專利名稱：一種用于快速檢測人禽流感病毒的非診斷性雙抗體夾心法的制作方法
技術領域：
本發明具體涉及人禽流感病毒酶聯免疫吸附(ELISA)檢測方法，屬于免疫檢測技術領域。
背景技術：
自從1997年在香港發現人類也會感染禽流感之后，此病癥引起全世界衛生組織的高度關注。其后，該病一直在亞洲區零星爆發，但在2003年12月開始，禽流感在東亞多國-主要在越南、韓國、泰國-嚴重爆發，并造成越南多名病人喪生。直到2005年中，疫癥不但未有平息的跡象，而且還不斷擴散。現時遠至東歐多個國家亦有案例。禽流感是由禽流感病毒引起的烈性人畜共患病。波及范圍之廣，危害程度之深引起了科學家的極大關注，各國投入大量的人力和財力對禽流感進行深入研究，但目前為止還不能完全控制和消除危害，因此對禽流感的檢測預防顯得非常關鍵。目前禽流感檢測技術主要有分子生物學技術和血清學診斷技術，分子生物學檢測方法需要專業理論知識和配套的昂貴實驗儀器，不便于基層對禽流感病毒進行快速簡便的檢測。而ELISA方法具有靈敏度高、可標準化操作和結果易于分析等特點，能夠幫助人們有效的檢測和防控禽流感疫情，是世界衛生組織推薦的檢測禽流感病毒的主要方法之一。

發明內容
針對現有情況存在的問題，本發明的目的在于提供一種靈敏度高、特異性好的用于快速檢測禽流感病毒的雙抗體夾心法。為實現上述目的，本發明一種用于快速檢測人禽流感病毒的非診斷性雙抗體夾心法，該方法具體為I)人工改造合成突變的人禽流感病毒HA基因；2)設計擴增表達人禽流感病毒HA基因引物；3)禽流感病毒HA基因的PCR擴增；4)將目的片段與載體pETlOO/D-TOPO連接，構建重組質粒；5)轉化表達細胞； 6) IPTG誘導重組蛋白的表達；7)重組蛋白免疫小鼠制備單克隆抗體并純化；8)重組蛋白免疫兔制備兔血清并純化；9)單克隆抗體用于ELISA包被，制備的多克隆抗體作為檢測抗體，辣根過氧化物酶標記的兔抗IgG作為二抗；10)建立雙抗體夾心檢測禽流感病毒抗原的方法。進一步，所述步驟I)中人工改造合成突變的人禽流感病毒HA基因序列為atggagaaaa tagtgcttct tcttgcaata gtcagtcttg ttaaaagtga tcagatttgcattggttacc acgcaaacaa ctcgacagtg caggttgaca caataatgga aaagaacgtt
actgtcacac atgcccaaga catactggaa aagacacacaatgggaagct ctgcgatctagatggagtga agcctctaat tttgagagat tgtagtgtagctggatggct cctcggaaacccaatgtgtg acgaattcat caatgtgccg gaatggtcttacatagtgga gaaggccagtccagccaatg acatctgtta cccaggggat ttcaacgactatgaagaact gaaacacctattgagcagaa taaaccattt tgagaaaatt cagatcatccccaaaagttc ttggcccaatcatgaagcct cattaggggt gagctcagca tgtccataccaggggaagtc ctcctttttcagaaatgtgg tatggcttat caaaaagaac aatgcatacccaacaataaa gaagagctacaataatacca accaagaaga tcttttggta ctgtgggggattcaccaccc taatgatgcggccgagcaga taaagctcta tcaaaaccca aacacctatatttccgttgg aacatcaacactaaaccagc gtttggtacc aaaaatagct actagatccaaagtaaacgg gcaaagtggaagaatggagt tcttctggac aattttaaag ccgaatgatgctatcaattt cgagagtaatggaaatttca ttgctccaga atatgcatac aaaattgtcaagaaagggga ctcagcaattatgaaaagtg aattggaata tggtaactgc aacaccaagtgtcaaactcc aatgggggcgataaactcta gtatgccatt ccacaacata caccctatcaccatcgggga atgccccaaatatgtgaaat caaacagatt agtccttgca actggactcagaaatgcccc tcaaagagagagaagacgta aaaagaga。進一步，所述步驟2)中HA基因引物序列為HA-F :5' -cacatggagaaaatagtgcttcttc-31HA-R 5r -tctctttttacgtcttctctc-3!。進一步，所述步驟3)中PCR擴增條件為
權利要求
1.一種用于快速檢測人禽流感病毒的非診斷性雙抗體夾心法，其特征在于，該方法具體為 1)人工改造合成突變的人禽流感病毒HA基因； 2)設計擴增表達人禽流感病毒HA基因引物； 3)禽流感病毒HA基因的PCR擴增； 4)將目的片段與載體pETlOO/D-TOPO連接，構建重組質粒； 5)轉化表達細胞； 6)IPTG誘導重組蛋白的表達； 7)重組蛋白免疫小鼠制備單克隆抗體并純化； 8)重組蛋白免疫兔制備兔血清并純化； 9)單克隆抗體用于ELISA包被，制備的多克隆抗體作為檢測抗體，辣根過氧化物酶標記的兔抗IgG作為二抗； 10)建立雙抗體夾心檢測禽流感病毒抗原的方法。
2.如權利要求I所述的用于快速檢測禽流感病毒的非診斷性雙抗體夾心法，其特征在于，所述步驟I)中人工改造合成突變的人禽流感病毒HA基因序列為atggagaaaa tagtgcttct tcttgcaata gtcagtcttg ttaaaagtga tcagatttgcattggttacc acgcaaacaa ctcgacagtg caggttgaca caataatgga aaagaacgttactgtcacac atgcccaaga catactggaa aagacacaca atgggaagct ctgcgatctagatggagtga agcctctaat tttgagagat tgtagtgtag ctggatggct cctcggaaacccaatgtgtg acgaattcat caatgtgccg gaatggtctt acatagtgga gaaggccagtccagccaatg acatctgtta cccaggggat ttcaacgact atgaagaact gaaacacctattgagcagaa taaaccattt tgagaaaatt cagatcatcc ccaaaagttc ttggcccaatcatgaagcct cattaggggt gagctcagca tgtccatacc aggggaagtc ctcctttttcagaaatgtgg tatggcttat caaaaagaac aatgcatacc caacaataaa gaagagctacaataatacca accaagaaga tcttttggta ctgtggggga ttcaccaccc taatgatgcggccgagcaga taaagctcta tcaaaaccca aacacctata tttccgttgg aacatcaacactaaaccagc gtttggtacc aaaaatagct actagatcca aagtaaacgg gcaaagtggaagaatggagt tcttctggac aattttaaag ccgaatgatg ctatcaattt cgagagtaatggaaatttca ttgctccaga atatgcatac aaaattgtca agaaagggga ctcagcaattatgaaaagtg aattggaata tggtaactgc aacaccaagt gtcaaactcc aatgggggcgataaactcta gtatgccatt ccacaacata caccctatca ccatcgggga atgccccaaatatgtgaaat caaacagatt agtccttgca actggactca gaaatgcccc tcaaagagagagaagacgta aaaagaga。
3.如權利要求I所述的用于快速檢測禽流感病毒的非診斷性雙抗體夾心法，其特征在于，所述步驟2)中HA基因引物序列為HA-F :5, -cacatggagaaaatagtgcttcttc-3! HA-R -tctctttttacgtcttctctc-3’。
4.如權利要求I所述的用于快速檢測禽流感病毒的非診斷性雙抗體夾心法，其特征在于，所述步驟3)中PCR擴增反應體系為
5.如權利要求I所述的用于快速檢測禽流感病毒的非診斷性雙抗體夾心法，其特征在于，所述步驟4)中構建重組質粒具體步驟為 ①取一支無菌EP管，加入水2ul，膠條回收純化產物2ul，Saltsolution lul，pET-lOO/D-TOPO載體lul后混勻，室溫靜置5分鐘； ②無菌操作臺上取3ul該體系到一瓶toplO細胞中，靜止30分鐘后，42°C熱擊40秒，立即放在冰上，2分鐘后在無菌操作臺上加入250ul的S0c培養基； ③半蓋緊蓋子，370C，225rpm,離心2小時，吸取200ul涂布于含有終濃度為50ug/ml氨芐抗生素的固體平板上； ④將該固體平板放入37°C培養箱內倒置培養16小時。
6.如權利要求I所述的用于快速檢測禽流感病毒的非診斷性雙抗體夾心法，其特征在于，所述步驟5)和6)中具體步驟為將經過菌落PCR鑒定為陽性的單克隆接種于5ml終濃度為50ug/ml氨芐抗生素的LB固體培養基中，37°C，225rpm，培養12小時，吸取3ml接種于200ml的LB液體培養基中，繼續培養2小時，用單光束紫外可見分光光度計測定0D600為0. 6時，加入終濃度為I. OmmoI/L的IPTG繼續誘導表達6小時。
7.如權利要求I所述的用于快速檢測禽流感病毒的非診斷性雙抗體夾心法，其特征在于，所述步驟7)和8)中具體步驟為去離子水清洗柱子，用五倍柱床體積的平衡緩沖液平衡柱子，待柱平衡后，將兔血清經0. 45uM濾膜濾過以平衡緩沖液10倍體積稀釋后以ImL/min流速上柱,至少用五倍柱床體積的平衡緩沖液以lmL/min流速洗脫雜蛋白，先在每個收集管中加入100 μ L的中和緩沖液，使pH恢復至7. 4左右，以免失去活性。使用不同pH值洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，每管收集ImL ;分別取5 μ L每個收集管中的液體作SDS-PAGE分析，純化好的抗體以PB工作液4°C透析，10000r/min離心30分鐘，收集上清。
8.如權利要求7所述的用于快速檢測禽流感病毒的非診斷性雙抗體夾心法，其特征在于，所述步驟7)中具體步驟為 ①將制備的鼠單抗用PH9.6的碳酸鹽緩沖液稀釋為10ug/ml，IOOul/孔，置于4°C冰箱孵育16小時；每孔加入300ul的Wash buffer洗滌3次，每次2分鐘，然后甩干；用含5%牛血清白蛋白的Wash buffer加滿孔，37°C孵育封閉2小時，洗滌； ②將純化的HA蛋白用樣品稀釋液稀釋，按10倍梯度稀釋為10_2， ο-3,ιοΛ ο-5, ο-6,10_7，IOOul/孔。每個稀釋度重復一次；用HA3蛋白按10倍梯度稀釋為10_2，10_3，10_4，10_5，10_6，10_7，IOOul/孔，作為陰性對照，重復3次;37°C孵育I小時，洗滌；另留3孔作為試劑空白對照； ③用0.OlM的PBS將純化的兔多抗稀釋為10ug/ml，每孔IOOul/孔；37°C，孵育I小時，洗滌；用PH7. 4的樣品稀釋液將辣根過氧化物酶標記的羊抗兔稀釋為0. 6ug/ml，每孔IOOul/孔；37°C孵育I小時，洗滌；每孔加入IOOul的TMB，室溫避光，顯色20分鐘；每孔加入50ul的2M H2S04,自動酶聯檢測儀0D450讀數。
全文摘要
本發明公開了一種用于快速檢測人禽流感病毒的非診斷性雙抗體夾心法，用鼠單抗包被ELISA，用特異性兔多抗形成抗體抗原抗體復合物，用辣根過氧化物酶標記的羊抗兔形成檢測抗體，通過采用雙抗體ELISA法來進行檢測人禽流感病毒。本發明用于快速檢測禽流感病毒的雙抗體夾心法，能夠進行快速、有效的篩查診斷，有使用方便、檢測準確的優點，適合在傳染病防控領域推廣應用，如用于入境人員篩查等。
文檔編號G01N33/569GK102621320SQ20121007421
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月20日 優先權日2012年3月20日
發明者楊宇, 王靜, 魏蓮 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院