一種唇癌特異性檢測的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種特異性檢測唇癌的試劑盒。本發明提供的核酸適體，與人富含半脫氨酸分泌蛋白1具有較好的親和能力。利用本發明的核酸適體，可以捕獲唾液中的富含半脫氨酸分泌蛋白1蛋白，通過其含量的變化來檢測唇癌，將其制備成為相應的試劑盒，將用于唇癌的篩查。利用本發明的試劑盒，具有高靈敏、成本低的好處。
【專利說明】
一種唇癌特異性檢測的試劑盒
技術領域
[0001] 本發明涉及一種用于檢測唇癌的試劑盒及其檢測方法。
【背景技術】
[0002] 唇癌是指發生于上下口唇的惡性腫瘤為口腔常見惡性腫瘤之一，在口腔癌中占第 立位，占全身惡性腫瘤的0.1 %~0.5%，占口腔惡性腫瘤的7.1 %~15.0%，歐美國家唇癌 患者較多，占口腔癌的20%~30%。一般下唇比上唇易受累，約90%~95%發生在下唇紅緣 部，而且W下唇的外1/3處為多見。男性患者居多，男女之比為7:1。高發年齡為50~70歲。唇 癌絕大多數為高分化之鱗狀細胞癌，多在良性費生物的病變基礎上發生，其生長速度較慢， 預后較好，一般5年生存率為70%W上，本病的病因可能與局部長期受異物刺激，強烈的紫外 線照射有關。口唇上皮角化、白斑、巧費、肉芽腫及裂口等長期不愈，亦可導致癌變。
[0003] 現有技術已知，唾液富含半脫氨酸分泌蛋白1濃度為10-40ng即可診斷為唇癌。因 此，檢測半脫氨酸分泌蛋白1的濃度變得極為重要。
[0004] 核酸適體(Aptamer,又稱適配體，適配子)是能高親和性、高特異性的結合某種生 物革E1標的單鏈寡核酸分子(ssDNA或ssRNA)。核酸適體是通過指數富集配體系統進化技術 (Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment，SELEX)從人工合成的 DNA/RNA文庫中篩選得到的能夠高度特異性結合靶標分子的單鏈DNA/RNA。已報道核酸適體 的靶標包括金屬離子、有機小分子、多肽、蛋白質、細胞甚至組織等。核酸適體的分子識別功 能與抗體類似，具有與抗體分子相當甚至更強的靶標識別能力，但與抗體相比具有很多優 良的特性，如分子量小，能批量生產，不易失活，無免疫原性、容易合成與標記、快速的穿透 組織、良好的代謝動力學、不同批次之間產品不會存在差異和具有很好化學穩定性，在生物 檢測、疾病診斷治療等領域具有重要的應用前景。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的是提供一種特異結合CRISP1的核酸適體及其試劑盒。
[0006] 本發明提供的核酸適體，是序列表的序列1-15所示的單鏈DNA。
[0007] 所述核酸適體與CRISP1蛋白具有較好的親和能力。
[0008] 還可將所述核酸適體進行修飾或改造，得到所述核酸適體的衍生物。
[0009] 所述核酸適體的衍生物可為如下任意一種：
[0010] a)將所述核酸適體刪除部分或增加部分互補的核苷酸，得到的與所述核酸適體具 有相同功能的核酸適體的衍生物；
[0011] b)將所述核酸適體進行核苷酸取代或部分修飾，得到的與所述核酸適體具有相同 功能的核酸適體的衍生物；
[0012] c)將所述核酸適體的骨架改造為硫代磷酸酯骨架，得到的與所述核酸適體具有相 同功能的核酸適體的衍生物；
[0013] d)將核酸適體改造為肽核酸，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的 衍生物；
[0014] e)將所述核酸適體連接上熒光、放射性和治療性物質后，得到的與所述核酸適體 具有相同功能的核酸適體的衍生物。
[0015] 所述核酸適體可用于制備檢測CRISP1的試劑盒。
[0016] 利用本發明的核酸適體，可以捕獲中唾液中的中的CRISP1，從而用于相關口腔癌 篩查。利用本發明的核酸適體，具有高靈敏、成本低、易制備、易保存的優點。本發明具有很 高的應用價值。
【具體實施方式】
[0017] 以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。
[0018] 實施例1、CRISP1蛋白的獲得
[0019] 將Genbank:EAX04350所示的CRISP1基因通過本領域常規的真核表達方式進行表 達，獲得了相應的目的多肽蛋白。
[0020]實施例2核酸適體的篩選和制備
[0021]設計兩端包含大約20個核苷酸、中間包括41個核苷酸的隨機核酸文庫如下：
[0022] 5 '-TGGCACCTACGATCTAAGGCA(N41 )GGACTACCAATGCAACGTCAC-3 ' ；N41 代表41 個隨機 核苷酸。
[0023] 將單鏈DNA文庫擴增為雙鏈DNA，產物經2%瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收純化；以回 收的雙鏈DNA為模板，體外轉錄出單鏈RNA隨機文庫，轉錄產物經PAGE純化。75yg RNA文庫經 硝酸纖維素膜反篩去除與膜結合的RNA分子，然后與2ug CRISP1蛋白，37°C孵育30min，反應 液經硝酸纖維素膜濾過，洗滌濾膜；然后將濾膜剪碎，置于洗脫緩沖液（6mol/L尿素， 0.55mol/L醋酸銨，1.5mmol/L EDTA，0.15%SDS)中煮沸5min，離心，取上清，無水乙醇沉淀 RNA，并重新溶解于20ylDEPC水中；以RNA為模板RT-PCR擴增雙鏈DNA，體外轉錄出RNA文庫用 于下一輪篩選;每輪篩選過程中RT-PCR得到雙鏈DNA文庫，以該雙鏈DNA為模板體外轉錄出 RNA適配子庫，篩選共進行12輪。得到了 15個適配子，其序列分別為SEQ ID N0:1-15所示。具 體序列如下所示：

[0054] 實施例3蛋白結合適配子的性能測定
[0055] 將適配子分別取2.0yg，用牛小腸堿性磷酸酶(CIP)37°C消化lh，純化回收去磷酸 化的RNA;通過T4多核苷酸激酶標記[γ -32P]ATP于去磷酸化的RNA分子末端。lOnmol放射性 標記的適配子分別與不同濃度（1-200ηΜ)的CRISP137°C孵育30min，各組反應液經硝酸纖維 素膜濾過，洗滌濾膜，干燥濾膜，液閃計數儀測定濾膜上殘留的放射量，同一樣品平行做兩 次測定。計算各個適配子與目的蛋白的解離常數。結果如下：
[0057] 實施例4所述適配子特異性分析以及穩定性分析
[0058] 分別采用人血白蛋白，免疫血清球蛋白，霍亂弧菌VgrG3C蛋白，大腸桿菌外膜蛋白 A，⑶CH蛋白，CRISP1蛋白，與15條適配子進行特異性檢測，經過結合試驗發現，這些適配子 都不與這些蛋白相結合，而只與CRISP1蛋白結合保持較高的特異性。
[0059] 將所述的適配子，取0.2ug，分別置于常溫的血清、水溶液中，放置二周。通過RT-PCR檢測，發現三周的放置其結構穩定，沒有被降解。
[0060]實施例5所述適配子疾病的診斷
[0061]取9個唇癌患者和3個正常人的唾液分泌物，使用生理鹽水稀釋，獲得目標樣本。 [0062] 將15個偶聯有標記的適配子分別與9個患者以及3個正常人的分泌物混合30min， 通過生物素分離，定量分析其中的CRISP1蛋白的含量，通過分析發現，9個口腔癌患者中 CRISP1蛋白的含量顯著增加，超過了規定的閾值。達到了唇癌的診斷標準。由此可見，其診 斷效果較好。
[0063]以上僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，對于本領域的技術人 員來說，凡在本發明的精神和原則之內所做的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本 發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種用于唇癌檢測的試劑盒，其含有能特異性與CRISP1蛋白特異性結合的核酸適 體。2. 如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于:所述核酸適體的序列如SEQ ID No: 2所述。3. -種檢測唇癌的方法，其特征在于利用權利要求1-2任一項所述的試劑盒。
【文檔編號】C12N15/115GK106018810SQ201610624011
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2015年11月15日
【發明人】陳博
【申請人】陳博