一種用于保存唾液中dna的組合物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫學領域，特別設及一種用于保存唾液中DNA的組合物。
【背景技術】
[0002] 目前，基因檢測已廣泛應用于生物學、醫學、法學、醫藥領域，其通過對受檢者血 液、血清、血漿、唾液、尿液、其它體液、組織或細胞等中的DNA的基因編碼序列進行測定和定 位分析，從而獲知受檢者基因信息。基因檢測對于遺傳疾病的控制與預防、個體化用藥方案 的制定、個人身份信息確認、親子關系鑒定等具有重要意義，例如可通過篩查藥物性耳聾易 感基因型，預防氨基糖武類抗生素中毒性耳聾;通過檢測CYP2C19基因多態性，從而預測藥 物給藥條件、毒副作用的強弱和藥物療效;通過對個體MTHFR基因C677T位點基因型進行檢 測可W提示個體發生腦卒中等屯、腦血管疾病及新生兒缺陷的風險，并預測甲氨蝶嶺和5-氣 尿喀晚等化療藥物的治療療效和毒副作用;通過提取檢測家屬的DNA對死者身份進行辨認 等。
[0003] 用于提取DNA的體液通常為靜脈血液中的白細胞，然而，采集靜脈血需專業人員操 作，并且采用侵入式方式，會對人體造成一定程度的創傷和不適，血液采集還可能存在交叉 感染的風險，此外，血液易于結塊，不利于長時間保存，給提取帶來許多不便。
[0004] 從唾液中提取DNA相對于傳統血液DNA采集方式來說，采集過程簡單方便，無需經 專業訓練的人員即可操作，且為非侵入式采集方式，可避免對受檢者造成不必要的痛苦，容 易被接受，能更大限度的擴大取樣范圍，尤其適合大規模人群調查。目前，從唾液中提取 DNA，主要是采用棉簽擦拭或口腔拭子獲取口腔黏膜脫落細胞，該方法所采集的DNA量少，樣 品保存時間短，且需要低溫保存，此外，唾液脫離人體后容易發生變質、降解。因此，如何有 效完整的保存唾液樣品，對于基于唾液中DNA的基因擴增和檢測具有重要意義。
[0005] 現有技術CN102440234A公開了一種人體唾液保存固定液，包括薦糖、Tris-HCK MgCh、異硫氯酸脈和水，能夠滅殺唾液中含有的細菌、抑制核酶的活性。然而，該固定液組 份中包含儀離子，屬于核酸酶激活劑，不利于DNA的穩定性保存;異硫氯酸脈雖然能夠抑制 核酸酶的活性，但對細胞的破壞性較強，不利于DNA的完整性保存。
[0006] 現有技術CN102676501A6公開了一種唾液DNA保存劑，包括S徑甲基氨基甲燒、乙 二胺四乙酸二鋼、糖、氯化鋼和表面活性劑，其能夠實現唾液中DNA的常溫下長時間保存。然 而，由于唾液樣品中存在脫氧核糖核酸酶和核糖核酸酶，能夠分解DNA或RNA，較低濃度的表 面活性劑，難W充分抑制核酸酶的活性，可能影響DNA的穩定性。
[0007] 目前，存在開發出一種高效、穩定、常溫下長時間用于保存唾液中DNA的組合物的 需求。

【發明內容】

[000引本發明的目的是針對現有技術存在的技術缺陷，提供一種高效、穩定、常溫下長時 間用于保存唾液中DNA的組合物。
[0009] 為了實現本發明的目的，本發明采用如下技術方案：
[0010] 一種用于保存唾液中DNA的組合物，包括變性劑、緩沖液、馨合劑、氯化鋼和聚乙二 醇。
[0011] 在本發明一【具體實施方式】中，所述變性劑為鹽酸脈、苯酪和表面活性劑中的一種 或幾種。其中，所述表面活性劑包括但不限于:十二烷基硫酸鋼(Sodi皿dode巧1 SUl化te， SDS)、十二烷基肌氨酸鋼（Sodium N-Iauroylsarcosine，NLS)、聚乙二醇辛基苯基酸 (Triton X-100)、吐溫20(聚氧乙締失水山梨醇單月桂酸醋）、吐溫40(聚氧乙締失水山梨醇 單棟桐酸醋）、吐溫60(聚氧乙締失水山梨醇單硬脂酸醋）、吐溫65(聚氧乙締失水山梨醇= 硬脂酸醋）、吐溫80(聚氧乙締失水山梨醇單油酸醋）中的一種或幾種。
[0012] 在本發明一【具體實施方式】中，所述變性劑在組合物中的濃度按質量體積百分比計 大于30 %，優選為30~60 %，更優選為40~60 %。
[0013] 本發明實施方式中，通過變性劑抑制脫氧核糖核酸酶（DNA酶）W及核糖核酸酶 (RNA酶）的活性，并且不會導致DNA鏈的斷裂，保證唾液中DNA的完整性。
[0014] 在本發明一【具體實施方式】中，所述變性劑包括鹽酸脈。
[001引本發明實施方式中，鹽酸脈可較好的抑制DNA酶和RNA酶的活性，防止唾液中的DNA 降解，使唾液中DNA保持長時間完整性和穩定性;此外，可通過鹽酸脈溶解唾液中的蛋白質， 將蛋白從核酸上解離下來，減少后續檢測中唾液樣品中DNA提取和純化時間。
[0016] 在本發明其它實施方式中，所述變性劑為鹽酸脈和表面活性劑的組合。
[0017] 在本發明一【具體實施方式】中，所述鹽酸脈在組合物中的濃度按質量體積百分比計 大于20 %，優選為20~60 %，更優選為30~60 %，最優選為40~60 %。
[0018] 在本發明一【具體實施方式】中，所述緩沖液為S徑甲基氨基甲燒、Tris-HCl緩沖液、 憐酸鹽緩沖液、己比妥緩沖液中的一種，優選為Tris-HCl緩沖液。
[0019] 本發明實施方式中，通過緩沖液為組合物提供合適的pH值和緩沖環境，防止核酸 被破壞。
[0020] 在本發明一【具體實施方式】中，所述馨合劑為乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸鹽或其 水合物（如乙二胺四乙酸二鋼、乙二胺四乙酸二鋼二水、乙二胺四乙酸四鋼二水等）、巧樣 酸、巧樣酸鹽或其水合物(如巧樣酸鋼、巧樣酸鋼二水、巧樣酸鋼=水、巧樣酸鐘、巧樣酸鐘 一水、巧樣酸鐘=水等）、環己二胺四乙酸中的一種或幾種。
[0021] 本發明實施方式中，通過馨合劑馨合唾液中的Mg2^Xa2+或Mn2+離子，防止金屬離子 與DNA的憐酸骨架相結合，此外，還可抑制DNA酶的活性。
[0022] 在本發明一【具體實施方式】中，所述聚乙二醇平均分子量為4000-8000,例如 陽G4000、PEG6000、PEG8000等，優選為陽G6000。本發明中陽G6000是指平均分子量約為6000 的聚乙二醇。
[0023] 在本發明一【具體實施方式】中，所述用于保存唾液中DNA的組合物包括如下濃度的 組分:30~60%的變性劑、5~20mM的Tris-肥1緩沖液(P冊.8-8)、1.5~2.5%的邸TA、100~ 300mM的巧樣酸鋼或其水合物、600~900mM的氯化鋼、0.2~1%的PEG6000,溶劑為水；
[0024] 其中，所述變性劑、EDTA、PEG6000的濃度按質量體積百分比計；
[00巧]所述抓TA為乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二鋼、乙二胺四乙酸二鋼二水、乙二胺四 乙酸四鋼二水中的一種或多種；
[0026] 所述巧樣酸鋼或其水合物包括巧樣酸鋼、巧樣酸鋼二水、巧樣酸鋼=水中的一種 或多種。
[0027] 在本發明一【具體實施方式】中，所述用于保存唾液中DNA的組合物包括如下濃度的 組分:30~60%的變性劑、5~20mM的Tris-肥1緩沖液(pH6.8-8)、2%的抓TAJOOmM的巧樣 酸鋼或其水合物、SOOmM的氯化鋼、0.5 %的PEG6000，溶劑為水；
[00%]其中，所述變性劑、EDTA、PEG6000的濃度按質量體積百分比計；
[00巧]所述抓TA為乙二胺四乙酸、乙二胺四乙酸二鋼、乙二胺四乙酸二鋼二水、乙二胺四 乙酸四鋼二水中的一種或多種；
[0030] 所述巧樣酸鋼或其水合物包括巧樣酸鋼、巧樣酸鋼二水、巧樣酸鋼=水中的一種 或多種。
[0031] 在本發明一【具體實施方式】中，所述用于保存唾液中DNA的組合物包括如下濃度的 組分:40-60 %的鹽酸脈、0.1~1 %的表面活性劑、5~20mM的IYiS-HCl緩沖液(pH6.8-8)、 2%的乙二胺四乙酸二鋼、200mM的巧樣酸鋼二水、SOOmM的氯化鋼、0.5%的陽G6000,溶劑為 水；
[0032] 其中，所述變性劑、EDTA、PEG6000的濃度按質量體積百分比計。
[0033] 在本發明一【具體實施方式】中，本發明組合物可W試劑盒的形式存在。
[0034] 本發明組合物可用于保存唾液，尤其是人體唾液。該組合物能夠在常溫下長時間 保持唾液中DNA的完整性和有效性。
[00巧]本發明有益效果：
[0036] 本發明組合物能夠在室溫條件下長時間（超過15個月）有效的保存唾液中的DNA， 并能夠有效降低離體唾液中DNA的降解，易于后續的核酸檢測研究，且使用簡單，操作方便， 大大節省了唾液樣品的處理時間。
【附圖說明】
[0037] 圖1本發明實施例1中唾液樣品1-樣品10的瓊脂糖凝膠電泳檢測結果圖，圖中，樣 品1至樣品10按從左至右依次排列。
[0038] 圖2本發明實施例帥唾液樣品11在不同時間段中DNA的實時巧光定量PCR檢測的 結果圖，圖中，不同的線分別代表第0個月、第3個月、第6個月、第9個月、第12個月和第15個 月。
[0039] 圖3本發明實施例2中唾液樣品12在不同時間段中DNA的實時巧光定量PCR檢測的 結果圖，圖中，不同的線分別代表第0個月、第3個月、第6個月、第9個月、第12個月和第15個 月。
[0040] 圖4本發明實施例3中唾液樣品13(野生型）的實時巧光定量PCR檢測的結果圖。
[0041] 圖5本發明實施例3中唾液樣品14(野生型）的實時巧光定量PCR檢測的結果圖。
[0042] 圖6本發明實施例3中唾液樣品15(1555A〉G突變）的實時巧光定量PCR檢測的結果 圖。
[0043] 圖7本發明實施例3中全血樣品16(野生型）的實時巧光定量PCR檢測的結果圖。
[0044] 圖8本發明實施例3中全血樣品17(野生型）的實時巧光定量PCR檢測的結果圖。
[0045] 圖9本發明實施例3中全血樣品18 (1555A〉G突變）的實時巧光定量PCR檢測的結果 圖。
[0046] 本發明中圖4-9中，橫坐標為溫度，單位為°C;縱坐標為-d(化)/dT，化為原始巧光 值。
【具體實施方式】
[0047] 為進一步說明