一種甲型流感病毒分子檢測試劑盒及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種甲型流感病毒反轉錄-重組酶多聚酶擴 增檢測試劑盒及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 甲型流感病毒屬于正粘病毒科，基因組由8個負鏈單股RNA節段組成，至少編碼11 種蛋白。甲型流感病毒的宿主分布廣，可感染禽、人、豬、馬、狗、貓、海洋哺乳動物（海豹、鯨 等）等。在整個甲型流感病毒的生態分布中，野生水禽和海岸鳥是主要的自然貯存宿主和 基因庫，目前發現的大多數甲型流感病毒亞型（16個Η亞型和9個N亞型）都存在于野生 水禽中。20世紀人類經歷了 3次流感大流行，分別是1918年西班牙流感（Η1Ν1)、1957年亞 洲流感（Η3Ν2)和1968年香港流感（Η3Ν2)。據WHO估計，全球每年約有25-50萬人死于季 節性流感引發的疾病。甲型流感是人類季節性流感病毒主要成員，可以感染所有人群，對一 些特殊人群（如孕婦、老年人和基礎性疾病患者）能引起嚴重疾病乃至死亡。季節性流感 是由流感病毒引起的一種人類重要的全球性呼吸道傳染病，熱帶地區常年流行，而在溫帶 地區主要發生在冬季，具有一定的季節性流行特點。目前在人群中流行主要是甲型H1N1和 H3N2亞型流感病毒。WHO在全球建立了季節性流感監測網絡，以了解病毒流行情況，為流感 全球防控和疫苗研制提供科學依據。
[0003] 甲型流感病毒是人類流感監測和臨床診斷關注的重點病毒。甲型流感病毒的檢 測方法主要包括血清學和核酸檢測，血清學方法主要用標準血清對分離到的病毒株進行 抗原分型，耗時費力，不適合臨床快速分型診斷。目前核酸檢測方法主要包括普通PCR法、 Real-timetimePCR法和環等溫擴增（LAMP)法等。Real-timetimePCR法和LAMP法具 有很好的特異性和敏感性，但前者依賴昂貴的儀器和試劑；而后者法難以實現多重檢測。相 比之下，普通PCR敏感性較差且需要瓊脂糖電泳進行結果判定，不適合大規模標本的檢測。 因此，需要建立快速敏感、不依賴于昂貴儀器的甲型流感核酸檢測方法，以提高流感監測和 臨床診斷水平。

【發明內容】

[0004] 本發明需要解決的問題是提供一種甲型流感病毒反轉錄-重組酶多聚酶擴增 (RT-RPA)檢測試劑盒及其制備方法。
[0005] 本發明提供的甲型流感病毒RT-RPA檢測試劑盒由RT-RPA反應體系、Μ片段陽性質 粒Puc-AM、陰性質控品、Μ片段RPA引物和exo探針組成，Μ片段RPA引物和exo探針為：
[0006] M-rpaF, 5'ACCGAGGTCGAAACGTATGTTCTCTCTATCGTTCC3' ；
[0007] M-rpaR, 5'CCAAACAAAAGTGCGAGTGGCACGGGTCACTC3' ；
[0008] M-exo-probe,5'GGCTCTCATGGAATGGCTAAAGACAAGACCAA[dT-FAM]TC[THF] G[dT-BHQ]CACCTCTGACTAAGG[3'-block]3'
[0009] 本發明所述甲型流感病毒RT-RPA檢測試劑盒的制備方法；
[0010] (1)病毒核酸提取：采用酚氯仿法提取病毒RNA，具體步驟：取臨床鼻咽拭子標本 或病毒培養物核酸100μL，加入含有200ul水飽和酚的1. 5mlEP中，劇烈震蕩混勻，靜置 3min，加入200ul氯仿，充分震蕩混勻，12000g室溫離心15分鐘；吸取上清液，加入兩倍上 清體積的異丙醇，再加入1/10上清體積3M醋酸鈉35-45ul，充分混勻后-20°C靜置2h;取 出于4°C下，12000g，離心20min;棄上清，加入75%乙醇lml，4°C，12000g，離心20min;棄上 清，室溫干燥，加入40ulDEPC水溶解RNA，-70°C冰箱放置備用；
[0011] (2)RT-RPA反應：采用英國TwistDx公司的TwistAmpRTexos試劑盒，取29.5yL 反應緩沖液，分別加入下列組分：引物L-rpaF(lOmM)和L-rpaR(lOmM)各2. 1μL，2. 6μL RPAexo探針（10mM)，1μLRNA酶抑制劑（5U)，7. 2μL超純水，5μL標本RNA模板，渦旋震 蕩，短暫離心，再加入2. 5μL醋酸鎂（280mM)。混合離心后，放入Twista實時熒光檢測儀 中，反應溫度為40°C，時間為20min。本實驗同時設陽性對照和空白陰性對照組。
[0012] 與現有技術相比，本發明的有益效果是：
[0013] 設計針對甲型流感病毒Μ基因的RPA引物和exo探針，通過反轉錄-重組酶多聚 酶擴增方法，反應溫度為40°C等溫條件下，20min即可對臨床流感標本和病毒分離物進行 核酸分子鑒定，無需昂貴儀器設備，便于操作，具有快速、敏感、特異等特點，為甲型流感監 測和臨床救治提供一種新的檢測方法。
【附圖說明】
[0014] 圖1檢測甲型流感病毒Μ節段RPA引物瓊脂糖凝膠電泳篩選
【具體實施方式】
[0015] 下面提供具體實施例進一步闡述本發明的技術方案，但本發明技術的應用不限于 實施例。
[0016] 實施例1 :靶基因質粒構建
[0017] 設計針對甲型流感病毒Μ片段的特異性引物，通過PCR法擴增獲得1027bp基因片 段，回收純化后的與T載體連接，獲得靶基因陽性質粒，命名為Puc-AM。
[0018] 實施例2 :引物探針設計與篩選
[0019] 通過序列分析軟件分析，以甲型流感病毒較為保守的Μ片段序列為模板，共設計 8條正向引物和12條反向引物，引物長度為30-35bp;同時設計1條exo探針（命名為 M-exo-probe)，長度為53bp，其中33位堿基T標記熒光物質FAM，36位堿基由四氫呋喃代 替，38位堿基標記熒光物質BHQ，同時封閉3'末端堿基。
[0020] 采用TwistAmpBasickit(TwistDx公司，英國），以革巴基因克隆質粒Puc-AM為模 板，以瓊脂糖凝膠電泳為結果指示手段，對上述設計的引物進行篩選。引物優劣的評價指標 包括特異性、敏感性、擴增效率和引物噪音等。取29. 5μL反應緩沖液，分別加入下列組分： 上下游引物（10mM)各2. 4yL，12. 2yL超純水，lyL質粒Puc-L模板。再加入2. 5yL醋酸 鎂（280mM)。混合離心后，放入40°C，溫育5min。渦旋震蕩8-10次，短暫離心，放入40°C， 反應20min。取反應產物2ul放入18ul水中，用酚-氯仿法對DNA進行純化。1.5%瓊脂糖 凝膠電泳檢測純化DNA產物，結果篩選到一組引物，命名為L-rpaF和L-rpaR(圖1)。
[0021] 實施例3 :RT-RPA的敏感性
[0022] 將靶基因克隆質粒Puc-AM稀釋100倍，再按10倍梯度稀釋成10 2-10 9共八個 濃度，以此為模板，進行RT-RPA反應：采用TwistAmpRTexos試劑盒（TwistDx公司，英 國）。取29. 5μL反應緩沖液，分別加入下列組分：引物L-rpaF(lOmM)和L-rpaR(lOmM)各 2. 1μL，2. 6μLRPAexo探針（10mM)，1μLRNA酶抑制劑（5U)，7. 2μL超純水，5μL標本 RNA模板。渦旋震蕩，短暫離心。再加入2. 5yL醋酸鎂（280mM)。混合離心后，放入Twista 實時熒光檢測儀中，反應溫度為40°C，時間為20min。
[0023] 本實驗中所建立的RT-RPA方法可以檢測下限是15copies/ μ L，具有較好的敏感 性。
[0024] 實施例3 :RT-RPA的特異性
[0025] 以乙型流感、登革熱病毒、呼吸道冠狀病毒、鼻病毒、呼吸道合胞體病毒核酸為模 板、，用設計的RPA引物和exo探針進行RT-RPA實驗。結果對上述毒核酸都沒有熒光信號 檢出，表明建立的RT-RPA方法具有較好的特異性。。
[0026] 實施例3:臨床標本檢測
[0027] 收集45份甲型流感病毒臨床樣本，所有標本都通過細胞培養進行病毒分離。
[0028] (1)病毒RNA提取
[0029] 采用酚氯仿法提取病毒RNA，具體步驟：1.取血清標本100μL，加入含有200ul水 飽和酚的1. 5mlEP中，劇烈震蕩混勻，靜置3min，加入200ul氯仿，充分震蕩混勻，12000g 室溫離心15分鐘。2.吸取上清液，加入兩倍上清體積的異丙醇，再加入1/10上清體積3M 醋酸鈉約40ul，充分混勻后-20°C靜置2h;取出于4°C下，12000g，離心20min。3.棄上清， 加入75%乙醇lml，4°C，12000g，離心20min。4·棄上清，室溫干燥，加入40ulDEPC水溶解 RNA〇
[0030] (2)RT-RPA反應：采用公司的TwistAmpRTexos試劑盒（TwistDx公司，英國）。取 29. 5yL反應緩沖液，分別加入下列組分：引物L-rpaF(lOmM)和L-rpaR(lOmM)各2.lyL， 2. 6μLM-exo探針（10mM)，1μLRNA酶抑制劑（5U)，7. 2μL超純水，5μL標本RNA模板。 渦旋震蕩，短暫離心。再加入2.5yL醋酸鎂（280mM)。混合離心后，放入Twista實時熒光 檢測儀中，反應溫度為40°C，時間為20min時間為20min。本實驗同時設陽性對照和空白陰 性對照組。
[0031] 結果45份臨床樣本，RT-RPA檢測陽性的有30份，陰性15份，結果與病毒分離結 果完全一致。
【主權項】
1. 一種基于反轉錄-重組酶多聚酶擴增的甲型流感病毒檢測試劑盒，其特征是試劑盒 由RT-RPA反應體系、RNA酶抑制劑、Μ片段陽性質粒Puc-AM、陰性質控品、Μ片段RPA引物 和exo探針組成，Μ片段RPA引物和exo探針為： M-rpaF, 5'ACCGAGGTCGAAACGTATGTTCTCTCTATCGTTCC3'； M-rpaR, 5'CCAAACAAAAGTGCGAGTGGCACGGGTCACTC3'； M-exo-probe, 5'GGCTCTCATGGAATGGCTAAAGACAAGACCAA[dT-FAM]TC[THF]G[dT-BHQ]CAC CTCTGACTAAGG[3' -block]3'〇2. 根據權利要求1所述一種基于反轉錄-重組酶多聚酶擴增的甲型流感病毒檢測試劑 盒的制備方法，其特征是由以下步驟構成： (1) 病毒核酸提取：采用酚氯仿法提取病毒RNA，具體步驟：取臨床鼻咽拭子標本或病 毒培養物核酸100μL，加入含有200ul水飽和酚的1. 5mlEP中，劇烈震蕩混勻，靜置3min， 加入200ul氯仿，充分震蕩混勻，12000g室溫離心15分鐘；吸取上清液，加入兩倍上清體積 的異丙醇，再加入1/10上清體積3M醋酸鈉35-45ul，充分混勻后-20°C靜置2h;取出于4°C 下，12000g，離心20min;棄上清，加入75%乙醇lml，4°C，12000g，離心20min;棄上清，室溫 干燥，加入40ulDEPC水溶解RNA，-70°C冰箱放置備用； (2) RT-RPA反應：采用TwistAmp RT exos試劑盒，取29. 5 μ L反應緩沖液，分別加入下 列組分：引物1-1?^卩1〇1111和1^-1?^1?1〇1111各2.141^，2.6 41^1?^61〇探針1〇1111，141^1?熟 酶抑制劑5U，7. 2 μ L超純水，5 μ L標本RNA模板；渦旋震蕩，短暫離心；再加入2. 5 μ L醋酸 鎂280mM，混合離心后，放入Twista實時熒光檢測儀中，反應溫度為40°C，時間為20min。
【專利摘要】本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種甲型流感病毒反轉錄-重組酶多聚酶擴增(RT-RPA)檢測試劑盒及其制備方法。本發明涉及的檢測試劑盒由RT-RPA反應體系、RNA酶抑制劑、甲型流感病毒M片段陽性質粒Puc-AM、陰性質控品、M片段RPA引物和exo探針組成。用特異性引物和探針，通過配制RT-RPA反應體系，置入Twista實時熒光檢測儀進行實時熒光檢測，建立了一種快速、敏感、特異的甲型流感病毒等溫實時熒光核酸檢測方法。本發明涉及特異性RPA引物和exo探針在甲型流感病毒感染臨床鑒別診斷和病毒分離株鑒定中的用途。
【IPC分類】C12Q1/70, C12Q1/68
【公開號】CN105296673
【申請號】CN201510875032
【發明人】祁賢, 宋勇春, 焦永軍, 張洪英, 湯奮揚, 鮑倡俊
【申請人】江蘇省疾病預防控制中心
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2015年12月3日