專利名稱：蛋白下垂誘導組合物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種新的蛋白下垂(apotosis)誘導組合物。
本發明的公開本發明的蛋白下垂誘導組合物包含作為一種活性成份的至少一種選自下式(1)所表示的菲衍生物及其鹽的物質 其中R為氫原子或低級烷基(下文稱作化合物(1))。
以上化合物(1)及其生產過程已公開在例如，日本公開特許公報第211035/1992號和第1746/1994號中。該化合物作為白細胞介素-1抑制劑的用途也是已知的。
本發明的發明入對化合物(1)進行了進一步研究，并且發現該化合物具有由該化合物所述已知作用難以預知的蛋白下垂誘導(誘導或促進)活性。
同時，已知細胞死亡包含兩類機理。其一是傳統類型的細胞死亡，稱為壞死。壞死在形態學上的特征在于，線粒體顯著膨脹，細胞質和細胞核交替膨脹，然后細胞破壞和自溶以后。它的發生是被動的或偶然的。組織壞死一般是由，例如，細胞體損傷或化學毒素引起的。
另一類細胞死亡稱為蛋白下垂(程序細胞死亡)[Kerr，J.F.R.和Wyllie，A.H.，Br.J.Cancer，265.239(1972)]。已知蛋白下垂能在各種生理條件下發生。蛋白下垂(apotosis)的特征為相鄰細胞失去接觸，細胞質濃縮，與核酸內切酶活性有關的染色體凝聚并固縮，以及細胞核分裂。也可觀察到微絨毛從細胞表面消失和細胞表面(細胞表面上的絨毛膜結構膜泡)變光滑。也可進一步觀察到由于核酸內切酶活化，細胞核體的DNA單元斷裂成180-200個堿基大小的DNA片段。下垂蛋白體細胞的最終碎片被相鄰細胞吞噬。這是Duvall和Wyllie[Duvall，E.和Wyllie，A.H.，Immunology Today，7(4)，115-119(1986)；Science，245，301-305(1989)]討論的機理。Wyllie進一步報道了糖腎上腺皮質激素誘導的胸腺細胞的蛋白下垂與細胞內核酸內切酶活化有關[Wyllie，A.H.，Nature，284，555-556(1986)]。可通過瓊脂糖凝膠電泳容易地證實核酸內切酶活性引起的蛋白下垂細胞內的DNA斷裂為低聚核苷酸。
上述的蛋白下垂可被認為是在組織的發育、分化、轉化過程中所見的前序細胞的死亡[Wyllie，A.H.，等Int.Rev.Cytol，68，251-306(1980)]。
胸腺細胞中鈣離子體的鈣濃度或cAMP濃度的提高促進以上述蛋白下垂為特性的DNA斷裂[Wyllie，A.H.，等J.Pathol.，142，67-77(1984)]，并且因此鈣離子和/或cAMP可能與蛋白下垂的機理有關。作為目前報道的一個實例可提到由視黃酸或鈣離子體誘導分化的HL-60細胞的蛋白下垂[Martin，S.J.，等，J.Immunol.，145，1859-1867(1990)；Martin，S.J.，等，Clin.Exp.Immunol.，79，448-453(1990)]。
據報道，蛋白下垂不僅是在胚胎發生過程中的細胞的生理死亡和活細胞周期中普通細胞的生理死亡(例如，肝臟、腎上腺皮質和前列腺細胞)中發生，同時也受糖腎上腺皮質激素治療、細胞毒性T細胞造成的細胞損傷、激素依賴組織的萎縮、輻射、NK細胞、殺傷細胞、腫瘤壞死因子(TNF)、淋巴毒素(LT)、其他細胞激活素等的誘導。[Wyllie，A.H.，等，Int.Rev.Cytol.，68，251(1980)；Duvall，E.和Wyllie，A.H.，Immunology Today，7，115-119(1986)；Sellins，K.S.，等，J.Immunol.，139，3199(1987)Yamada，T.，等，Int.J.Radiat.Biol.，53，65(1988)；Wyllie，A.H.，Nature，284.555(980)；Schmid，D.S.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83，1881-1885(1986)；John，C.，等，J.Imunol.，129(4)，1782-1787(1982)；Howell，D.M.，等，J.Immunol.，140，689-692(1988)；Gillian，B.，等，Eur.J.Immunol.，17，689-693(1987)]。
另外，某些抗體也會引發蛋白下垂，例如抗-CD3、抗-APO-I和抗-Fas抗體[Trauth，B.C.，等，Science，245，301-305(1989)Smith，C，A.，等，Nature，337，181-184(1989)；Tadakuma，T.等，Eur.J.Immunol.，20，779(1990)]并且，Nakamura等由惡性腫瘤的自發消退進一步證實了誘導的蛋白下垂[Nakamura，Y.，等，Ri nsho Hifuka(Jpn，J.Clin，Dermatol.)，35(4)，289-295(1981)]。
有報道描述了亞胺環己酮(一種蛋白合成抑制劑)對急性白血病細胞，抗菲霉菌素(actinomycin)D(一種RNA合成抑制劑)對小腸腺細胞和兩者共對HL-60細胞的蛋白下垂的誘導作用[Matin，S.J.，等，J.Immunol.，145，1859-1867(1990)]。
近年來，已用抗-Apo-I抗體的癌癥治療嘗試進行與蛋白下垂有關的治療。在腦脊髓綜合癥(MDS)，(胚細胞成長活化的RAEB和RAEB的轉化(RAEB-t)中)，鬼臼乙叉甙和阿桑比星是蛋白下垂促進劑，能夠抑制胚細胞成長，[Shibuya，T.，J.Clinical andExperimental Medicine，160(5)，319-323(1992)]。
Murakami等報道了約半數以上表達抗紅細胞自體抗體的反基因小白鼠證明是因失去自體耐受力造成的自體免疫病，這是由于普通小白鼠體內產生細胞反應的自體抗體抗原誘導蛋白下垂而引起消除自體抗體細胞能力的缺乏[Murakami，M.等，Nature，357，77-80(1992)]Watanabe-Fukunaga等指出，對于MRL lpr/lpr小白鼠，有關蛋白下垂的Fas分子異常，并且自體反應T細胞的被動選擇(蛋白下垂)機制在胸腺中不能正常起作用。結果產生了自體免疫病[Watanabe-Fukunaga，R.，等，Nature，356，314-317(1992)]。
另一方面，已知在肝臟中，分裂素誘導肝細胞成長而產生增生狀態，該狀態通過肝細胞的衰退和死亡(即蛋白下垂)從而恢復正常[Kerr，J.F.，等，Br.J.Cancer，26，239-257(1972)]。
考慮到在從慢性肝炎轉變為肝硬變，進一步發展成肝癌的過程中，蛋白下垂處于受控狀態下，因此細胞毒性T細胞可誘發肝細胞發炎，然后是纖維變性，引起肝硬變的加重，因此，促進蛋白下垂可以抑制肝炎從而進一步預防肝硬變。
本發明提供了一種蛋白下垂誘導組合物，包含作為活性組分的藥理學有效量的至少一種選自式(1)的化合物及其鹽的物質，和無毒的藥用可接受的載體。
本發明的蛋白下垂誘導組合物具有誘導或促進蛋白下垂的能力，由于具有該能力，它在醫藥領域中是有效的，如上文所述例如可作為抗癌劑，用作自體免疫病和肝病如肝炎和肝硬變的治療劑，腫瘤轉移的抑制劑等等。
表示化合物(1)的式(1)中，低級烷基包括直鏈或支鏈的C1-5的烷基，如甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、叔丁基、戊基、己基等。
在適于用作活性成分的化合物(1)中，具有酸性基團的化合物易于與堿性化合物轉化成藥用可接受的鹽類。這些鹽可與自由化合物一樣用作活性成份。上述的堿性化合物的例子如堿金屬或堿土金屬的氫氧化物，碳酸鹽或氫化物，如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫氧化鈣、碳酸鈉、碳酸鉀、碳酸氫鈉、氫化鈉等。也可用作形成鹽的堿性化合物為有機胺類，如甲胺、乙胺、異丙胺、嗎啉、哌嗪、哌啶、3，4-二甲氧基苯乙胺等。與堿性化合物成鹽的反應可采用常用的方式，例如，上述的公開物中描述的方法。
本發明的活性成份化合物當然也包括立體異構體和光學異構體。
本發明中作為蛋白下垂誘導組合物活性成份的化合物(1)及其鹽以常用藥物制劑的形式來使用。采用常用的填充劑、增量劑、粘合劑、保濕劑、崩解劑、表面活性劑、潤滑劑和作為無毒載體的類似的稀釋劑或賦形劑來制備此類制劑。該藥物制劑可根據治療目的來選擇劑量形式，其典型實例為片劑，丸劑，粉劑，溶液劑，懸浮劑，乳劑，顆粒劑，膠囊劑，栓劑，注射劑(溶液，懸浮液等)，滴眼劑等。
可采用本領域所熟知的各種載體來制造片劑，因此例如可采用賦形劑如乳糖、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、尿素、淀粉、碳酸鈣、高嶺土、結晶纖維素和硅酸，粘合劑如水、乙醇、丙醇、單糖漿、葡萄糖溶液、淀粉溶液，明膠溶液、羧甲基纖維素、紫膠、甲基纖維素、磷酸鉀和聚乙烯吡咯烷酮，崩解劑如干淀粉、藻酸鈉、粉狀瓊脂、粉狀昆布糖、碳酸氫鈉、碳酸鈣、聚氧乙烯脫水山梨醇脂肪酸酯、十二烷基硫酸鈉、硬脂酸單甘油酯、淀粉和乳糖，崩解抑制劑如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂和氫化油，吸收促進劑如季銨堿和十二烷基硫酸鈉，潤濕劑或濕潤劑如甘油和淀粉，吸附劑如淀粉、乳糖、高嶺土、膨潤土和硅膠，潤滑劑如精制滑石粉、硬脂酸鹽、粉狀硼酸和聚乙二醇。如必要，可用常用的包衣材料對片劑包衣，例如糖衣片、明膠衣片、腸溶衣片、薄膜衣片或雙層衣或多層衣片。
可采用本領域所熟知的各種載體來制造丸劑。例如可采用賦形劑如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、硬化植物油、高嶺土和滑石粉，粘合劑如粉狀阿拉伯樹膠、粉狀黃蓍膠、明膠和乙醇，崩解劑如昆布糖和瓊脂。
可采用本領域所熟知的各種載體來制造栓劑。例如，上述的聚乙二醇、可可脂、高級醇、高級醇酯、明膠和半合成甘油酯。
制備注射劑時，優選滅菌的和與血液具有等滲性的溶液或懸浮液，并且在制備如溶液，乳液或懸浮液劑型時，可采用本領域常用的所有稀釋劑。例如可提及的，水、乙醇、丙二醇、乙氧化異硬脂酵、聚氧異硬脂醇和聚氧乙烯脫水山梨醇脂肪酸酯。這樣，該藥物制劑還可含有足量的氯化鈉、葡萄糖或甘油成為等滲性溶液。可加入常用的增溶劑，緩沖劑，減痛劑，等。
另外，如必要，本發明的蛋白下垂誘導組合物可含有著色劑、防腐劑、增香劑、芳香劑、甜味劑等以及其它藥物。
前述的本發明藥物組合物中活性成分化合物的比例并非關鍵，但可在一寬范圍內適當選取。而通常，該比例建議選擇在組合物重量的1-70％的范圍內，優選為1-30％(重量比)。
前述藥物制劑的給藥途徑并非關鍵，但應根據劑型、患者的年齡、性別和其它因素以及所治療的病癥的嚴重程度進行選擇。這樣，例如，給患者的劑型為片劑、丸劑、溶液劑、懸浮劑、乳劑、顆粒劑或膠囊劑，則該制劑以口服給藥。注射溶液為靜脈給藥，可單獨給藥或混有含葡萄糖、氨基酸等的常用非腸道輸注液。如必要，該制劑可經肌內、皮內、皮下或腹膜內途徑給藥。栓劑為直腸給藥。滴眼劑當然應滴入眼睛。
而上述藥物制劑的劑量根據給藥方法，患者的年齡、性別和其它背景因素，病癥的嚴重程度等來進行適當選擇，通常建議每千克體重每天給于約0.1至約1000mg的活性成分，即化合物(1)。每個劑量單元所含的活性成份的量為約1至600mg。
本發明的蛋白下垂誘導組合物可根據其蛋白下垂的誘導或促進活性用于各種疾病，并且預期對治療這些疾病在藥理上有效。這些疾病包括，例如，癌癥，AIDS、ARS(與AIDS有關的綜合癥)，ATL(成熟T細胞性白血病)，毛狀細胞性白血病，脊髓病(HAM/TSP)，呼吸疾病(HAB/HABA)，關節病(HAAP)，眼色素層炎(HAU)，其它與HTLVI有關的疾病，自體免疫病如SLE(系統性紅斑狼瘡)，膠原疾病如類風濕性關節炎(RA)，潰瘍性結腸炎，斯耶格倫綜合癥，初期膽肝硬變，自發性血小板減少性紫瘢(ITP)，自體免疫溶血性貧血，maysthenia grayis，(橋本)淋巴瘤性甲狀腺腫，和胰島素依賴性(1型)糖尿病。本發明的蛋白下垂誘導組合物也可用于各種血小板減少癥的并發疾病，例如脊髓發育不良綜合癥，周期性血小板減少癥，再生障礙性貧血，自發性血小板減少癥，播散性血管內凝血，等。本發明的組合物還可進一步用于各種其它疾病包括各類肝炎(如C、A、B和F類型)，進行性腦變性，阿爾茨海默型早老性癡呆，心肌炎，ARDS(成人呼吸窘迫綜合癥)，傳染癥，肝硬變，前列腺肥大，子宮肌瘤，支氣管哮喘，動脈硬化，各種先天性畸形，腎炎，老年性白內障，慢性疲勞綜合癥和肌營養不良。
本發明的蛋白下垂誘導組合物，例如作為抗癌組合物給藥時，能誘導和促進癌細胞的蛋白下垂從而產生抗癌效果。這樣，如不考慮劑型和/或給藥途徑，本發明的組合物可與一種或多種已知作為癌癥化療劑和/或放射療法的抗癌劑聯合使用。本發明能產生良好抗癌效果的活性成份化合物還能顯著促進其它并用抗癌劑的效果而產生協同作用。因此，在采用較常用劑量小得多的配合抗癌劑劑量時，也能得到滿意的抗癌效果，由此將配合抗癌劑的不良效果減至最小。這里所提到的化療劑例如，5-氟尿嘧啶(5-FUKyowa Hakko Kogyo)，絲裂霉素C(Kyowa Hakko Kogyo)，呋喃氟尿嘧啶(FT-207；Taiho Pharmaceutical)，安道生(Shionogi & Co.)和色霉素A3(Takeda Chemical Industries)。
本發明的蛋白下垂誘導組合物用于治療血小板減少癥時，能抑制患者體內胚細胞的繁殖，例如，MDS中如RAEB或RAEB-t，從而造成成熟細胞的增殖。
本發明的蛋白下垂誘導組合物能夠誘導或促進蛋白下垂，從而對患有藥物誘導性肝炎或病毒性肝炎的患者進行治療，并且能預防肝細胞纖維變性。
附圖的簡要描述附

圖1顯示由藥理試驗實施例1中描述的蛋白下垂誘導效能試驗所獲得的結果。
附圖2表示由藥理試驗實施例1中描述的蛋白下垂誘導效能試驗所獲得的結果。
附圖3表示由藥理試驗實施例1中描述的蛋白下垂誘導效能試驗所獲得的結果。
本發明的最佳實施方式以下給出的制劑實施例說明了本發明的蛋白下垂誘導組合物的制備方法，并且以下也描述了本發明的蛋白下垂誘導組合物的活性成份的藥理試驗結果。
式(A)所表示的化合物 用作活性成份化合物之一(以下稱作“化合物A”)。
制劑實施例1化合物A 150gAvicel(注冊商標，Asahi Chemical Industry Co.，Ltd.) 40g玉米淀粉30g硬脂酸鎂2g羥丙基甲基纖維素10g聚乙二醇60003g蓖麻油 40g甲醇40g將上述的活性成份化合物，Avicel，玉米淀粉和硬脂酸鎂共同混合和研細，并且將所得混合物用糖衣藥丸R10mm的沖壓機直接壓模。將所得片劑用含有羥丙基甲基纖維素，聚乙二醇6000，蓖麻油和甲醇的薄膜衣組合物進行包衣，得到薄膜衣片劑。
制劑實施例23，4，4a，5，8，9，10，10a-八氫-1，4 a-二甲 150.0g基-7-(1-甲基乙基)-5，8-二氧-2-菲羧酸枸櫞酸 1.0g乳糖33.5g磷酸二鈣70.0gPluronic F-68 30.0g十二烷基硫酸鈉 15.0g聚乙烯吡咯烷酮 15.0g聚乙二醇(Carbowax 1500) 4.5g聚乙二醇(Carbowax 6000) 45.0g玉米淀粉30.0g干十二烷基硫酸鈉3.0g干硬脂酸鎂 3.0g乙醇適量將上述的活性成份化合物，枸櫞酸、乳糖、磷酸二鈣、PluronicF-68和十二烷基硫酸鈉混合。通過60號篩網選擇顆粒尺寸，之后該混臺物用含有聚乙烯吡咯烷酮、Carbowax 1500和Carbowax 5000的乙醇溶液進行濕法制粒。如必要，可加乙醇至使粉末成為糊狀團。然后加入玉米淀粉，繼續混合，直至形成均勻顆粒。使該混合物通過10號篩網，攤于盤中并且在烘箱中干燥12至14小時，溫度保持在100℃。干燥顆粒經16號篩網過篩，然后加入干十二烷基硫酸鈉和干硬脂酸鎂，混合后，將該混合物用壓片機壓制成所需的形狀，從而得到片心。
以上片心經涂層處理，加入滑石粉的撒粉以防止吸濕，然后產生包衣內層，反復多次進行涂層包衣足以滿足內服使用。該片再包另一層內包衣和一層拋光包衣。包著色衣至所需顏色。經干燥得到包衣片。
下文所述的為對本發明的活性成份化合物進行的藥理試驗。
藥理試驗實施例1蛋白下垂誘導效能試驗(1)本試驗根據文獻[Nicoletti等，J.Immunological Methods，139，271-279(1991)]中所述的方法進行。
在補充有10％胚胎腓腸血清的RPMI-1640介質中，調節HL-60細胞的濃度為5×104個細胞/毫升。將作為試驗化合物的化合物(A)加到該細胞懸浮體中使其濃度為10μg/ml。將該混合系統放入溫度為37℃的六孔板(Costar)的孔內培養，1、2或3天(試驗組)。作為對照，僅將溶劑加入類似的細胞懸浮體中，并將該混合物以同樣方式培養(對照組)。培養完畢后回收細胞，并將1×108細胞轉入聚乙烯試管中，在200xg下離心5分鐘以得到團塊。
使上述所得的團塊再懸浮于0.25ml的緩沖劑
中。將該試管于4℃置暗處過夜。
第二天，通過血細胞流量計數器(Profile II，Coulter出品)測定單個核的PI螢光。流動速率定在約200細胞核/秒，并且每個樣品分析至少104個細胞核。
直方圖分析排除了螢光強度低的細胞碎片。然后計算出所顯示的含量不少于2N的細胞核與所顯示的含量不多于2N的細胞核之比。認為所顯示的含量不多于2N的細胞核為發生蛋白下垂細胞的細胞核，并且認為所顯示的含量不多于2N的細胞核的比例為斷裂的DNA，并作為蛋白下垂誘導活性的指標。
所得的結果顯示在附圖1中。
在附圖1中，所繪的縱坐標為培養期(天)，所繪的橫坐標為蛋白下垂細胞(％)。黑色柱形表示試驗組，白色柱形表示對照組。
附圖1顯示了本發明的活性成份化合物所產生的蛋白下垂誘導作用和促進作用。
上述試驗中應用的人類早幼粒細胞白血病細胞系(HL-60)是由Robet Gallo等建立的人類白血病細胞系，并且其典型特性在文獻[Gallo，R.C.，等，Blood，54，713(1979)]中有描述。該細胞系在美國類型培養中心(ATCC)保藏，ATCC入藏號為CCL-240號。(2)用從人類Burkitt淋巴組織瘤獲得的Daudi細胞(ATCC CCL-213號)和從人類急性成淋巴細胞白血病獲得的MOLT-4細胞(ATCCCRL-1582號)代替用于試驗(1)的HL-60細胞，以與試驗(1)相同的方式進行試驗。其結果顯示在附圖2和附圖3中，結構與附圖(1)相同。
類似附圖1，附圖2和3顯示了本發明的活性成份化合物所產生的蛋白下垂誘導作用和促進作用。(3)通過MTT方法[J.Immunol.Methods，65，55(1983)]可證實濃度為10μg/ml的本發明的活性成份可抑制上述三類細胞的增殖。
在工業領域中使用的可能性本發明的蛋白下垂誘導組合物具有誘導和促進蛋白下垂的能力，由于具有該能力，它有效地用于醫藥領域中，可作為抗癌劑，自體免疫病和肝病如肝炎和肝硬變的治療劑，腫瘤轉移的抑制劑等。
權利要求
1.一種蛋白下垂誘導組合物，含有作為活性成分的藥理學有效量的至少一種選自下式(1) 其中R為氫原子或低級烷基，所表示的菲衍生物及其鹽的物質，和藥用可接受的無毒的載體。
2.權利要求1的蛋白下垂誘導組合物，它用作治療癌癥的抗癌組合物。
全文摘要
本發明提供了一種蛋白下垂誘導組合物，含有藥理學有效量的作為活性成分的至少一種選自下式(1)其中R為氫原子或低級烷基，所表示的菲衍生物及其鹽的物質，和藥用可接受的無毒的載體。本發明的蛋白下垂誘導組合物具有誘導和促進蛋白下垂的能力，由于具有該能力，它有效地用于醫藥領域中，例如作為抗癌劑，自體免疫病和肝病如肝炎和肝硬變的治療劑，腫瘤轉移的抑制劑等。
文檔編號A61K31/235GK1128949SQ9519047
公開日1996年8月14日 申請日期1995年4月11日 優先權日1994年4月14日
發明者市川弘之, 小野幸久, 桝井美弘, 足立正一 申請人:大制藥株式會社