卡巴他賽免疫原、特異性抗體和檢測試劑及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物檢測領域，涉及卡巴他賽免疫原、特異性抗體和檢測試劑及其制 備方法。
【背景技術】
[0002] 卡巴他賽(Cabazitaxel)結構式如式（ΙΠ )所示：
[0004] 卡巴他賽，別名：70，1〇少二甲氧基多西紫杉醇，化學名：（2€[，50，70，100，13€0-4-乙酰氧基 _ 13-[[(2R，3S)-3_[(叔丁氧幾基)氨基]_2_羥基_3_苯丙酰基]氧基]-1 -羥基-7， 10-二甲氧基-9-氧代紫杉-5,20-環氧基-11-烯-2-苯甲酸酯，是一種化學半合成紫杉烷類 小分子抗腫瘤藥物，通過從紅豆杉中萃取的前體化合物半合成而來。卡巴他賽是多西紫杉 醇的二甲氧基衍生物，通過對后者兩個羥基的甲氧基化，消除了其對多藥耐藥基因 MDRl編 碼的P-糖蛋白（P-gp)的親和力，而該蛋白介導的多藥耐藥被認為是腫瘤細胞抵抗傳統紫杉 烷類化療藥物的經典機制。作為一種微管抑制劑，卡巴他賽通過與微管蛋白結合，在促進微 管二聚體裝配成微管的同時阻止微管的去多聚化過程，從而抑制微管分解，增加微管的穩 定性，進而抑制腫瘤細胞的有絲分裂，將腫瘤細胞阻滯于G2/M期，并促進其凋亡，最終抑制 腫瘤組織的增殖。臨床上本品通常與潑尼松聯用，用于晚期轉移性前列腺癌患者的化療。卡 巴他賽的血藥濃度與治療效果之間有著密切關系，低于有效血藥濃度達不到治療效果，高 于有效血藥濃度會導致嚴重的毒副作用。因此，快速、準確、高通量、低成本的測定卡巴他賽 在腫瘤患者體內的血藥濃度，對于降低毒副作用和提高患者生存率都具有重要意義。
[0005]目前，國內外監測卡巴他賽血藥濃度的主要方法是酶聯免疫吸附法(ELISA)、高效 液相色譜法(HPLC)、反相高效液相色譜法(RP-HPLC)、液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)等 傳統方法，但這些方法都不能滿足高通量與低成本的臨床需求。目前市場上缺乏穩定性好、 靈敏度高、特異性強的卡巴他賽檢測試劑，尤其是質量好的自動化檢驗試劑，因此，研發生 產質量達到臨床要求、實用性強、性價比高，可應用于全自動生化分析儀的卡巴他賽測定試 劑已成為國內外體外診斷試劑行業的熱點。

【發明內容】

[0006] 本發明為了克服現有技術存在的缺陷，采用卡巴他賽衍生物制備免疫原性強的卡 巴他賽免疫原及其抗體，并提供了一種操作簡便、靈敏度高、特異性強的檢測試劑。應用均 相酶免疫檢測技術實現在全自動生化分析儀上對卡巴他賽的測定，可以高通量、快速化、精 確地確定樣品中的卡巴他賽含量，且具有操作簡便、靈敏度高、特異性強、結果準確等優點， 有效降低卡巴他賽檢測成本，有利于臨床的個體化治療，適合臨床廣泛推廣使用。
[0007] 本發明的一個目的在于提供一種卡巴他賽衍生物的合成方法。
[0008] 本發明的另一個目的在于提供一種免疫原性強的卡巴他賽免疫原。
[0009] 本發明的另一個目的在于提供一種卡巴他賽免疫原的制備方法。
[0010] 本發明的另一個目的在于提供使用本發明卡巴他賽免疫原制備得到的特異性強 的抗卡巴他賽特異性抗體。
[0011] 本發明的又一個目的在于提供一種卡巴他賽檢測試劑。
[0012] 本發明的再一個目的是提供卡巴他賽檢測試劑的制備方法。
[0013] 免疫原性與所合成的卡巴他賽衍生物分子結構及所選載體種類有關，現有技術中 卡巴他賽免疫原的免疫原性較弱，所得到抗體的特異性、與卡巴他賽的結合力，敏感度都不 如本發明。本發明的卡巴他賽免疫原，免疫原性高，可以誘導得到高效價的抗卡巴他賽特異 性抗體。該抗體特異性高，與卡巴他賽的結合力強。由該抗體制備得到的卡巴他賽檢測試 劑，可以快速、準確地確定樣品中的卡巴他賽含量。
[0014] 本發明所采取的技術方案如下：
[0015] -種卡巴他賽免疫原，其結構式如式⑴所示：
[0017] 式中，R為連接基團-CO-(CH2)n-⑶0-，n是1至20之間的整數。優選R為-CO-(CH 2)2-COO-〇
[0018]載體為具有免疫原性的蛋白質或多肽，優選為血清蛋白、血藍蛋白和甲狀腺球蛋 白。更優選為牛血清白蛋白。
[0019] 卡巴他賽免疫原的合成途徑和方法如下：
[0020] 1.卡巴他賽衍生物的制備方法：
[0021 ] -種卡巴他賽衍生物，其結構式如式（Π )所示：
[0023] 式中，R為連接基團-CO-(CH2)n-COO-, η是1至20之間的整數。
[0024]上述卡巴他賽衍生物的合成路線及制備步驟如下：
[0026] (I)稱取0.5~2 . Og卡巴他賽、1.0~4. Og化合物A加入反應體系中，然后用10~ 40ml吡啶或者干燥的苯在連續回流的玻璃燒瓶中進行孵育。
[0027] (2)將此反應混合物在70 - 80°C的回流溫度下持續加熱3~12小時，然后將反應混 合物緩慢冷卻至室溫(可在室溫條件下讓其自行冷卻），輕輕倒去混合物上層的多余的吡啶 或苯。
[0028] (3)將剩余的有機成分在負壓條件下持續通入氮氣流使其蒸發干燥，得到的干燥 殘留產物即為卡巴他賽衍生物。剩余的有機成分指的是反應混合物去除吡啶或苯之后的成 分。
[0029] (4)將上述得到的產物用蒸餾水配制的60%乙醇沖洗5~20次以上，以獲得卡巴他 賽半琥珀酸脂(卡巴他賽衍生物)的重結晶。60 %指的是體積份數，即乙醇體積為60份，蒸餾 水體積為40份。
[0030] (5)通過薄層色譜法(TLC)這一標準分析方法對最終產物的產率進行定量分析，最 終合成得到的卡巴他賽半琥珀酸酯殘留物通過TLC實驗顯示其相對迀移系數(Rf)大約為 0.1-0.15，然而作為對照的卡巴他賽顯示出更大的Rf值，大約為0.3-0.4。在標準合成反應 中，終產物卡巴他賽衍生物的平均產率大約為97%。以上步驟（1)-(5)方法簡便，得到的卡 巴他賽衍生物純度高。
[0031]本發明中，卡巴他賽衍生物的制備過程的步驟(1)中的化合物A選用了丁二酸酐為 合成原料，故所得的最終產物卡巴他賽衍生物的鏈接基團R為-CO - (CH2) 2 - COO -。當η取其他 值時，選用其他含有3-22個碳原子的烷二酸或相應的酸酐進行實驗時，合成方法完全一致。 其中選用丁二酸酐時，η取值為2，碳原子個數為4個。
[0032] 2.卡巴他賽免疫原的合成：
[0033] (1)將載體蛋白100~30011^溶解于25~7511110.214!18.5的磷酸緩沖液中 ；
[0034] (2)將如下化學品加入到小燒杯中攪拌溶解：100~300mg本發明合成的卡巴他賽 衍生物、1.5~6ml二甲基甲酰胺、1.5~6ml乙醇、3.5~10.Oml 10mM，pH 5.0的磷酸鉀緩沖 液、100~300mg 1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亞胺、25~75mg N-羥基硫代琥珀酰亞胺， 將這些化學品在室溫下攪拌溶解反應20~60min;
[0035] (3)將溶解好的溶液滴加至載體蛋白溶液中，并在2~8°C下攪拌過夜，得到抗原； 將合成好的抗原經過透析進行純化，得到卡巴他賽免疫原。
[0036]本發明中當η取1~20范圍內的其他整數時，用上述方法可以制備出如式（I)所示 的卡巴他賽免疫原。載體仍為具有免疫原性的蛋白質，可以是血清蛋白，血藍蛋白和甲狀腺 球蛋白。優選的，載體為血清蛋白。更優選的，載體為牛血清白蛋白。
[0037]本發明中提供的連接基團R為-CO-(CH2)n-C00-，免疫原性強弱與所合成的卡巴他 賽衍生物分子結構，連接基團的結構及所選載體種類有關，本發明連接基團的選取也具有 增加免疫原性的作用，但是η取1至20之間的任意整數時，使用不同η值的卡巴他賽衍生物制 備的卡巴他賽免疫原均具備強免疫原性，都能制備高效價的特異性抗體。
[0038]本發明的抗卡巴他賽特異性抗體，由上述的卡巴他賽免疫原免疫實驗動物后產生 得到，制備的具體步驟如下：
[0039] (1)用PBS將上述合成的卡巴他賽免疫原稀釋至1.0mg/ml，得到抗原溶液，然后用 0.5~2. Oml抗原溶液與弗氏完全佐劑混合，對實驗動物進行注射。
[0040] (2)2~3周后，再用0.5~2.Oml相同的抗原溶液與弗氏不完全佐劑對上述實驗動 物注射一次，之后每隔四周注射一次，共計注射3~6次。
[0041 ] (3)對上述實驗動物取血，分離純化得到效價為1:30000~1:50000的抗卡巴他賽 特異性抗體。
[0042]本發明的抗卡巴他賽特異性抗體為完整的抗體分子，也包括保留與卡巴他賽特異 性結合能力的抗體片段或抗體衍生物。本發明的抗體是多克隆抗體也可以是單克隆抗體， 優選為多克隆抗體。
[0043]本發明的抗體為采用單一的卡巴他賽免疫原對動物加強免疫所獲得的多克隆抗 體，或者為免疫后經體細胞雜交獲得的單克隆抗體;所述的實驗動物為兔、山羊、小鼠、綿 羊、豚鼠或馬的一種，優選為兔。
[0044] 本發明提供一種卡巴他賽檢測試劑，含有上述抗卡巴他賽特異性抗體和指示試 劑。
[0045] 本發明指示試劑選自酶試劑、放射性同位素試劑、熒光試劑、發光試劑。優選的，指 示試劑為酶試劑，由卡巴他賽酶標偶聯物和酶底物所組成。
[0046]上述酶標偶聯物為葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原酶標偶聯物;上述酶底物為葡萄 糖-6 -磷酸。所述半抗原為卡巴他賽衍生物。
[0047]卡巴他賽均相酶免疫檢測試劑在使用之前，為了避免指示試劑中的酶標偶聯物和 酶的底物發生反應，酶標偶聯物和酶的底物是不混合的且分開放置，所以將酶的底物與上 述抗卡巴他賽特異性抗體混合在一起。因此，卡巴他賽均相酶免疫檢測試劑包括兩類試劑： [0048] (1)試劑A由抗卡巴他賽特異性抗體和均相酶底物混合而成，具體制備步驟如下：
[0049] 1)將2.0~6. Og氧化態的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)、1.0~3 . Og葡萄糖-6-磷 酸(G-6-P)用0.5~2L 55mM、pH=8.0的Tris緩沖液