高效液相色譜串聯質譜技術檢測唾液中孕酮和睪酮的方法及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及唾液檢測的技術領域，特別涉及一種高效液相色譜串聯質譜技術檢測 唾液中孕酮和睪酮的方法。
【背景技術】
[0002] 目前常用的檢測唾液中孕酮和睪酮的方法有酶聯免疫法、電化學發光免疫法等， 這些方法受到多種客觀條件的影響，如溫度、pH值、離子強度、試劑免疫活性等。免疫法不可 避免唾液基質中結構相似物質的干擾，靈敏度低。不同廠家生產的試劑盒檢測結果偏差較 大，缺乏統一標準，導致檢測結果偏差較大，參考價值較低。

【發明內容】

[0003] 本發明的目的是解決現有唾液中孕酮和睪酮檢測方法技術中存在的部分問題，提 供一種高效液相色譜串聯質譜技術檢測唾液中孕酮和睪酮的方法及試劑盒。
[0004] 本發明的目的是通過以下技術方案實現的：
[0005] -種高效液相色譜串聯質譜技術檢測唾液中孕酮和睪酮的方法，包括如下步驟：
[0006] 采用高效液相色譜串聯質譜技術檢測經過預處理的唾液中孕酮和睪酮，利用高效 液相色譜將孕酮和睪酮與雜質分離，再利用同位素內標法定量，以標準品與內標物的濃度 比為X軸，標準品與內標物峰面積比為Y軸，建立校準曲線，計算孕酮和睪酮的含量；
[0007] (1)具體色譜條件為：
[0008] 流動相A:體積比為0.05 %的甲酸水；
[0009] 流動相B:甲醇，純度為色譜純；
[0010] 色譜柱型號：Phenomenex Kinetex_C18,50X2. lmm，2.6ym;
[0011] 采用梯度洗脫的方式，見表1;
[0012] 流速為0.2ml/min，柱溫為40°C，進樣體積為20μ1;
[0013] 表1流動相梯度洗脫參數
[0014]
[0015] ⑵質譜條件：
[0016]在電噴霧電離正離子檢測模式下，采用多反應監測的質譜掃描模式;噴霧電壓為 5000V;碰撞氣為6;氣簾氣為10;離子源氣流GS1為50，GS2為50;離子源溫度為500°C ;同時監 測目標物孕酮m/z 315.3-109.1、睪酮m/z 289.3-109.1、同位素內標d9-孕酮m/z 324.4 -100.1;孕酮和睪酮及內標的去簇電壓、碰撞電壓、碰撞能和碰撞池出口電壓參數見表2; [00 17]表2孕酮和睪酮及內標的質譜參數
[0018] _
I. 〇
[0019] 優選地，所述經預處理的唾液按照如下方法制備得到：取唾液500μ1于2ml離心管 中，加入50ng/ml內標溶液10μ1，混勾后，加 lml萃取液，禍旋混合5min，13000r/min離心 lOmin，取上清800μ1;氮氣吹干，以10%甲醇水10(^1進行復溶，渦旋311^11;1300(^/1^11，離心 3min，進樣檢測。
[0020] 優選地，所述內標溶液配制:準確稱取孕酮、睪酮標準品，分別用甲醇溶解后配制 lmg/ml的儲備液;孕酮標準溶液儲備液10μ1與睪酮標準溶液儲備液1 ΟμL混合，再以純甲醇 稀釋至400μ1，得25μg/ml的工作液。
[0021] 優選地，所述萃取液為乙酸乙酯。
[0022] 優選地，所述氮氣吹干溫度為40~50°C。
[0023]本發明的另一方面通過以下方案實現：
[0024] 高效液相色譜串聯質譜技術檢測唾液中孕酮和睪酮的試劑盒，所述試劑盒包括如 下試劑：
[0025] (1)洗脫液：
[0026] 洗脫液A: 0.05% V/V的甲酸水；
[0027]洗脫液B:甲醇，色譜純；
[0028] (2)標準品母液:孕酮的甲醇溶液，睪酮的甲醇溶液；
[0029]配制：分別精確稱取10mg孕酮、睪酮標準品，分別用甲醇溶解定容至10ml，得lmg/ ml的母液；
[0030] (3)內標液:d9-孕酮的甲醇溶液；
[0031 ] 配制：精確稱取10mg d9-孕酮的標準品，用甲醇溶解定容至10ml，得lmg/ml的母 液;用甲醇依次稀釋得50ng/ml的內標溶液；
[0032] (4)稀釋液：
[0033] 稀釋液1:空白唾液基質溶液，將0.4g牛血清蛋白用水定容至10ml制得；
[0034] 稀釋液2:甲醇；
[0035] (5)萃取液：乙酸乙酯；
[0036] (6)質控品：孕酮和睪酮的空白唾液基質溶液，分低中高濃度QC(L)、QC(M)、QC(H)， 濃度分別為:50pg/ml、lOOpg/ml、250pg/ml;
[0037] 孕酮標準溶液儲備液10μ1與睪酮標準溶液儲備液10μ1混合，再以純甲醇稀釋至 400μ1，得25μg/ml的溶液A，取1 ΟΟμΙ溶液Α甲醇稀釋至100ml得25ng/ml的溶液Β;
[0038] QC(H):取100μΙ溶液B，用稀釋液1定容至10ml;
[0039] QC(M):取40μ1溶液B，用稀釋液1定容至10ml;
[0040] QC(L):取20μ1溶液B，用稀釋液1定容至10ml;
[00411 (7)復溶液:體積比為10%甲醇。
[0042]本發明的有益效果:通過對前處理方法的改良，前處理更加簡單、快捷，可實現批 量處理；同時ESI利用離子蒸發，液相離子化，適用于高分子量測定，大大提高了檢測信號的 靈敏度;方法學考察結果顯示，該方法精密度、準確度、穩定性均滿足定量分析要求;本發明 方法具有準確度高、重現性好，穩定、可靠的特點，可用于唾液中孕酮和睪酮的檢測。與酶聯 免疫法相比，不僅提高靈敏度，操作簡單，對操作環境要求不是很高，一般實驗室均可完成， 而且節約分析成本，所需分析時間較短，利于開展大批量樣本檢測，適于進行人群中相關疾 病的篩查;檢測孕酮的含量，對孕激素治療監測、評價妊娠早期狀態、診斷黃體功能狀態方 面具有重要指導作用。檢測唾液中睪酮含量，可以評估男性激素周期波動；同時檢測唾液中 孕酮及睪酮的含量，可以進行女性更年期激素水平評估、女性激素周期波動評估。應用本發 明試劑盒檢測唾液中孕酮和睪酮，前處理過程操作簡單，靈敏度高、特異性強、準確性好。
【附圖說明】
[0043]圖1為孕酮和睪酮及內標d9-孕酮標準品的總離子流色譜圖；
[0044] 圖2為唾液中孕酮和睪酮及內標d9-孕酮的總離子流色譜圖。
【具體實施方式】
[0045] 為了更好地說明本發明，下面對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描 述。
[0046] -種高效液相色譜串聯質譜技術檢測唾液中孕酮和睪酮的方法，包括如下步驟：
[0047] 采用高效液相色譜串聯質譜技術檢測經預處理的唾液中孕酮和睪酮，利用高效液 相色譜將孕酮和睪酮與雜質分離，再利用同位素內標法定量，以標準品與內標物的濃度比 為X軸，標準品與內標物峰面積比為Y軸，建立校準曲線，計算孕酮和睪酮的含量；
[0048] (1)具體色譜條件為：
[0049] 流動相A:體積比為0.05 %的甲酸水；
[0050] 流動相B:甲醇，純度為色譜純；
[0051] 色譜柱型號：Phenomenex Kinetex_C18,50X2. lmm，2.6ym;
[0052] 采用梯度洗脫的方式，見表1;
[0053] 流速為0.2ml/min，柱溫為40°C，進樣體積為20μ1;
[0054]表1流動相梯度洗脫參數
[0055]
[0056] (2)質譜條件：
[0057] 在電噴霧電離正離子檢測模式下，采用多反應監測的質譜掃描模式;噴霧電壓為 5000V;碰撞氣為6;氣簾氣為10;離子源氣流GS1為50，GS2為50;離子源溫度為500°C ;同時監 測目標物孕酮m/z 315.3-109.1、睪酮m/z 289.3-109.1、同位素內標d9-孕酮m/z 324.4 -100.1;孕酮和睪酮及內標的去簇電壓、碰撞電壓、碰撞能和碰撞池出口電壓參數見表2;
[0058] 表2孕酮和睪酮及內標的質譜參數 「00591
[00611 所述經預處理的唾液按照如下方法制備得到：取唾液500μ1于2ml離心管中，加入 50ng/ml內標溶液10μ1，混勾后，加 lml萃取液，禍旋混合5min，13000r/min離心10min，取上 清800μ1;氮氣吹干，以10%甲醇水10(^1進行復溶，渦旋311^11;1300(^/1^11，離心31^11，進樣 檢測。
[0062] 所述內標溶液配制:稱取孕酮同位素內標，甲醇溶解，配制lmg/ml的儲備液；以甲 醇稀釋至50ng/ml即得實驗所需內標溶液。所述萃取液為乙酸乙酯。所述氮氣吹干溫度為40 ~5(TC〇
[0063] 高效液相色譜串聯質譜技術檢測唾液中孕酮和睪酮的試劑盒，所述試劑盒包括如 下試劑：
[0064] (1)洗脫液：
[0065] 洗脫液A: 0.05%的甲酸水；
[0066]洗脫液B:甲醇，色譜純；
[0067] (2)標準品母液:孕酮的甲醇溶液，睪酮的甲醇溶液；
[0068]配制：分別精確稱取10mg孕酮、睪酮標準品，分別用甲醇溶解定容至10ml，得lmg/ ml的母液；
[0069] (3)內標液:d9-孕酮的甲醇溶液；
[0070] 配制：精確稱取10mg d9-孕酮的標準品，用甲醇溶解定容至10ml，得lmg/ml的母 液;用甲醇依次稀釋得50ng/ml的內標溶液；
[0071] (4)稀釋液：
[0072] 稀釋液1:空白唾液基質溶液，將0.4g牛血清蛋白用水定容至10ml制得；
[0073] 稀釋液2:甲醇；
[0074] (5)萃取液：乙酸乙酯；
[0075] (6)質控品：孕酮和睪酮的空白唾液基質溶液，分低中高濃度QC(L)、QC(M)、QC(H)， 濃度分別為:50pg/ml、100pg/ml、250pg/ml;
[0076] 孕酮標準溶液儲備液10μ1與睪酮標準溶液儲備液10μ1混合，再以純甲醇稀釋至 400μ1，得25μg/ml的溶液A，取1 ΟΟμΙ溶液Α甲醇稀釋至100ml得25n