一種特異性抑制連接蛋白26的全人抗體的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫藥技術領域，具體而言本發明提供特異識別人耳蝸、皮膚組織 表達的連接蛋白26(Connexin26)抗原，并能阻遏該連接蛋白26形成的半通道的單鏈抗體及 表達該抗體的質粒載體，以及所述單鏈抗體在制備用于治療連接蛋白26突變引起的耳聾、 皮膚和腫瘤的藥物和診斷試劑盒中的應用，本發明還提供利用該抗體制備診斷試劑盒，其 包含所述單克隆抗體作為活性成分。
【背景技術】
[0002] 離子通道間隙連接是一種細胞與細胞之間的連接。它連接細胞的胞質，允許小于 1.8KD的較小分子如離子、代謝產物和第二信使等自由通過 [1'2]。在脊椎動物，由連接蛋白 (Connexin)組成的間隙連接通道介導相鄰細胞之間離子、小分子營養物質交換及信號分子 傳播。哺乳動物發育早期已有多種連接蛋白表達，不同連接蛋白組成的間隙連接通道具有 不同通透特征，相鄰細胞利用間隙連接介導的細胞間通訊或者不依賴間隙連接通道的途徑 傳遞發育信號，調節發育過程中的細胞增殖、迀移和分化。連接蛋白是一個廣泛表達于脊椎 動物細胞的蛋白質家族。該家族成員組成的六聚體定位于細胞膜上，形成間隙連接通道或 半通道，介導細胞之間、細胞與細胞外基質之間的物質交換。基因組中編碼連接蛋白蛋白家 族的基因組成連接蛋白基因家族 [3]。
[0003] 目前為止在人類基因組中已發現21種連接蛋白基因，小鼠基因組中發現20種連接 蛋白基因[3]，由間隙連接通道和連接蛋白半通道介導的細胞間通訊對許多細胞功能具有重 要的作用，包括調節細胞生長，分化和發育+ 6]。連接蛋白基因的突變與許多人類疾病相關 聯，包括心血管異常，周圍神經病變，白內障和耳聾。連接蛋白26(Cx26)、連接蛋白30(Cx30) 參與內耳鉀離子循環，并且Cx26和Cx30的缺失引起正在發育中的耳蝸中柯蒂氏器極重度耳 聾并伴隨細胞死亡 [4'7'8]。〇126和〇130由兩個相鄰基因（6邛2和6貝6)表達，〇126、〇130在內 耳與非感應細胞連接形成多胞體，兩種蛋白在內耳共表達D^DNFBl位于染色體13qll_ql2 [1()]。50%的習語前失聰都與DFNB1有關，地中海人甚至高達79%[1<3'11]。〇126和〇130的缺失突 變對耳蝸螺旋器的器官形成產生深遠影響 [12<4]。連接蛋白的點突變會導致連接蛋白形成 的半通道一直處于常開或者常閉狀態，導致失聰和皮膚疾病的發生 [15]。特異識別Cx26并恢 復其功能的抗體有望恢復連接蛋白突變導致的失聰和皮膚疾病。
[0004] 近年來單克隆抗體在疾病的診斷和治療中發揮重要作用，特別是針對表達特異性 抗原的疾病，單克隆抗體與抗原的反應檢測可以作為疾病診斷的〃金〃標準，單克隆抗體作 為藥物也在自身免疫性疾病和抗腫瘤疾病中發揮重要的作用。
[0005] 與其他常見疾病不同的是，連接蛋白突變導致的疾病由于發病率相對較低，治療 藥物相對較少，另外在耳聾疾病中，由于抗體藥物的給藥方式存在困難，一直沒有針對該靶 點的抗體藥物上市。用于臨床診斷的試劑盒也沒有，所以能夠識別、結合連接蛋白的單鏈抗 體將成為診治結直腸癌的重要工具。
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【發明內容】

[0022] 本發明的目的是提供一種單鏈抗體，所述單鏈抗體可與人源連接蛋白26抗原特異 性結合，從而可以用于制備治療連接蛋白26突變導致的疾病藥物或連接蛋白26相關診斷試 劑盒。
[0023] 為了達到上述目的，本發明提供了一種特異性抑制連接蛋白26的全人抗體，其特 征在于，其為重組免疫球蛋白，結構為scFv-Fc，scFv指的是單鏈抗體，包括重鏈可變區和輕 鏈可變區，其重鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID N0:1，其輕鏈可變區的氨基酸序列為SEQ ID NO:2，Fc指的是恒定區。
[0024] 優選地，所述的恒定區包括CH2恒定區和CH3恒定區。
[0025] 優選地，所述的特異性抑制連接蛋白26的全人抗體特異識別連接蛋白26的胞外區 第41-75氨基酸部分。
[0026] 本發明還提供了一種基因工程抗體，其特征在于，其與上述的特異性抑制連接蛋 白26的全人抗體的單鏈抗體具有30 %以上的同源序列。
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