一種馬尿酸鹽培養基及其制備方法及茚三酮試劑及β溶血B族鏈球菌的鑒定方法
【專利摘要】本發明提供一種馬尿酸鹽培養基，該培養基包括蛋白胨、糖類營養成分、氯化鈉、磷酸氫二鈉和馬尿酸鹽，該馬尿酸鹽培養基能為β溶血B族鏈球菌的生長提供營養，使得馬尿酸水解實驗結果準確。本發明同時提供該馬尿酸鹽培養基的制備方法。本發明還提供一種茚三酮試劑，包括茚三酮、無水乙醇，該茚三酮試劑制備過程簡單。本發明還提供一種β溶血B族鏈球菌的鑒定方法，其使用本發明提供的馬尿酸鹽培養基和茚三酮試劑，鑒定結果準確，避免了假陰性結果的出現。
【專利說明】
一種馬尿酸鹽培養基及其制備方法及茚三酮試劑及β溶血B族鏈球菌的鑒定方法
技術領域
[0001]本發明屬于包含微生物的測定方法及其所用培養基，具體地，本發明涉及一種馬尿酸鹽培養基及β溶血B族鏈球菌的鑒定方法。
【背景技術】
[0002]馬尿酸鈉水解實驗用來測定細菌水解馬尿酸的能力，用于初步鑒定β溶血性B族鏈球菌。
[0003]馬尿酸(N-苯甲酰甘氨酸，苯甲酰氨基乙酸)是甘氨酸的苯甲酸衍生物，是一種與甘氨酸結合的芳香環化合物，它是一種酰胺，易溶解于水，通過特異的馬尿酸水解酶催化作用，最終生成苯甲酸和甘氨酸。
[0004]馬尿酸鈉的水解可由茚三酮法檢測產物甘氨酸。茚三酮[C6H4(CO3).H2O]是一種強氧化劑，甘氨酸在茚三酮的作用下，經氧化脫氨基反應生成氨、二氧化碳和相應的醛，而茚三酮則生成還原型茚三酮。反應過程中生成的氨和還原型茚三酮，與殘留的茚三酮起反應，則形成紫色化合物。
[0005]由茚三酮法檢測產物甘氨酸，目前所用培養基為1%馬尿酸鈉水溶液(Difco)(馬尿酸鈉lg，蒸餾水100ml)。細菌在1%馬尿酸鈉水溶液中生長較緩慢，使用茚三酮溶液檢測產物，會出現假陰性結果，試驗結果不正確。

【發明內容】

[0006]為了克服以上現有技術中的技術問題，本發明提供一種馬尿酸鹽培養基，該培養基為β溶血性B族鏈球菌的生長提供需要的營養成分，同時不與茚三酮反應，避免假陰性結果出現，明確檢測細菌分解馬尿酸的能力。同時，該方法可方便地將馬尿酸鈉水解實驗加入細菌生化鑒定板中，增加升華鑒定板鑒定細菌的能力，給半自動、自動儀器讀取馬尿酸鈉水解實驗結果提供方便。
[0007]為了達到以上目的，本發明采取如下技術方案:一種馬尿酸鹽培養基，包括馬尿酸鹽，還包括蛋白胨、糖類營養成分、氯化鈉、緩沖液。
[0008]優選的是，按濃度百分比計，馬尿酸鹽培養基包括0.05-0.15%蛋白胨、0.3?0.9%糖類營養成分、0.3?0.9%氯化鈉、0.03-0.07%緩沖液、1.5?4.5%馬尿酸鈉。
[0009]上述任一方案優選的是，所述糖類營養成分包括葡萄糖和/或蔗糖。
[0010]上述任一方案優選的是，所述緩沖液包括磷酸氫二鈉和/或磷酸氫二鉀。
[0011]該馬尿酸鹽培養基能為β溶血性B族鏈球菌的生長提供需要的營養成分，β溶血性B族鏈球菌能夠很好的生長，同時不與茚三酮反應，能避免假陰性結果出現，能準確、明確鑒定β溶血性B族鏈球菌。
[0012]另一方面，本發明提供一種如上所述的馬尿酸鹽培養基的制備方法，包括以下步驟: A.稱取原料并溶解得到溶液；
B.調節溶液的pH至7.8;
C.將步驟B中得到的溶液加入培養容器中；
D.將步驟C中得到的培養容器進行干燥；
E.將步驟D中得到的培養容器進行滅菌。
[0013]優選的是，步驟D中采用烘干進行干燥。
[0014]上述任一方案優選的是，所述烘干溫度為30-60°C。
[0015]上述任一方案優選的是，所述烘干溫度為45°C。
[0016]上述任一方案優選的是，步驟D中，采用輻照進行滅菌。
[0017]上述任一方案優選的是，所述輻照的輻照計量為SkGy。
[0018]上述任一方案優選的是，所述制備方法還包括將培養容器進行包裝后滅菌。
[0019]上述任一方案優選的是，所述培養容器是指生化板中的一個或多個生化孔。這有利于將馬尿酸鈉水解實驗加入細菌生化鑒定板中，增加生化鑒定板鑒定細菌的能力，給半自動、自動儀器讀取馬尿酸鈉水解實驗結果提供方便。
[0020]上述任一方案優選的是，步驟C中，每個所述生化孔中加入步驟B中得到的溶液50微升。
[0021]上述任一方案優選的是，所述制備方法還包括對加入所述馬尿酸鹽培養基的生化孔進行標注，以便進行識別。
[0022]本發明提供的馬尿酸鹽培養基的制備方法，制備得到的馬尿酸鹽培養基，能夠很好為β溶血性B族鏈球菌提供營養，使得β溶血性B族鏈球菌在該馬尿酸鹽培養基中能很好的生長，生長狀況良好，進而使得馬尿酸鈉水解實驗結果準確，避免假陰性。
[0023]第三方面，本發明提供一種茚三酮試劑，包括茚三酮，還包括無水乙醇。
[0024]優選的是，所述茚三酮試劑，按濃度百分比計，包括茚三酮2%?7%。
[0025]上述任一方案優選的是，所述茚三酮的濃度百分比為3%?5%。
[0026]上述任一方案優選的是，所述茚三酮的濃度百分比為3.5%。
[0027]上述任一方案優選的是，所述茚三酮試劑還包括蒸餾水，用于定容。
[0028]上述任一方案優選的是，無水乙醇用于溶解茚三酮。
[0029]本發明提供的茚三酮試劑，配制過程簡單，采用無水乙醇將茚三酮溶解后，采用蒸餾水進行定容即可，簡單、易操作。
[0030]第四方面，本發明提供一種β溶血B族鏈球菌的鑒定方法，包括用馬尿酸鹽培養基培養細菌，然后加入茚三酮試劑，觀察結果，其中，所述馬尿酸鹽培養基為本發明第一方面所述的馬尿酸鹽培養基。
[0031]優選的是，所述馬尿酸鹽培養基通過本發明第二方面所述制備方法制備得到。
[0032]上述任一方案優選的是，所述茚三酮試劑是本發明第三方面提供的茚三酮試劑。
[0033]上述任一方案優選的是，所述鑒定方法包括如下順序實施的步驟: i.將菌懸液加入所述馬尿酸鹽培養基中，進行細菌培養；
i1.向培養后的細菌中加入所述茚三酮試劑，并觀察顯色結果。
[0034]上述任一方案優選的是，所述步驟i中，所述菌懸液用接種24小時的鏈球菌配制濃度為0.5麥氏濃度。
[0035]上述任一方案優選的是，所述步驟i中，每個所述生化孔中加入150微升所述菌懸液。
[0036]上述任一方案優選的是，所述步驟i中，細菌在35?37°C下培養。
[0037]上述任一方案優選的是，所述細菌在培養箱內培養。
[0038]上述任一方案優選的是，所述細菌培養18-24小時。
[0039]上述任一方案優選的是，所述步驟ii中，加入茚三酮試劑后，五分鐘后進行顯色結果觀察。一般更短的時間時，即會出現顏色反應，為了避免假陰性，將判讀時間延長到五分鐘，可避免假陰性結果。
[0040]上述任一方案優選的是，所述步驟ii中，每個所述生化孔里加入50?100微升茚三酮試劑。
[0041]觀察顯色結果時，若出現紫藍色，說明馬尿酸鹽水解為陽性，即受檢細菌為β溶血B族鏈球菌；如反應無顏色反應，說明馬尿酸鹽水解為陰性，即受檢細菌不是β溶血B族鏈球菌。
[0042]本發明提供的β溶血性B族鏈球菌鑒定方法，結果準確，能有效避免假陰性結果的出現，并且能實現半自動。
[0043]自動化。
【具體實施方式】
[0044]為了更加清楚、正確地理解本發明的
【發明內容】
，下面結合具體實施例對本發明的
【發明內容】
進一步做說明、解釋。
[0045]實施例1
一種馬尿酸鹽培養基，由以下組成構成:
蛋白胨0.05g
葡萄糖0.3g
氯化鈉0.3g
磷酸氫二鈉 0.03g 馬尿酸鈉 1.5g 蒸饋水100ml。
[0046]換算成濃度百分比=質量/體積X100%，如下:
蛋白胨0.05%
葡萄糖0.3%
氯化鈉0.3%
磷酸氫二鈉 0.03%
馬尿酸鈉 1.5%。
[0047]本實施例中，該馬尿酸鹽培養基通過以下方法制備得到:
首先:按照以上組成稱取原料并溶于10ml蒸餾水中；
第二步:米用 Imol/LNaOH 及 lmol/LHCl 調節 pH 至 7.8 ；
第三步:將調節PH后的溶液50微升加入培養皿中；并在45 °C下進行烘干，干燥后，將培養皿包裝并進行輻照滅菌，本實施例中，輻照計量為SkGy。
[0048]本實施例中，制備得到的馬尿酸鹽培養基可以儲存備用，也可以立即使用，立即使用的情況下，該培養基可不進行包裝。
[0049]該馬尿酸鹽培養基用于鑒定β溶血性B族鏈球菌的方法如下:用前一天接種的鏈球菌配制濃度為0.5麥氏單位的菌懸液;將150微升菌懸液加入到有菌懸液的培養基中，在35?37 °C的培養箱內培養18小時;然后，往培養基中加入茚三酮試劑，茚三酮的試劑的加入量為50?100微升(如果采用3ml滴管進行滴加，大約I?2滴)，五分后，進行顏色結果判讀;若出現紫藍色，說明馬尿酸鹽水解為陽性，即受檢細菌為β溶血B族鏈球菌;如反應無顏色反應，說明馬尿酸鹽水解為陰性，即受檢細菌不是β溶血B族鏈球菌。
[0050]其中，茚三酮試劑由以下組成構成:
茚三酮 7g
無水乙醇 50ml 蒸饋水 50ml。
[0051]制備茚三酮試劑時，優選將配制號的茚三酮試劑進行輻照滅菌，輻照劑量為8kGy。其中，無水乙醇的量以完全溶解茚三酮為準。
[0052]本實施例中，菌懸液選擇化膿鏈球菌、肺炎鏈球菌、停乳鏈球菌，顏色反應結果為陰性;菌懸液選擇無乳鏈球菌，顏色反應結果顯示陽性。并且，進行多次平行試驗，結果仍保持一致，準確率達到99.9%以上。
[0053]對比地，發明人采用不同濃度百分比(1%、3%、5%、10%、20%)的馬尿酸鈉溶液對無乳鏈球菌β溶血B族鏈球菌)進行培養，并采用茚三酮試劑檢測產物甘氨酸，觀察顏色反應結果，其他條件均相同，結果顯示，在這些所有馬尿酸鈉溶液中，無乳鏈球菌生長特別緩慢，甚至不生長，最終顏色反應結果顯示，無乳鏈球菌的鑒定準確率只有不到50%。
[0054]實施例2.1
一種馬尿酸鹽培養基，與實施例1基本相同，不同的是，本實施例中的，馬尿酸鹽培養基，由以下組成構成:
蛋白胨0.08g
葡萄糖0.48g
氯化鈉0.48g
磷酸氫二鈉 0.04g 馬尿酸鈉 2.4g 蒸饋水100ml。
[0055]實施例2.2
一種馬尿酸鹽培養基，與實施例1基本相同，不同的是，本實施例中的，馬尿酸鹽培養基，由以下組成構成:
蛋白胨0.15g
葡萄糖0.9g
氯化鈉0.9g
磷酸氫二鈉 0.07g 馬尿酸鈉 4.5g 蒸饋水100ml。
[0056]實施例2.3
一種馬尿酸鹽培養基，與實施例1基本相同，不同的是，本實施例中的，馬尿酸鹽培養基，由以下組成構成:
蛋白胨0.1g
葡萄糖0.6g
氯化鈉0.6g
磷酸氫二鈉 0.05g 馬尿酸鈉 3g 蒸饋水100ml。
[0057]實施例2.4
一種馬尿酸鹽培養基，與實施例1基本相同，不同的是，本實施例中的，馬尿酸鹽培養基，由以下組成構成:
蛋白胨0.12g
葡萄糖0.72g
氯化鈉0.72g
磷酸氫二鈉 0.06g 馬尿酸鈉 3.6g 蒸饋水100ml。
[0058]實施例2.5
一種馬尿酸鹽培養基，與以上基本相同，不同的是，所述磷酸氫二鈉替換為磷酸氫二鉀。
[0059]實施例2.6
一種馬尿酸鹽培養基，與以上基本相同，不同的是，所述葡萄糖替換為蔗糖。
[0060]實施例3.1
一種茚三酮試劑，與上述實施例所用茚三酮試劑基本相同，不同的是，本實施例中，茚三酮試劑由以下組成構成:
茚三酮 2g 無水乙醇 50ml 蒸饋水 50ml。
[0061]實施例3.2
一種茚三酮試劑，與上述實施例所用茚三酮試劑基本相同，不同的是，本實施例中，茚三酮試劑由以下組成構成:
茚三酮 3g 無水乙醇 50ml 蒸饋水 50ml。
[0062]實施例3.3
一種茚三酮試劑，與上述實施例所用茚三酮試劑基本相同，不同的是，本實施例中，茚三酮試劑由以下組成構成:
茚三酮 3.5g 無水乙醇 50ml 蒸饋水 50ml。
[0063]實施例3.4
一種茚三酮試劑，與上述實施例所用茚三酮試劑基本相同，不同的是，本實施例中，茚三酮試劑由以下組成構成:
茚三酮 4g 無水乙醇 50ml 蒸饋水 50ml。
[0064]實施例3.5
一種茚三酮試劑，與上述實施例所用茚三酮試劑基本相同，不同的是，本實施例中，茚三酮試劑由以下組成構成:
茚三酮 4.5g 無水乙醇 50ml 蒸饋水 50ml。
[0065]實施例3.6
一種茚三酮試劑，與上述實施例所用茚三酮試劑基本相同，不同的是，本實施例中，茚三酮試劑由以下組成構成:
茚三酮 5g 無水乙醇 50ml 蒸饋水 50ml。
[0066]實施例3.7
一種茚三酮試劑，與上述實施例所用茚三酮試劑基本相同，不同的是，本實施例中，茚三酮試劑由以下組成構成:
茚三酮 5.5g 無水乙醇 50ml 蒸饋水 50ml。
[0067]實施例3.8
一種茚三酮試劑，與上述實施例所用茚三酮試劑基本相同，不同的是，本實施例中，茚三酮試劑由以下組成構成:
茚三酮 6g 無水乙醇 50ml 蒸饋水 50ml。
[0068]實施例3.9
一種茚三酮試劑，與上述實施例所用茚三酮試劑基本相同，不同的是，本實施例中，茚三酮試劑由以下組成構成:
茚三酮 6.5g 無水乙醇 50ml 蒸饋水 50ml。
[0069]實施例3.10 一種茚三酮試劑，與上述實施例所用茚三酮試劑基本相同，不同的是，本實施例中，茚三酮試劑由以下組成構成:
茚三酮 2.5g 無水乙醇 50ml 蒸饋水 50ml。
[0070]實施例4.1
一種馬尿酸鹽培養基的制備方法，與上述實施例中基本相同，不同的是，實施第三步時，將50微升的pH為7.8的溶液加入生化杯中。
[0071]實施例4.2
一種馬尿酸鹽培養基的制備方法，與上述實施例中基本相同，不同的是，實施第三步時，將50微升的pH為7.8的溶液加入生化鑒定板的生化孔中。本實施例的馬尿酸鹽培養基制備方法有利于將馬尿酸鹽水解實驗加入細菌生化鑒定板中，增加生化鑒定板鑒定細菌的能力，給半自動、自動儀器讀取馬尿酸鹽水解實驗結果提供方便。
[0072]實施例5.1
一種β溶血B族鏈球菌鑒定方法，與上述實施例中基本相同，不同的是，用馬尿酸鹽培養基培養細菌的時候，培養時間為24小時。
[0073]實施例5.2
一種β溶血B族鏈球菌鑒定方法，與上述實施例中基本相同，不同的是，用馬尿酸鹽培養基培養細菌的時候，培養時間為20小時。
[0074]實施例5.3
一種β溶血B族鏈球菌鑒定方法，與上述實施例中基本相同，不同的是，用馬尿酸鹽培養基培養細菌的時候，培養時間為22小時。
[0075]實施例5.4
一種β溶血B族鏈球菌鑒定方法，與上述實施例中基本相同，不同的是，用馬尿酸鹽培養基培養細菌的時候，培養溫度為35 °C。
[0076]實施例5.5
一種β溶血B族鏈球菌鑒定方法，與上述實施例中基本相同，不同的是，用馬尿酸鹽培養基培養細菌的時候，培養溫度為36 °C。
[0077]實施例5.6
一種β溶血B族鏈球菌鑒定方法，與上述實施例中基本相同，不同的是，用馬尿酸鹽培養基培養細菌的時候，培養溫度為37 °C。
[0078]實施例5.7
一種β溶血B族鏈球菌鑒定方法，與上述實施例中基本相同，不同的是，加入茚三酮試劑的時候，采用3ml滴管滴加I滴，約50微升。
[0079]實施例5.8
一種β溶血B族鏈球菌鑒定方法，與上述實施例中基本相同，不同的是，加入茚三酮試劑的時候，采用3ml滴管滴加2滴，約100微升。
[0080]實施例5.9
一種β溶血B族鏈球菌鑒定方法，與上述實施例中基本相同，不同的是，加入茚三酮試劑的時候，加入60微升弗三酮試劑。
[0081]實施例5.10
一種β溶血B族鏈球菌鑒定方法，與上述實施例中基本相同，不同的是，加入茚三酮試劑的時候，加入80微升茚三酮試劑。
[0082]需要說明的是，以上各實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其限制;盡管參照前述各實施例對本發明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解:其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發明各實施例技術方案的范圍。
【主權項】
1.一種馬尿酸鹽培養基，包括馬尿酸鹽，其特征在于:還包括蛋白胨、糖類營養成分、氯化鈉、緩沖液。2.如權利要求2所述的馬尿酸鹽培養基，其特征在于:按濃度百分比計，馬尿酸鹽培養基包括0.05-0.15%蛋白胨、0.3-0.9%糖類營養成分、0.3?0.9%氯化鈉、0.03-0.07%緩沖液、1.5?4.5%馬尿酸鈉。3.—種如權利要求1-2中任一項所述的馬尿酸鹽培養基的制備方法，包括以下步驟: A.稱取原料并溶解得到溶液； B.調節溶液的pH至7.8; C.將步驟B中得到的溶液加入培養容器中； D.將步驟C中得到的培養容器進行干燥； E.將步驟D中得到的培養容器進行滅菌。4.如權利要求3所述的馬尿酸鹽培養基的制備方法，其特征在于:所述培養容器是指生化板中的一個或多個生化孔。5.如權利要求3所述的馬尿酸鹽培養基的制備方法，其特征在于:所述制備方法還包括對加入所述馬尿酸鹽培養基的生化孔進行標注。6.一種茚三酮試劑，包括茚三酮，其特征在于:還包括無水乙醇。7.如權利要求6所述的茚三酮試劑，其特征在于:所述茚三酮試劑，按濃度百分比計，包括茚三酮2%?7%。8.—種β溶血B族鏈球菌的鑒定方法，包括用馬尿酸鹽培養基培養細菌，然后加入茚三酮試劑，觀察結果，其特征在于:所述馬尿酸鹽培養基為權利要求1-2中任一項所述馬尿酸鹽培養基。9.如權利要求8所述的β溶血B族鏈球菌的鑒定方法，其特征在于:所述馬尿酸鹽培養基通過權利要求3-5中任一項所述制備方法制備得到。10.如權利要求9所述的β溶血B族鏈球菌的鑒定方法，其特征在于:所述茚三酮試劑是權利要求6-7中任一項所述的茚三酮試劑。
【文檔編號】C12Q1/14GK105821115SQ201610319446
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年5月16日
【發明人】王娜, 龐超, 楊偉偉
【申請人】山東鑫科生物科技股份有限公司