一種篩選抗衰老藥物的試劑盒及其使用方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種篩選抗衰老藥物的試劑盒及其使用方法，屬于生物檢測技術領 域。
【背景技術】
[0002] 21世紀是人口老齡化的世紀，人口老齡化將帶來一系列非常嚴重的醫學和社會問 題[1]，面對龐大的老年群體，要從根本上提高他們的生存質量，就要找到改善身體機能、延 緩衰老的方法。從中醫藥和化合物庫中篩選和開發可預防及治療衰老相關疾病、延長壽命 的安全有效的抗衰老藥物，逐漸成為今后我國新藥研制的熱點。
[0003] 學界認為衰老機制在生物之間是進化保守的，現階段國內外抗衰老藥物篩選選用 的模型主要有細胞、果蠅、線蟲、斑馬魚、小鼠和大鼠。細胞為模型的藥物篩選為體外藥物 作用研究，效率高但往往相關性差；果蠅的生活模式限制了其在高通量藥物篩選中的應用； 斑馬魚在衰老方面由于培養條件和發育時間的問題應用有所限制 [2];鼠類的建模實驗操作 技術要求高且因其培養條件高和壽命周期長導致篩選效率低、研究成本高昂[3]。而秀麗隱 桿線蟲培養條件簡單，可以在瓊脂板上或是液體培養基中取食細菌（E.coli);世代周期短， 通常為3天左右；壽命短，通常為3周左右；秀麗隱桿線蟲實驗群體容易放大，而且可以大 量獲得同步化(生長時期處于同一階段）的秀麗隱桿線蟲。秀麗隱桿線蟲因為壽命周期短 和容易實現高通量的優勢，成為衰老研究的理想模型 [4]。但是現階段，尚未出現基于上述秀 麗隱桿線蟲模型的篩選抗衰老藥物的試劑盒，供本領域研發人員高效準確地篩選抗衰老藥 物。
[0004] 對此，本發明特提供一種篩選抗衰老藥物的試劑盒，使用該試劑盒能夠快速準確 地篩選抗衰老藥物，本發明同時提供上述試劑盒的使用方法。
[0005] 此外，在篩選化合物的抗衰老藥效時，壽命分析實驗均采用固體NGM培養基。但 是，NGM培養基會隨著水分蒸發逐漸干燥，涂在培養基表面的大腸桿菌0P50也會隨著秀麗 隱桿線蟲的取食逐漸消耗殆盡，秀麗隱桿線蟲會因失水或饑餓影響其正常壽命。同時，在篩 選化合物的抗衰老藥效時，研究者在壽命分析實驗普遍采用在秀麗隱桿線蟲生育期每天轉 板、生育期結束后2飛天轉板一次直至壽命實驗的結束 [5'6]，或者每天轉板直至秀麗隱桿線 蟲全部死亡[7'8]。然而該方法由于頻繁轉板會對秀麗隱桿線蟲，尤其是衰老秀麗隱桿線蟲造 成機械損傷，導致秀麗隱桿線蟲非自然死亡，進而影響壽命。以上缺陷均會給所篩藥物的抗 衰老藥效分析增加影響因素。
[0006] 并且，頻繁轉板也會帶來其他問題，諸如藥物用量大、人工工作量大、容易污染等。
[0007] 因此，本發明基于上述問題，提供了一種使用特殊結構的秀麗隱桿線蟲專用培養 皿的試劑盒，省去了秀麗隱桿線蟲培養過程中因為NGM培養基損耗帶來的轉板過程，簡化 培養過程，節約成本，方便操作，適合在篩選抗衰老藥物的領域大規模推廣。
[0008] 【1】蘇柳竹.我國人口老齡化研究及應對措施[J]，科技故事博覽：科教創 新，2011，（5) :198-198. 【2】賈熙華，曹誠.秀麗隱桿線蟲在醫藥學領域的應用和進展[J]，藥學學報， 2009, 44(7) : 687. 【3】杜艷，吳海標.動物衰老模型及艾灸抗衰老實驗研究進展[J]，廣西中醫學院 學報，2008，11(003) : 88-90. 【4】OlsenA,VantipalliMC,LithgowGJ.UsingCaenorhabditiselegansasa modelforagingandage-relateddiseases.AnnNYAcadSci, 2006, (5) : 120-8 【5】D.Srivastava,U.Arya,T.SoundaraRajanetal.Reserpinecanconfer stresstoleranceandlifespanextensioninthenematodeC.elegans[J],Biogerontolo gy，2008, 9: 309-316.
[6]AndersOlsen,M.C.Vantipalli,G.J.Lithgow.Lifespanextension ofC.elegansfollowingrepeatedmildhormeticheattreatments[J], Biogerontology, 2006, 7:221-230. 【7】尹大強，于振洋，胡霞林等.用秀麗線蟲測定藥品與個人護理品的世代毒性的方 法·中國.200810207706.X[P]· 2009-12-25. 【8】于笑坤，何瀟瀟，付學奇，馬俊峰。水溶性人參皂苷對秀麗隱桿線蟲生物學功能的 影響【J】，吉林大學學報，2012, 7, 50 (4) :812-814.。

【發明內容】

[0009] 本發明的目的是提供一種篩選抗衰老藥物的試劑盒，使用該試劑盒能夠篩選出抗 衰老藥物。
[0010] 本發明的另一個目的是提供一種無需轉板的篩選抗衰老藥物的試劑盒，該試劑盒 能夠避免因為頻繁轉板使秀麗隱桿線蟲受到機械損傷造成非自然死亡，進而影響壽命分析 實驗的結果的問題。同時，減少培養過程大腸桿菌0P50和無菌水的添加頻率，簡化培養過 程，節約成本，方便操作。 本發明的另一個目的是提供上述篩選抗衰老藥物的試劑盒的使用方法。
[0011] 本發明提供一種篩選抗衰老藥物的試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括以下試 劑： ① 、試劑A:秀麗隱桿線蟲； ② 、試劑B:NGM培養基； ③ 、試劑C:大腸桿菌0P50 ; ④ 、試劑D:氟脲苷； ⑤ 、試劑E:無菌水。
[0012] 其中，所述秀麗隱桿線蟲的濃度為100條/20ul，大腸桿菌0P50的濃度為10mg/ ml,氟脲苷的濃度為50μΜ,無菌水的體積為50-100μL。
[0013] 所述秀麗隱桿線蟲為同步化線蟲，秀麗隱桿線蟲同步化的步驟如下：用Μ9緩沖液 將平板上的秀麗隱桿線蟲沖下來，將沖洗液吸入離心管；4000rpm/min離心3min，去除上 清；加入裂解液，終濃度：3. 2%NaCIO和1MNaOH;在渦旋儀上震蕩7min，使秀麗隱桿線蟲的 蟲體破裂釋放卵；4000rpm/min離心3min，去除上清，收集沉淀獲得大量的秀麗隱桿線蟲 卵；M9緩沖液沖洗兩次，加入lmlM9緩沖液，置于20°C培養箱中孵化48小時。
[0014] 所述試劑盒還含有秀麗隱桿線蟲專用培養皿，該培養皿皿蓋為環形鏤空形狀，鏤 空部位覆蓋有封口膜，培養皿中加有NGM培養基。
[0015] 所述試劑C為含有大腸桿菌0P50活菌的凍干粉或菌液。
[0016] 本發明還提供上述篩選抗衰老藥物的試劑盒的使用方法： (1) 將含有待測藥物的溶液與NGM培養基混勻，倒入秀麗隱桿線蟲專用培養皿中，制板 待用，NGM培養基中含有濃度為50μΜ的氟脲苷，其中，空白組使用等量無菌水替換含有待 測藥物的溶液； (2) 將L4期同步化的秀麗隱桿線蟲，用鉬絲挑針轉移到各藥物組和空白組的秀麗隱桿 線蟲專用培養皿中，藥物組為含有不同濃度待測藥物的NGM培養基，每個藥物濃度三個平 行，每平行板25~30條秀麗隱桿線蟲，置于20°C培養，每天觀察并計數秀麗隱桿線蟲存活 數和死亡數； (3) -周后培養皿開始干燥，秀麗隱桿線蟲開始出現皮膚略顯皺縮、狀態不活躍、行動 略緩，菌斑鏡下觀察已接近無菌等缺水、缺大腸桿菌0Ρ50表現，此時在無菌超凈臺中打開 皿蓋，用移液器加入定量無菌水50-100μL和大腸桿菌0Ρ50 20-50μL，10mg/mL;加完后靜 置，待水和菌皆滲入NGM培養基中將培養基正置，用封口膜封皿，重置20°C培養箱培養； 約一周又出現干燥和缺菌狀態，重復上述補充水分和菌的操作，補充無菌水需持續到整個 壽命實驗結束，而補充大腸桿菌0P50視具體情況，25-30條秀麗隱桿線蟲約需補充2次； (4) 用挑針輕觸，秀麗隱桿線蟲無反應則判定為死亡；爬到培養皿邊緣或皿蓋干死、鉆 到瓊脂里面的秀麗隱桿線蟲從實驗中排除； (5) 采用相關軟件對實驗數據進行處理、分析，計算出秀麗隱桿線蟲的平均壽命，平均 壽命顯著高于空白組則證明藥物具有抗衰老活性，平均壽命低于或等于空白組則證藥物不 具有抗衰老活性，以此評價藥物的抗衰老活性。
[0017] 本發明的有益效果： 1、本發明提供一種基于秀麗隱桿線蟲模型的篩選抗衰老藥物的試劑盒，該試劑盒檢測 結果準確，使用方法簡單，適合在篩選抗衰老藥物的領域大規模推廣。
[0018] 2、本發明所述試劑盒使用特殊結構的秀麗隱桿線蟲專用培養皿，使用該培養皿能 夠在減少NGM培養基中水分蒸發的同時，保證秀麗隱桿線蟲生存所需的氧氣，同時減少無 菌水和大腸桿菌0P50的添加頻率，補加水以1周為周期，補加菌以1周為周期，重復過程直 至壽命實驗結束，使培養過程更簡便，延長NGM培養基的使用時間。省去了秀麗隱桿線蟲培 養過程中因為NGM培養基損耗帶來的轉板過程，避免因為頻繁轉板使秀麗隱桿線蟲受到機 械損傷造成非自然死亡，進而影響壽命分析實驗結果的問題；同時解決因為頻繁轉板帶來 的諸如藥物用量大、人工工作量大、容易污染等其他問題。
[0019] 以下提供具體實施例以實現本發明所述的篩選抗衰老藥物的試劑盒，但不限于這 些實施例。
【具體實施方式】
[0020] 實驗生物： 秀而隱桿線蟲早衰模型株系TK22,購買于TheCaenorhabditisGeneticsCenter(CGC)。 秀而隱桿線蟲正常株系N2,購買于TheCaenorhabditisGeneticsCenter(CGC)。 細菌株：尿啼陡滲漏突變型大腸桿菌0P50,購買于TheCaenorhabditisGenetics Center(CGC)。
[0021] 培養基： NGM培養基：NaClL5g，K2HP04L3g，ΚΗ2Ρ04 8 . 5g，蛋白胨L4g，瓊脂粉 8. 5g，蒸餾水 500mL。滅菌后加入過濾除菌的500μL膽固醇（5mg/ml，無水乙醇配制)，高壓蒸汽滅菌的 50〇μL1mol/LMgS04, 500μLlmol/LCaCl2〇
[0022] M9 緩沖液：NaCl1. 98g，Na2HP04 2 . 38g，ΚΗ2Ρ04 1. 20g，MgS04 0· 048g，蒸餾水 400mL。
[0023]LB液體培養基