一種以唾液為檢測樣本的肝癌診斷試劑及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫藥領域，涉及一種診斷肝癌的試劑及試劑盒。
【背景技術】
[0002] 我國是肝癌大國，肝癌的發病率和死亡率都占了全球的一半以上。肝癌的準確診 斷具有重要的現實意義。
[0003] 現時，國際上通常用來篩查肝癌的生物標志物是血清AFP (甲胎蛋白）。但其敏感 性只有39%至65%，特異性只有76%至94%。由于其檢測肝癌的敏感性跟特異性不甚理 想，因此美國的治療指南不推薦血清AFP用于肝癌的診斷。中國跟歐洲的治療指南都指出， 正常個體的AFP水平應小于20ng/ml，大于400ng/ml則可提示肝癌的診斷。而20至400ng/ ml則是診斷的"灰色地帶"。因此利用AFP篩查肝癌容易導致誤診漏診。
[0004] 除了血液取樣方式，另一種診斷方式是組織取樣診斷。然而，肝組織取樣對人體破 壞性強，因此，亟須一種沒有創傷式而準確的診斷方法。
[0005] 人體唾液腺中存在許多毛細血管網，因此，唾液是血液循環的末端產物。血液中存 在的分子物質，例如DNA、RNA、蛋白、藥物、病毒等，都能在唾液中找到。因而唾液被認為是人 體健康狀態的一面鏡子，能反映出機體的各種內環境狀態，例如癌癥、感染、系統性疾病等。 美國的食品及藥物管理局（FDA)已經批準了利用唾液檢測藥物濫用、HIV感染、激素水平、 中毒等試劑在市場上應用，現已在全美都已經得到普及。在臨床中，于唾液中尋找分子標記 物是最理想的方法，因為收集唾液存在簡單、方便、無創、經濟、不會引起患者不安、操作者 易于掌握等優點。研究已經證實了唾液中的轉錄物、蛋白、代謝物和其他分子物質能檢測出 口腔癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、干燥綜合征等其他口腔或者系統性疾病。體內的長鏈非編碼 RNA(long non-coding RNA，IncRNA)與包括肝癌在內的多種癌癥的發病與發展密切相關。 研究發現多種IncRNA在肝癌組織中表達失調，組織中表達失調的IncRNA可作為生物標記 物對肝癌有較佳的診斷價值。但唾液IncRNA是否可作為生物標記物協助診斷肝癌，目前尚 無報道。

【發明內容】

[0006] 本發明目的在于提供一種以唾液作為檢測樣本的檢測肝癌的試劑和試劑盒。
[0007] 本發明同時提供了試劑盒的使用方法。
[0008] 本發明還提供以唾液作為檢測樣本的方法。
[0009] 發明首先提供了一種以唾液作為檢測樣本的檢測肝癌的試劑，該試劑為IncRNA H19檢測試劑，該試劑的檢測對象為唾液樣本。
[0010] 發明同時提供了 IncRNA H19唾液檢測試劑在制備檢測肝癌試劑或試劑盒中的應 用。
[0011] 以唾液作為樣本來進行肝癌標記物的檢測，最大的難點在于，需要尋找到能分泌 到唾液中的，且在唾液中能穩定存在的標記物。盡管目前已有大批的肝癌標記物被發現，這 些標記物存在于組織樣品或血液樣品中，然而，同樣的標記物采用唾液樣本取樣，往往是另 一個結果，不能用作肝癌診斷。這很可能是因為能被分泌到唾液中的標記物本身就很少，并 且唾液中存在大量的酶，標記物容易降解。因此，以唾液樣本檢測肝癌，在此前仍未見任何 報道。
[0012] 而本發明的一大突破在于，發明人發現，在肝癌患者中其唾液樣本存在大量的 IncRNA H19。其穩定而大量地存在，能被高重現性地檢出。而正常樣本中，該標記物表達水 平非常低。這使得IncRNA H19成為一種良好的唾液樣本標記物，對于肝癌的檢測或診斷具 有突破性的意義。
[0013] 本發明進一步提供給了一種以唾液作為檢測樣本的檢測肝癌的試劑盒，其含有蛋 白酶和IncRNA H19檢測試劑。
[0014] 上述的IncRNA H19檢測試劑含有檢測用引物，所述引物的序列如SEQ ID NO. 1和 SEQ ID NO. 2 所示。
[0015] 作為可選的實施方式所述的蛋白酶選自蛋白酶K。
[0016] 優選地，所述的試劑盒還含有酸酚氯仿混合物。并且進一步優選地，還可含有 DEPC(焦碳酸二乙酯）。
[0017] 可選地，所述的酸酚氯仿混合物為鹽酸-苯酚-氯仿混合物；優選地；苯酚與氯仿 的體積比為（4. 5-5. 5) : 1 ;優選地，所述的酸酚氯仿混合物pH值為4. 3-4. 7。
[0018] 發明還提供給了一種檢測唾液IncRNA H19的方法，包括以下步驟：提取唾液中總 RNA后，進行lncRNH19的逆轉錄，再通過qPCR反應檢測IncRNA H19水平。
[0019] 提取唾液IncRNA H19的方法可采用以下步驟：
[0020] S1.取唾液樣本，加入蛋白酶，60_65°C孵育以去除唾液蛋白；
[0021] S2.加入酸酚仿混合物后，10000-12000g離心4-6分鐘，收集上清；
[0022] S3?加入1. 25倍體積的乙醇，再經5000-6000g離心20-100秒過濾離心，棄
[0023] 濾液；
[0024] S4?加入預熱的 DEPC 水，10000-12000g 離心 20-100 秒，收集 RNA。
[0025] 本發明的方法可成功提取唾液中的總RNA，最后利用qPCR(定量聚合酶鏈反應）技 術可檢測出特定的RNA。
[0026] 本發明首次在唾液中尋找到診斷肝癌敏感特異的生物標記物--IncRNA H19。
[0027] 通過統計學分析發現，唾液H19在乙肝相關性肝癌患者中的表達水平顯著升高。 然后建立預測診斷肝癌的R0C曲線推斷，正常個體的值應小于22. 919725。若受檢個體的 唾液H19的表達水平大于此值，則受檢個體判定為肝癌的敏感性為68. 7 %，特異性為87 %。 唾液IncRNA H19在成為協助篩查乙肝相關性肝癌的標志物方面具有良好的前景，收集唾液 的取樣方式簡單、方便、無創、價廉、不會引起患者不安、操作者易于掌握、受檢者易于接受， 且準確率高，對肝癌的早診早治，降低死亡率，減輕我國的醫療負擔具有重大的意義。
【附圖說明】
[0028] 圖1為不同肝組織樣本中的H19表達水平。
[0029] 圖2為不同人群唾液樣本中的H19表達水平。
[0030] 圖 3 為唾液 H19 檢測結果的 R0C(Receiver Operating Characteristic)曲線。
[0031] 圖4為肝癌患者的血清AFP水平。
[0032] 圖5為不同AFP表達水平患者的唾液H19檢出水平。
[0033] 圖6為H19的qPCR擴增曲線（圖6A)和溶解曲線（圖6B)。
[0034] 圖7為IncRNA MALAT1和微小RNA miR-224在肝組織樣本檢測結果。
[0035] 圖8為IncRNA MALAT1和微小RNA miR-224在唾液樣本檢測結果。
【具體實施方式】
[0036] 以下通過具體的實施例進一步說明本發明的技術方案，具體實施例不代表對本發 明保護范圍的限制。其他人根據本發明理念所做出的一些非本質的修改和調整仍屬于本發 明的保護范圍。
[0037] 實施例1唾液采集
[0038] 在唾液采集前，研究個體需禁食、禁飲、禁煙和禁止口腔清潔2h以上。
[0039] 為增加唾液收集量，采用2%檸檬酸溶液濕潤無菌棉簽棉花頭，然后將棉花頭放于 研究個體舌頭一側的后側壁約5s，吐出唾液后，再將棉簽放到另一側的舌頭后側壁。如此 反復收集。唾液收集量需達5ml以上，收集管使用50ml無菌無酶離心管。4°C、3000g離心 15min取上層上清至1. 5ml Eppendoff管，再以4°C、12000g離心10min后再棄沉淀取上清。 標本處理后均置-80°C保存。
[0040] 實施例2唾液總RNA的提取
[0041] 1.將1ml唾液平均分裝在兩支1. 5ml的無酶EP管上，即每支EP管都盛有500 y 1 的唾液，然后向每只EP管加入蛋白酶K(20mg/ml) 15 y 1，混勻，放于65°C水浴鍋孵育過夜。 因為唾液中含有較多的消化酶類等蛋白，影響后續提取唾液RNA的效果，因此此法可去除 唾液蛋白對實驗的影響。
[0042] 2?兩支EP管各加0? 5ml的酸酚氯仿混合物（主要成分為鹽酸、苯酚與氯仿）到上 述唾液混合液中。
[0043] 酸酚氯仿的配置
[0044] 2. 1苯酚與氯仿的比例為：5:1
[0045] 2. 2用濃鹽酸調pH值，pH值定在4. 5左右，此pH值最利于提取RNA。混勻。
[0046] 3.加入后手動搖勻30到60秒
[0047] 4.室溫下10000g離心5分鐘。離心后中層液體需緊致，否則重新離心。
[0048] 5.收集上清，需謹慎，不能攪動下層液相。
[0049] 6.將1. 25倍體積的100%乙醇加到上清液中。例如收集到500 y 1上清，則加 625 yl無水乙醇。
[0050] 7.將過濾管放入收集管內，將上述混合物加到過濾管中（過濾管和收集管市場上 有銷售）。<