一種禽流感病毒的檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于禽流感病毒免疫檢測領域，尤其涉及到一種用表面等離子體諧振(Surface Plasmon Resonance, SPR)技術檢測禽流感病毒的方法以及用于上述方法的SPR生化分析儀芯片及試劑盒。
【背景技術】
[0002]人禽流行性感冒又稱人禽流感，是由禽甲型流感病毒某些亞型中的一些毒株弓I起的急性呼吸道傳染病。據世界衛生組織資料，禽流感為病毒誘發的動物傳染病，通常僅感染鳥類，偶爾感染豬。禽流感病毒具有高度物種特異性，但偶爾也跨越物種屏障，感染人類。
[0003]根據抗原特性及其基因的不同，流感病毒分為A、B、C三型，也被稱為甲、乙、丙三型。A型(即甲型)攻擊力最強，也最常見，禽流感病毒就屬于A型流感病毒。流感病毒表面密布的糖蛋白也即抗原結構分H和N兩大類,H代表Hemagglutinin (血細胞凝集素),可幫助病毒與呼吸道黏膜上皮細胞表面的相應受體結合，吸附可宿主的呼吸道上皮細胞上。N代表Neuramidinase (神經氨酸)，可幫助病毒作用于核蛋白的受體，使病毒和上皮細胞的核蛋白結合，在核內組成RNA型可溶性抗原，并滲出至胞質周圍，復制子代病毒，以出芽方式排出上皮細胞，排出的病毒擴散至附近細胞，產生炎癥反應，臨床上出現發熱，肌肉痛和白細胞減低等全身毒血癥樣反應。A型流感病毒根據H和N抗原不同，又分為許多亞型，H分為15個亞型(Hl?H15)，N分為9個亞型(NI?N9)，H N組合可以有144種可能。不過，目前僅有3種組合——H1NUH2N2以及H3N2具有感染人類的能力，其他組合如H5N1型禽流感病毒雖然偶爾也傳染給人類，但自然宿主仍然主要是多種禽類和動物。AIV基因共編碼至少 10 種蛋白質(PA、PB1、PB2、HA、NA、NP、M1、M2、NS1、NS2 等)。除 NSl 與 NS2 為非結構蛋白外，其余均為結構蛋白，其中HA和NA為糖基化的結構蛋白，其它均為非糖基化結構蛋白。
[0004]最早的禽流感記錄在1878年，意大利發生雞群大量死亡，當時被稱為雞瘟。到1955年，科學家證實其致病病毒為甲型流感病毒。此后，這種流行性疾病被更名為禽流感。1999年3月至11月，英國倫巴第地區暴發禽流感，到次年3月1300萬只病禽被捕殺。2002年10月，美國加州暴發禽流感，僅加州就銷毀326多萬只雞；4月，荷蘭發生禽流感，人類感染者達80人，并出現死亡病例。自從2003年以來，禽流感病毒持續在全球蔓延，造成數千萬只家禽被宰殺銷毀，染病死亡者已達數十人。由于存在大流行的潛在危險，因此引起了廣泛的關注。
[0005]禽流感被發現100多年來，人類并沒有掌握有效的預防和治療方法，僅能以消毒、隔離、大量宰殺禽畜的方法防止其蔓延。目前，國際上加強了對于禽流感檢測技術的研究。禽流感特異性的檢測實驗可以分為直接檢測病毒法和基于抗體的檢測方法兩類。直接檢測法包括傳統的病毒培養，以及檢測特異性的病毒抗原或核酸。目前，隨著儀器微型化和計算技術的發展，人類不僅能夠迅速判斷病毒的亞型，還能夠對病毒的全基因組進行測定，并且對單個病毒進行遺傳分析。基于抗體的禽流感病毒檢測方法包括傳統的瓊脂糖凝膠免疫擴散以及紅血球凝集抑制法，還有基于ELISA的方法，這些方法提供了禽流感的現場篩查和確定禽流感病毒亞型的檢測方法。抗原捕獲和側流ELISA方法(試紙條)是被廣泛應用的禽流感檢測方法，這些方法最初是應用于人感染禽流感的臨床診斷的，后來迅速發展被應用于畜牧業。
[0006]但是這些方法具有如下缺點:
[0007]ELISA方法操作過程復雜，檢測時間長，不適合現場快速檢測；試紙條方法簡單快速，但是讀數具有主觀性，準確性低。
[0008]SPR檢測技術的原理如錯誤！未找到引用源。所示。具有橫磁(TransverseMagnetic, TM)偏振的平行入射光通過棱鏡耦合，照射在傳感芯片上，入射光與傳感芯片表面的金屬膜的表面等離子體波發生諧振，在棱鏡的另一側采用光檢測裝置檢測出射光的強度。在金屬膜的表面，制備有敏感膜(如抗體、受體等分子)。微流通道覆蓋在傳感芯片的表面，用于引入待測樣品。當待測樣品中含有與敏感膜發生特異性反應的物質(如抗原)時，出射光的強度會發生改變。利用SPR檢測禽流感病毒可以實現禽流感病毒的現場快速檢測，而且具有操作簡單，準確性高的特點。目前國內外還沒有利用檢測禽流感病毒的便攜式SPR儀、方法以及試劑盒的相關論文及專利。

【發明內容】

[0009]為解決現有技術中存在的上述問題，本發明將便攜式表面等離子體諧振生化分析儀應用于禽流感病毒的檢測，并且提供檢測方法與芯片以及試劑盒。本發明提出的檢測方法無需標記，現場快速、操作簡單等特點，可實現自動化。
[0010]本發明提出了一種禽流感病毒檢測方法，其包括:
[0011]步驟1、將從環境中獲取的待測樣品注入SPR生化分析儀；
[0012]步驟2、在所述SPR生化分析儀中，待測樣品在SPR敏感芯片表面反應預定時間；
[0013]步驟3、SPR生化分析儀計算出禽流感病毒的濃度數值，并根據預先設定的警戒值進行報警或不報警；
[0014]其中，所述SPR敏感芯片為其表面固定有禽流感病毒抗體或禽流感病毒抗原的SPR金屬片。
[0015]其中，所述SPR敏感芯片表面固定有禽流感病毒抗體時，步驟I中所述待測樣品直接注入SPR分析儀。
[0016]其中，所述SPR敏感芯片表面固定有禽流感病毒抗原時，所述待測樣品需要進行預處理,并與禽流感病毒抗體混合后注入SPR分析儀。
[0017]其中，所述預處理包括將待測樣品經過裂解液裂解并溫浴一段時間后注入SPR生化分析儀。
[0018]其中，SPR分析儀通過檢測SPR敏感芯片表面的折射率的變化而檢測禽流感病毒。
[0019]其中，所述固定在SPR敏感芯片上的禽流感病毒抗體為針對禽流感病毒表面蛋白NA的抗體，所述固定在SPR敏感芯片上的禽流感病毒抗原是指禽流感內部蛋白Ml。
[0020]其中，所述SPR敏感芯片為其基板為玻璃或塑料，基板表面有兩層金屬膜，下層為鉻膜，上層為金膜或銀膜，上層金膜或銀膜的厚度為40-50nm，下層鉻膜的厚度為3_7nm。
[0021]其中，在所述SPR敏感芯片上固定禽流感病毒抗體或抗原的過程如下:
[0022]將表面的金屬膜經過葡聚糖修飾的SPR敏感芯片用去離子水清洗，并將其表面吹干；將SPR敏感芯片浸泡在0.4M N-羥基琥珀酰亞胺(EDC)和0.1M N-乙基-N’ - ( 二甲氨基丙基)碳二亞胺(NHS)的混合液中，SPR敏感芯片表面進行活化10分鐘，活化后用去離子水清洗后吹干；將禽流感病毒抗體用PH4.2-4.6醋酸緩沖液稀釋至適當的濃度后，滴加在芯片表面以制備固定有禽流感病毒抗體的SPR敏感芯片，或將禽流感病毒抗原用pH值4.2-4.6醋酸緩沖液稀釋至適當的濃度后，滴加在芯片表面以制備固定有禽流感病毒抗原的SPR敏感芯片；20°C反應5分鐘；將芯片泡入IM乙醇胺溶液中反應10分鐘，以滅活剩余的結合位點；快速將芯片用去離子水吹干，置于4°C保存。
[0023]其中，所述裂解液為Triton或SDS，工作濃度為10% -0.5%;溫浴的溫度為25-45度，溫浴的時間10-90分鐘。
[0024]其中，被檢測的禽流感病毒包括所有亞型的完整禽流感病毒顆粒或病毒碎片，以及以任伺已知的方式獲得的禽流感病毒結構蛋白；所述待測樣品包括水、土壤或空氣。
[0025]本發明所采用的生化分析儀便攜式表面等離子體諧振生化分析儀為中國科學院電子學研究所傳感技術國家重點實驗室自行