的是提供一種包含上述引物的用于檢測檢測罌粟的試劑盒；本發明另一個目的是提供一種采用上述試劑盒檢測檢測罌粟的方法。
【專利說明】
基于LAMP技術檢測罌粟的引物、試劑盒及檢測方法
技術領域
[0001] 本發明涉及一種用于檢測罌粟的引物、試劑盒及檢測方法，屬于生物技術領域。
【背景技術】
[0002] 罌粟學名:Papaver somniferum L.，罌粟科植物，是制取鴉片的主要原料，未成熟 果實含乳白色漿液，制干后即為鴉片，其提取物也是多種鎮靜劑的來源，如嗎啡、可待因、和 罌粟堿等多種生物堿，其中嗎啡是其主要成分，加工入藥，有斂肺、澀腸、止咳、止痛和催眠 等功效，治久咳、久瀉、久痢、脫肛、心腹筋骨諸痛;學名"somniferum"的意思是"催眠"，反映 出其具有麻醉性。罌粟的種子罌粟籽是重要的食物產品，其中含有對健康有益的油脂，廣泛 應用于世界各地的沙拉中，而罌粟花絢爛華美，是一種很有價值的觀賞植物。罌粟果殼性微 寒，味酸澀，有小毒，含低量嗎啡等生物堿。另含多糖約2.4%，水解可得乳糖10%、阿拉伯糖 6%、木糖6%、鼠李糖4%、乳糖醛酸Galacturonic acid 60%、4-〇_甲基葡萄糖醛酸-〇-Methylglucuronic acid 4%、微量巖藻糖Fucose、2-〇_甲基巖藻糖2-〇_Methylfucose、2-〇-甲基木糖2-〇_Methylxylose及葡萄糖酸酸G-tucuronic acid、景天庚糖Sedoheptulose、 D-甘露庚酮糖 D_Mannoheptulose、D-甘油基-D-甘露辛酮糖 D-Glycero-D-Mannooctulose、 內消旋肌醇Mesoinositol、赤蘚醇Erythritol，有斂肺、濕腸、止痛的作用，用于久咳、久瀉、 脫肛、脘腹疼痛，但是該品易成癮，不宜常服。目前一些不法商販將罌粟殼作為食品添加劑 加入到火鍋底料、鹵湯、燒烤味調料等食品中，使人食用后產生快感，并逐漸產生依賴性以 達到招攬回頭客的目的。人如果長期食用含有罌粟成分的食物，就會出現興奮、煩躁不安、 冒虛汗、全身乏力犯困、面黃肌瘦等慢性中毒癥狀，還會使人嗜睡、性格改變、記憶力減退， 長期食用還會導致精神失常、出現幻覺;還容易是車輛駕駛員犯困、注意力不集中而造成交 通事故;添加了罌粟殼的食品由于非常容易使人上癮，甚至走上吸毒犯罪的道路等等，這種 違法行為嚴重損壞了消費者的健康，業已成為食品安全的嚴重的隱患。我國早就明文禁止 在食品中添加罌粟成分的，國務院已經將罌粟殼列入《麻醉藥品管理辦法》名錄中，將罌粟 殼按照麻醉品進行管理。因此，建立一種更加快速、靈敏、方便的檢測方法是保障人民身體 健康的一項重要手段、是行政執法的技術后盾、新的檢測技術和方法已經成為一項迫切需 要的政治任務，刻不容緩。
[0003] 目前我國對于罌粟的檢測還沒有一個統一的標準，主要檢測方法有化學分析法、 薄層色譜法、免疫分析法、氣質聯用法以及液相色譜法等。化學分析法是根據罌粟殼所含的 生物堿與特定試劑反應顯色來作定性檢測，簡單迅速但靈敏度低;薄層色譜法也是根據罌 粟殼所含的生物堿來檢測，可以同時檢測多種生物堿，但是檢測靈敏度也低、特異性差，且 易污染環境;免疫分析法是利用罌粟的生物堿制備的特異性抗體來檢測生物堿抗原的存在 與否，檢測靈敏度可達〇. l_20ug/kg，該方法比較快速、通量較高、靈敏度也較強，可以作為 日常大量樣品篩查檢測之用，但是該方法不能準確定量，且抗體制備較難又不易保存，重復 性不高，假陽性率高。氣相色譜法GC、氣相色譜質譜法GC-MS、高效液相色譜法HPLC、液相色 譜-串聯質譜法LC-MS:可以檢測嗎啡和可卡因等，雖然檢測靈敏度較高，但都需要昂貴的設 備、環境要求高、檢測周期長、檢測費用昂貴、還需要專業訓練過的技術人員，不適合基層和 現場檢測。另外上述方法都是對生物堿進行間接的檢測，不能對罌粟物種來源進行準確的 定性。
[0004] 目前火鍋底料和小吃類食品等中的非法添加罌粟殼的現象已經引起了人們對食 品安全問題的高度重視和全社會的廣泛關注，為了能夠盡快準確的給監管執法提供執法依 據，迫切需要能夠又快又準又方便且適合基層普通實驗室對罌粟物種來源進行準確的定性 的檢測方法。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的是為了克服現有技術中的不足之處，提供一種快速、簡便、高效、準 確性高、特異性強、靈敏性高，基于LAMP技術檢測罌粟的引物；
[0006] 本發明另一個目的是提供一種包含上述引物的用于檢測檢測罌粟的試劑盒；
[0007] 本發明另一個目的是提供一種采用上述試劑盒檢測檢測罌粟的方法。
[0008] 為了達到上述目的，本發明采用以下方案：
[0009] -種基于LAMP技術檢測罌粟的引物，其特征在于包括：
[0010] 正向外引物卩3:5，-1^1^丁6厶厶厶厶厶1'1^0^6厶厶(：-3，；
[0011] 反向外引物83:5'-〇厶〇61'11^666丁厶〇^1'-3'；
[0012]正向內引物FIP和反向內引物BIP;
[0013] 其中所述正向內引物FIP包含Flc和F2序列：
[0014] 5'-CCTGATAAGAAAGCCATGGATTCA-TGGGGTTAGTAGATAAAGAGTT-3'；
[0015]
[0016] F2:5，-TGGGGTTAGTAGATAAAGAGTT-3，；
[0017]所述反向內引物BIP包括含Blc和B2序列：
[0018] 5 '-TACCATCTCTGAACTAAACAACAGG-TCAACTTTAGTCTTAAAAGCTCT-3 '；
[0019]
[0020] B2:5，-TCAACTTTAGTCTTAAAAGCTCT-3，。
[0021 ] -種基于LAMP技術檢測罌粟的試劑盒，其特征在于包括有： 2 X反應液緩沖液 0. 5mL 引物 〗;5(ua 酶溶液 60 μ I
[0022] 陽性對照 20 W L 對照引物溶液 20 μ L 去離子水 ΙΟΟ??α
[0023] 所述的引物包括：
[0024] 正向外引物卩3:5，-1^1^丁6厶厶厶厶厶1'1^0^6厶厶(：-3，；
[0025] 反向外引物83:5，-〇厶〇61'7^6666丁厶(^6厶1'-3，；
[0026] 正向內引物FIP和反向內引物BIP;
[0027] 其中所述正向內引物FIP包含Flc和F2序列：
[0028] 5'-CCTGATAAGAAAGCCATGGATTCA-TGGGGTTAGTAGATAAAGAGTT-3'；
[0029] 其中 F1 c: 5，-CCTGATAAGAAAGCCATGGATTCA-3 ' ；
[0030] F2：5'-TGGGGTTAGTAGATAAAGAGTT-3'；
[0031]所述反向內引物BIP包括含Blc和B2序列：
[0032] 5 '-TACCATCTCTGAACTAAACAACAGG-TCAACTTTAGTCTTAAAAGCTCT-3 '；
[0033] 其中Blc:5，-TACCATCTCTGAACTAAACAACAGG-3，；
[0034] B2:5'-TCAACTTTAGTCTTAAAAGCTCT-3'；
[0035]其中該試劑盒的產品規格:50次。
[0036] 如上所述的試劑盒，其特征在于所述的反應液緩沖液2 X由以下組分組成： Tris-lICl (nll8. 8) 40??ιΜ KC1 20mM ig：S04 16mM：
[0037] (NIi/!)2S(M 200mM Tween20 0:. 2%： Betaine 1, 6M. dNTPs 2. 8mM 〇
[0038] 如上所述的試劑盒，其特征在于所述的酶溶液為Bst DNA聚合酶和AMV逆轉錄酶混 合液。
[0039] 如上所述的任一種試劑盒，其特征在于在所述2 X反應液緩沖液中含有鈣黃綠素 熒光染料。
[0040] -種基于LAMP技術檢測罌粟的方法，其特征在于包括以下步驟：
[0041 ] A、米用納米磁珠提取待測樣品的DNA;
[0042] B、采用如權利要求5所述的試劑盒，在冰上，按比例取反應液緩沖液、引物、酶溶 液、陽性對照、去離子水放入滅菌管中配制預混液；
[0043] C、將適量待測樣品的DNA加入步驟B中的滅菌管中；
[0044] D、將步驟C中的試管放置在AB7500熒光定量PCR儀中，在63°C下保持恒溫1小時；
[0045] E、如果待檢樣品與陽性對照一樣出現典型的S擴增曲線，則判定為陽性，如果與陰 性對照一樣沒有擴增曲線，而判定為陰性。
[0046] 如上所述的方法，其特征在于步驟A中采用納米磁珠提取待測樣品DNA的具體步 驟：
[0047] a、制樣:取0. lg的植物組織加入lmL抽提緩沖液進行研磨；
[0048] b、清洗納米磁珠:取出免疫納米磁珠到PCR管中，用ddH20反復清洗納米磁珠3次， 在磁鐵的作用下吸去ddH 20;
[0049] c、結合:加入100yL的樣品到PCR管中，用移液槍吸吐混勻樣品和納米磁珠，室溫下 吸附；
[0050] d、清洗:在磁鐵的作用下移去上清，納米磁珠清洗3次；
[0051 ] e、裂解:加入50yL ddH20到PCR管中，用移液槍吸吐混勻納米磁珠后，95 °C，lOmin;
[0052] f取樣:用磁鐵吸附納米磁珠，待PCR管內溶液澄清后，上清即為待測樣品DNA。
[0053] 如上所述的方法，其特征在于所述的免疫納米磁珠通過以下工藝制作：
[0054]①納米磁珠的制備
[0055]分別取5.2g FeCl3 · 6H20、2.7g FeS〇4 · 7H20、0.85mL 12.1moL/L的濃鹽酸溶解于 200mL水中，超聲脫氧，后將以上溶液滴入250mL、0.75moL/L NaOH溶液;在80°C下攪拌，反應 結束后，利用磁分離器將所得沉淀從反應介質中分離出來，再用去離子水清洗3次，無水乙 醇清洗2次，并配成5g/mL的Fe3〇4磁性納米粒子無水乙醇溶液;取25mL Fe3〇4磁性納米粒子 無水乙醇溶液，再用無水乙醇稀釋到150mL，超聲振蕩30min;滴加0.4mL APTES，室溫下攪拌 7h;反應完畢，用磁分離器將APTES修飾的Fe3〇4磁性納米粒子從反應介質中分離，并用無水 乙醇溶液清洗3次，最后配成10.5mg/mL的氨基化Fe 3〇4納米磁珠無水乙醇溶液；
[0056]②免疫磁珠的制備
[0057] 取0.5mL氨基化Fe3〇4納米磁珠無水乙醇溶液，用lmL PBS清洗3次，磁分離器棄上清 液;加入5 % (V/V)戊二醛溶液2mL，室溫振蕩交聯2h，磁分離，棄上清液；用PBS洗滌3次并棄 上清液后，分別采用0.5mL病毒抗體包被氨基化Fe3〇4納米粒子，室溫下振蕩固定2h;磁分離， 用PBS和超純水分別洗滌3次，再用PBS定容，4°C冰箱保存備用，得到免疫磁珠。
[0058]本發明中用到的一些材料：
[0059] 1.1植物：
[0060] 虞美人Papaver rhoeas和罌粟種子購于醫藥公司。
[0061 ] 1.2主要試劑和耗材
[0062] (l)PCR反應試劑：10XPCR buffer、dNTPs、MgC12、Taq DNA聚合酶，寶生物工程（大 連)有限公司；
[0063] (2)DNA Marker DL1000、6 X loading buffer，寶生物工程(大連）有限公司；
[0064] (3)LAMP 反應試劑；
[0065] (4)Bst DNA polymerase large fragment，New England Biolabs公司；
[0066] (5)甜菜堿(Betaine)，廣州威佳生物有限公司；
[0067] dNTPs、MgC12,寶生物工程(大連)有限公司；
[0068] (6)50XTAE緩沖液：將242g Tris與37.2g Na2EDTA · 2H20溶于800mL去離子水中， 充分攪拌溶解，再加入57. lmL醋酸，攪拌均勻，最后用去離子水將溶液定容至1L，使用時稀 釋50倍；
[0069] (7)瓊脂糖，廣州捷倍斯生物有限公司；
[0070] (8)70% 乙醇；
[0071] (9)LAMP引物（正向外引物F3、正向內引物FIP、反向內引物BIP、反向外引物B3)及 PCR引物(上游引物、下游引物），寶生物工程(大連)有限公司合成；
[0072] (10)納米磁珠 (magnetic nano particles，MNP)試劑盒購自北京金納科技有限公 司；
[0073] 1.3主要儀器設備
[0074] (1) 一8〇Γ冷凍冰箱；
[0075] (2) Labof uge400R高速冷凍臺式離心機；
[0076] (3)普通PCR儀及AB7500熒光定量PCR儀；
[0077] (4)法國UVP凝膠成像系統；
[0078] (5)DYY_7型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；
[0079] (6)微量移液器，1 OOOyL、200yL、1 OOyL、1 OyL，2 · 5yL，；
[0080] (7)微波爐；
[0081] (8)分析天平，梅特勒一托利多儀器有限公司；
[0082] (9)高溫高壓滅菌鍋；
[0083] (10)超純水系統，Milli - Q Academic，Millipore公司；
[0084] (11)日本Shimadzu公司UV-120-02型可見一紫外分光光度計；
[0085] (12)超凈工作臺；
[0086] (13)漩渦混合器；
[0087] (14)酶聯檢測儀；
[0088] (15)AB7500 熒光定量 PCR 儀；
[0089]綜上所述，本發明的有益效果：
[0090] 利用本發明引物、試劑盒及檢測方法檢測罌粟，具有快速、簡便、高效、準確性高、 特異性強、靈敏性高等優點。
【附圖說明】
[0091] 圖1為用本發明引物檢測罌粟的擴增檢測曲線圖；
[0092] 其中1:罌粟陽性對照;2:含有罌粟的待檢樣品；3:陰性對照及虞美人樣品。
【具體實施方式】
[0093]下面結合【具體實施方式】對本發明做進一步描述：
[0094] 實施例1 [0095]本發明試劑盒：
[0096] 1.產品規格:50次
[0097] 2.特點：
[0098] 環介導等溫擴增法loop-mediated isothermal amplification,LAMP是一種新型 基于擴增方法，僅用一種酶在恒溫下進行擴增，由于使用能夠識別靶DNA 6個特異序列的6 條引物，所以特異性高，且擴增效率非常高，能夠在短時間大量擴增，反應結果可以目測判 定。
[0099] 本試劑盒采用環介導等溫擴增法，以脫氧核糖核酸DNA為模板直接進行逆轉錄環 介導等溫擴增的簡易試劑盒，本試劑盒使用混合逆轉錄酶和DNA聚合酶的酶溶液，只需將待 測樣品和本試劑盒中的試劑按照要求混合后置于一定的溫度下63°C反應1小時左右，即可 從AB7500儀器上的擴增曲線判定結果。
[0100] 3.試劑盒組成內容：
[0101] 1 )· LAMP反應液緩沖液0 · 5mL
[0102] 2).引物 150yL
[0103] 3).酶溶液 60yL
[0104] 4).陽性對照(20yL)
[0105] 5).對照引物溶液(20yL)
[0106] 6).去離子水（lOOOyL)
[0107] 4.操作方法：
[0108] 1).試劑的配制：
[0109] a.取_20°C下保存的各種試劑在室溫下解凍，解凍后立即置于冰上保存；
[0110] b.預混液的配制（在冰上進行）：取檢測所需的反應量，按照下表比例（一個反應） 分別分裝在另外準備的預混溶液配制用的滅菌管中：
[0112] 其中反應緩沖液成分(2X): Tris-HCl(pH8. 8) 40mM
[0113] KC1 20mM MgS04 16mM： (NIM)2S04 :200mM
[0114] Tween20 0 ?()， Betaine 1.·.碰 dNTPs 2. 8mM/種
[0115] 酶溶液：
[0116] Bst DNA聚合酶和AMV逆轉錄酶混合液。
[0117] 反應緩沖液中含有鈣黃綠素熒光染料：
[0118] 鈣黃綠素初始與與錳離子結合而處于熒光猝滅狀態，隨著LAMP反應的進行，，由于 反應副產物焦磷酸離子奪取與鈣黃綠素結合的錳離子而使得鈣黃綠素恢復游離出來從而 發出熒光，而且鈣黃綠素一旦與反應液中的鎂離子結合，還會使得熒光得到增強。引物：
[0119] 罌粟通用引物序列(5'_3'）
[0120]
[0121 ] c.分裝后輕彈擊試管使其混勻，瞬時離心數秒使溶液集中在試管底部；
[0122] 2).加樣:往分裝好的試管中分別加入制備好的待檢測樣品的DNA 2yL，使總量達 至lj20yL，陰性對照反應使用去離子水2yL作為樣品，陽性對照反應使用帶有該罌粟病毒核酸 的陽性對照，然后蓋上試管蓋輕擊混合，瞬時離心使反應溶液集中在試管底部；
[0123] 3).擴增：將試管放置在AB7500熒光定量PCR儀中，在63°C下保持恒溫1小時，然后 直接觀測熒光擴增曲線；
[0124] 4).結果判定：如果待檢樣品與陽性對照一樣出現典型的S擴增曲線，則判定為陽 性，如果與陰性對照一樣沒有擴增曲線，而判定為陰性。
[0125] 實施例2
[0126]本發明檢測罌粟的檢測方法，包括以下步驟：
[0127 ] A、米用納米磁珠提取待測樣品的DNA;
[0128] 通過以下工藝制作免疫納米磁珠：
[0129] ①納米磁珠的制備
[0130] 分別取5.2g FeCl3 · 6H20、2.7g FeS〇4 · 7H20、0.85mL 12.1moL/L的濃鹽酸溶解于 200mL水中，超聲脫氧，后將以上溶液滴入250mL、0.75moL/L NaOH溶液;在80°C下攪拌，反應 結束后，利用磁分離器將所得沉淀從反應介質中分離出來，再用去離子水清洗3次，無水乙 醇清洗2次，并配成5g/mL的Fe3〇4磁性納米粒子無水乙醇溶液;取25mL Fe3〇4磁性納米粒子 無水乙醇溶液，再用無水乙醇稀釋到150mL，超聲振蕩30min;滴加0.4mL APTES，室溫下攪拌 7h;反應完畢，用磁分離器將APTES修飾的Fe3〇4磁性納米粒子從反應介質中分離，并用無水 乙醇溶液清洗3次，最后配成10.5mg/mL的氨基化Fe 3〇4納米磁珠無水乙醇溶液；
[0131] ②免疫磁珠的制備
[0132] 取0.5mL氨基化Fe3〇4納米磁珠無水乙醇溶液，用lmL PBS清洗3次，磁分離器棄上清 液;加入5 % (V/V)戊二醛溶液2mL，室溫振蕩交聯2h，磁分離，棄上清液；用PBS洗滌3次并棄 上清液后，分別采用0.5mL病毒抗體包被氨基化Fe3〇4納米粒子，室溫下振蕩固定2h;磁分離， 用PBS和超純水分別洗滌3次，再用PBS定容，4°C冰箱保存備用，得到免疫磁珠。
[0133] 具體提取方法：
[0134] a、制樣:取0. lg的罌粟組織加入lmL抽提緩沖液進行研磨；
[0135] b、清洗納米磁珠:取出免疫納米磁珠到PCR管中，用ddH20反復清洗納米磁珠3次， 在磁鐵的作用下吸去ddH20;
[0136] c、結合:加入100yL的樣品到PCR管中，用移液槍吸吐混勻樣品和納米磁珠，室溫下 吸附；
[0137] d、清洗:在磁鐵的作用下移去上清，納米磁珠清洗3次；
[0138] e、裂解:加入50yL ddH20到PCR管中，用移液槍吸吐混勻納米磁珠后，95°C，lOmin;
[0139] f取樣:用磁鐵吸附納米磁珠，待PCR管內溶液澄清后，上清即為待測樣品DNA。
[0140] B、在冰上，按以下比例取反應液緩沖液、引物、酶溶液、陽性對照、去離子水放入滅 菌管中配制預混液;其中預混液一次反應量合計20yL，其中包括10yL反應緩沖液，1.2yL酶 溶液，3yL引物，3.8yL去離子水。其中3yL引物中包括有0.12yL正向外引物F3，0.12yL反向外 引物B3，1. OyL正向內引物FIP和1. OyL反向內引物B IP;環引物LF0.38yL和LB0.38yL。
[0141] 其中所述的引物包括：
[0142] 正向外引物卩3:5'-〇：1'11^^1'1'1'0^〇6厶6厶丁6厶(：-3'；
[0143] 反向外引物83:5'-厶0^0^〇厶(^0：0：1'(：-3'；
[0144] 正向內引物FIP和反向內引物BIP;
[0145] 其中所述正向內引物FIP包含Flc和F2序列：
[0146] 5 '-TCCAAGCCAAATAAACGATTTTGAAGTGAGGCACATATTCAAATGAAGG-3 '；
[0147] 其中FIc: 5 ' -TCCAAGCCAAATAAACGATTTTGAA-3 ' ；
[0148] F2:5，-GTGAGGCACATATTCAAATGAAGG-3，；
[0149] 所述反向內引物BIP包括含Blc和B2序列：
[0150] 5'-GGAAACGTCGAAACACAAGAAGAGAGGAGGTTGTGCATGTTG-3'；
[0151]
[0152] B2:5 '-AGAGGAGGTTGTGCATGTTG-3 '。
[0153] C、將適量待測樣品的DNA加入步驟B中的滅菌管中；具體步驟:往分裝好的試管中 分別加入制備好的待檢測樣品的DNA 2yL，使總量達到20yL，陰性對照反應使用去離子水和 虞美人的核酸2yL作為樣品，陽性對照使用帶有罌粟種子的DNA，然后蓋上試管蓋輕擊混合， 瞬時離心使反應溶液集中在試管底部；
[0154] D、將步驟C中的試管放置在AB7500熒光定量PCR儀中，在63°C下保持恒溫1小時；
[0155] E、結果判定：如果待檢樣品與陽性對照一樣出現典型的S擴增曲線，則判定為陽 性，如果與陰性對照一樣沒有擴增曲線，而判定為陰性。
【主權項】
1. 一種基于LAMP技術檢測磐粟的引物，其特征在于包括： 正向外引物F3:5 ' -TCGATGAAAAATTCCCTGAAC-3 ' ； 反向外引物B3:5 ' -CACGTTTAGGGGTACTGAT-3 ' ； 正向內引物FIP和反向內引物BIP; 其中所述正向內引物FIP包含Flc和F2序列： 5'-CCTGATAAGAAAGCCATGGATTCA-TGGGGTTAGTAGATAAAGAGTT-3'； 其中Flc: 5 '-CCTGATAAGAAAGCCATGGATTCA-3 ' ； F2：5'-TGGGGTTAGTAGATAAAGAGTT-3'； 所述反向內引物BIP包括含Blc和B2序列： 5'-TACCATCTCTGAACTAAACAACAGG-TCAACTTTAGTCTTAAAAGCTCT-3'； 其中Blc: 5 '-TACCATCTCTGAACTAAACAACAGG-3 ' ； B2:5'-TCAACTTTAGTCTTAAAAGCTCT-3'〇2. -種基于LAMP技術檢測磐粟的試劑盒，其特征在于包括有： 2 X反應液緩沖液 0. 5niL 引物 1加 μL 酶溶液 60 μ L 陽性對照 20 μ L 對照引物溶液 20 μ L 去離子水 1000 μ L 所述的引物包括： 正向外引物F3:5 ' -TCGATGAAAAATTCCCTGAAC-3 ' ； 反向外引物Β3:5 ' -CACGTTTAGGGGTACTGAT-3 ' ； 正向內引物FIP和反向內引物ΒΙΡ; 其中所述正向內引物FIP包含Flc和F2序列： 5'-CCTGATAAGAAAGCCATGGATTCA-TGGGGTTAGTAGATAAAGAGTT-3'； 其中Flc: 5 '-CCTGATAAGAAAGCCATGGATTCA-3 ' ； F2：5'-TGGGGTTAGTAGATAAAGAGTT-3'； 所述反向內引物BIP包括含Blc和B2序列： 5'-TACCATCTCTGAACTAAACAACAGG-TCAACTTTAGTCTTAAAAGCTCT-3'； 其中Blc: 5 '-TACCATCTCTGAACTAAACAACAGG-3 ' ； B2:5'-TCAACTTTAGTCTTAAAAGCTCT-3'； 其中該試劑盒的產品規格:50次。3. 根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于所述的反應液緩沖液2 X由W下組分組 成： Tris-nCl (ρ?Ι8. 8) 4()πιΜ KCI 2：6mM Μ輯(Μ. 巧曲Μ (NIM) 2S01 200mM Twee：n20： 0.2% Betaine. 1.時M dNTPs 2.愛慚M。4. 根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述的酶溶液為Bst DM聚合酶和AMV逆 轉錄酶混合液。5. 根據權利要求2-4所述的任一種試劑盒，其特征在于在所述2 X反應液緩沖液中含有 巧黃綠素巧光染料。6. -種基于LAMP技術檢測磐粟的方法，其特征在于包括W下步驟： A、 采用納米磁珠提取待測樣品的DNA; B、 采用如權利要求5所述的試劑盒，在冰上，按比例取反應液緩沖液、引物、酶溶液、陽 性對照、去離子水放入滅菌管中配制預混液； C、 將適量待測樣品的DNA加入步驟B中的滅菌管中； D、 將步驟C中的試管放置在AB7500巧光定量PCR儀中，在63°C下保持恒溫1小時； E、 如果待檢樣品與陽性對照一樣出現典型的S擴增曲線，則判定為陽性，如果與陰性對 照一樣沒有擴增曲線，而判定為陰性。7. 根據權利要求6所述的方法，其特征在于步驟A中采用納米磁珠提取待測樣品DNA的 具體步驟： a、 制樣:取0.1 g的植物組織加入山L抽提緩沖液進行研磨； b、 清洗納米磁珠:取出免疫納米磁珠到PCR管中，用dd出0反復清洗納米磁珠3次，在磁鐵 的作用下吸去dd出0; C、結合：加入10化L的樣品到PCR管中，用移液槍吸吐混勻樣品和納米磁珠，室溫下吸 附； d、 清洗:在磁鐵的作用下移去上清，納米磁珠清洗3次； e、 裂解:加入50化d地2〇至化CR管中，用移液槍吸吐混勻納米磁珠后，95°C，lOmin; f取樣:用磁鐵吸附納米磁珠，待PCR管內溶液澄清后，上清即為待測樣品DNA。8. 根據權利要求6所述的方法，其特征在于所述的免疫納米磁珠通過W下工藝制作： ①納米磁珠的制備 分別取5.2g化Cl3 · 6出0、2.7g FeS〇4 · 7出0、0.85血12.1moL/L的濃鹽酸溶解于200mL 水中，超聲脫氧，后將W上溶液滴入250mL、0.75nK)L/L化0田容液;在80°C下攬拌，反應結束 后，利用磁分離器將所得沉淀從反應介質中分離出來，再用去離子水清洗3次，無水乙醇清 洗2次，并配成5g/mL的Fe3〇4磁性納米粒子無水乙醇溶液;取25mL Fe3〇4磁性納米粒子無水 乙醇溶液，再用無水乙醇稀釋到150mL，超聲振蕩30min;滴加0.4mL APTES，室溫下攬拌化； 反應完畢，用磁分離器將APTES修飾的化3化磁性納米粒子從反應介質中分離，并用無水乙醇 溶液清洗3次，最后配成10.5mg/mL的氨基化化3化納米磁珠無水乙醇溶液； ②免疫磁珠的制備 取0.5mL氨基化Fe3〇4納米磁珠無水乙醇溶液，用ImL PBS清洗3次，磁分離器棄上清液； 加入5 % (V/V)戊二醒溶液2mL，室溫振蕩交聯化，磁分離，棄上清液；用PBS洗涂3次并棄上清 液后，分別采用0.5mL病毒抗體包被氨基化Fe3〇4納米粒子，室溫下振蕩固定化;磁分離，用 PBS和超純水分別洗涂3次，再用PBS定容，4°C冰箱保存備用，得到免疫磁珠。
【文檔編號】C12Q1/68GK105969844SQ201610207357
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年3月31日
【發明人】陳定虎, 管維, 楊雷亮, 王振華, 楊翠云, 鄧叢良
【申請人】陳定虎