使用元素分析的多重酶測定的制作方法
【專利摘要】本發明總體上涉及用于使用元素分析來檢測酶的方法。
【專利說明】使用元素分析的多重酶測定
[0001 ] 領域
[0002]本發明總體上設及用于使用元素分析來檢測酶的方法。
[000；3]背景
[0004] 由于酶的測定和藥理學調節在保持動物內穩態(an ima 1 homeo S tas i S)方面的作 用，酶的測定和藥理學調節已經變成在鑒定可能的治療劑方面關鍵的要素。蛋白酶是近來 已經被示出在信號通路方面起至關重要作用的蛋白降解酶的子類(subclass),信號通路的 調節異常可W導致癌癥、屯、血管病、W及神經系統異常。在約400種已知的人類蛋白酶中，約 14%作為可能的藥物候選物正在被研究。蛋白酶的小分子抑制劑現在被認為是用于治療退 化性疾病(degenerative disease)、用于治療癌癥W及作為抗菌劑、抗病毒劑和抗真菌劑 的有價值的治療性先導物(therapeutic lead)。
[0005] 對允許同時測量多個酶反應的耐用的、靈敏的、W及定量的酶測定有需求。運樣的 測定可W允許保存有價值的生物樣品和試劑，實現高通量化i gh-throughput)和減少的測 定時間，W及降低酶分析的總成本。
[0006] 概述
[0007]本發明的一方面是用于檢測生物流體中的蛋白酶活性的方法。該方法包括將編碼 的珠附接至膚底物的第一氨基酸W形成固定化的膚底物，該膚底物包含第一氨基酸和末尾 氨基酸（last amino acid)并且是用于蛋白酶的底物;將元素標簽附接至膚底物的末尾氨 基酸W形成帶標簽的膚底物；用生物流體解育固定化的、帶標簽的膚底物；W及通過元素分 析檢測生物流體中的元素標簽和編碼的珠。
[000引本發明的另一方面是用于檢測生物流體中的蛋白酶活性的方法。該方法包括將編 碼的固定化部分附接至至少五種不同的膚底物的第一氨基酸W形成至少五種不同的編碼 的固定化的膚底物，該膚底物是用于不同的蛋白酶的底物;將不同的元素標簽附接至至少 五種不同的膚底物中的每種的末尾氨基酸W形成帶標簽的膚底物；用生物流體解育固定化 的、帶標簽的膚底物；W及通過質譜細胞計量術(mass cytometry)檢測生物流體中的元素 標簽和編碼的固定化部分。
[0009]其他目的和特征將在下文中部分地是明顯的且部分地被指出。
[0010] 詳述
[0011] 據已經發現，元素分析，特別地質譜細胞計量術，可W被用W使能夠迅速、定量測 量酶反應，包括在單個測定中檢測且定量多個酶反應。當W多重模式（multiplexed format)進行該測定時，多種酶的活性可W被確定。多種酶底物可W在允許通過對應的酶將 底物加工成產物，使得每種酶產生不同的產物的條件下與全部細胞裂解物組合。每種產物 的量被確定并且此量是對應的酶活性的指示。
[0012] 在某些實施方案中，每種不同的酶底物被用不同的可檢測的標記物標記W有助于 定量相應的產物。雖然任何合適的可檢測的標記物都可W被用于此目的，但是帶元素標簽 的底物特別地適于多重反應(multiplex reaction)。
[0013] 混合物可W通過候選效應物（candidate effector)(即，酶活性的抑制劑或激活 劑)來加強。效應物在本文中更詳細地被描述。
[0014] 所公開的測定法有若干優點。主要優點包括W下：該測定提供在一個反應中對多 種酶的測量;該測定不使用抗體或放射性同位素;該測定對光是不敏感的;在該測定中使用 的試劑具有非常長的膽存期（shelf life);該測定不需要純化步驟;該測定經得起小型化 和自動化的檢驗；W及該測定可W實時地進行用于動力學研究。
[0015] 由于運些和其他優點，該測定實現提供可W被用W開發能夠同時地篩選許多抑制 劑的酶抑制劑篩選法的定量結果的高通量、多用性、W及靈敏度。
[0016] 本公開內容提供的方法的另一種應用在于產生用于酶活性的高通量篩選的底物 懸浮陣列（substrate suspension array)。
[0017] 用于特定的酶的底物可W用元素編碼的珠和酶裂解的位點的遠端的元素標簽來 加標簽并且與對不同的底物特異性地起作用的酶的混合物接觸，并且珠可W W細胞計數的 方式kytometriC fashion)(質譜細胞計量術)相繼地被詢問。例如，測試酶可W裂解底物， 使得元素標簽被釋放到溶液中。應理解，在測試樣品中存在的酶將裂解在樣品中的帶標簽 的底物的至少一部分。進行酶反應持續較長的時間、調整pH、調整溫度、和/或增加酶濃度可 W導致帶標簽的底物的完全的或最優的裂解。元素標簽與編碼的珠的存在或不存在提供酶 裂解底物的測量，顆粒中的元素標簽和編碼的珠的存在指示底物不被酶裂解并且僅編碼的 珠的存在指示底物被酶裂解。
[0018] 在某些實施方案中，酶底物可W被附接至金屬馨合物或具有金屬馨合物的聚合 物。合適的金屬馨合物的非限制性實例包括二乙締S胺五乙酸鹽(DTPA)配體或1，4，7，10-四氮雜環十二燒-1，4,7，10-四乙酸(DOTA)配體。更通常地，本領域技術人員可W理解，具有 結合金屬離子和原子的特定的方式的任何合適的馨合物可W被使用。
[0019] 通常，膚的自動合成可W被本領域普通技術人員常規地進行。例如，酶底物可W在 膚合成儀中的固體珠上直接地被合成(一珠一化合物的庫合成法(one-bead one-compound I化ra巧synthesiS))。固體珠可W包含TENTAGEL?，TENTAGEL?是包含聚（乙二醇）（陽G)接 枝物的二乙締基苯交聯的聚苯乙締樹脂并且被用于固相膚合成(SPPS)。此聚合物家族的其 他成員包括ARG0GEL?、N0VAGEL?、W及N0VASYN TG?。用于膚的自動合成的其他合適的材料 通常對本領域技術人員是已知的。
[0020] 此方法可W被用于在一個管中實時地靈敏地定量測量多種酶反應W及產生用于 酶底物鑒定和優化的底物懸浮陣列庫。為了此目的，用不同的元素或多個比率的若干元素 編碼的珠可W被共價地附接至特定的底物，該特定的底物W-個珠類型代表一種底物運樣 的方式用在珠中不存在的元素加標簽。因為可W被使用的元素和其穩定的同位素的數目大 于50并且每種類型的珠可W被唯一的金屬組合編碼，所W被連接至唯一編碼的珠的不同的 特定的探針的數目可W是非常大的(超過IO 6個不同編碼的珠是可行的）。
[0021] 通常，本文描述的過程和方法包括至少四個步驟。在一個步驟中，膚底物的第一氨 基酸被附接至帶元素標簽的支持體，從而形成固定化的膚底物。在另一步驟中，元素標簽被 附接至固定化的膚底物的末尾氨基酸，從而形成帶標簽的、固定化的膚底物。在另外的步驟 中，帶標簽的、固定化的膚底物用生物介質解育。并且在另外的步驟中，元素分析被用W檢 測生物介質中的元素標簽和/或帶元素標簽的支持體的存在。
[0022] 在分析方法的初始步驟中，膚底物的第一氨基酸被附接至帶元素標簽的支持體， 從而形成固定化的膚底物。
[0023] 通常，使用對本領域技術人員已知的任何合適的附接法，膚底物可W被附接至帶 元素標簽的支持體。
[0024] 典型地，膚底物的第一氨基酸被共價地結合至帶元素標簽的支持體。例如，帶元素 標簽的支持體的表面可W用反應性化學基團來官能化。反應性化學基團的非限制性實例包 括簇酸醋基、氨基、硫醇基、環氧基、醒基、徑基、琉基、W及酷阱基。自由基和/或自由基陽離 子可W被用W引發偶合反應。
[0025] 例如，帶元素標簽的支持體可W具有已經被化咯-2,5-二酬(馬來酷亞氨基）、橫酸 陰離子、或對(氯甲基)苯乙締官能化的表面。
[0026] 膚底物還可W使用非共價偶合法來固定化。例如，膚底物可W被物理地吸附至帶 元素標簽的支持體上。
[0027] 具體地，膚底物可W使用生物素-鏈霉親和素復合物被固定在帶元素標簽的支持 體上。例如，生物素可W被連接至膚底物的第一氨基酸并且鏈霉親和素可W被連接至帶元 素標簽的支持體，或反之亦然。
[0028] 在分析法的另一步驟中，元素標簽被附接至固定化的膚底物的末尾氨基酸，從而 形成帶標簽的、固定化的膚底物。
[0029] 通常，使用對本領域技術人員已知的任何合適的附接法，元素標簽可W被附接至 固定化的膚底物。
[0030] 例如，元素標簽可W被共價地結合至固定化的膚底物的末尾氨基酸。為了有助于 共價結合，元素標簽可W包含一個或更多個反應性化學基團。反應性化學基團的非限制性 實例包括簇酸醋基、氨基、硫醇基、環氧基、醒基、徑基、琉基、W及酷阱基。自由基和/或自由 基陽離子可W被用W引發偶合反應。
[0031] 可選擇地，元素標簽可W使用非共價偶合法被附接至固定化的膚底物。例如，元素 標簽可W使用生物素-鏈霉親和素復合物被附接至底物。例如，生物素可W被連接至固定化 的膚底物的末尾氨基酸并且鏈霉親和素可W被連接至元素標簽，或反之亦然。
[0032] 上文描述的加標簽和固定化步驟可W W任何順序被進行，從而形成帶標簽的、固 定化的膚底物。
[0033] 在分析法的另外的步驟中，帶標簽的、固定化的膚底物用生物介質解育。
[0034] 如本文所使用，術語"生物介質"寬泛地指的是包含、被認為包含、或可W包含酶、 酶激活劑、和/或酶抑制劑的任何材料。例如，生物介質可W包括從動物源、植物源、真菌源、 細菌源、或病毒源的組織、流體、W及細胞獲得的樣品。可W被包括在生物介質中的樣品的 非限制性實例包括疲、血漿、尿、腹膜液、胸膜液、奶、唾液、滑液、羊水、W及來自血細胞、組 織W及細針活檢(fine needle biopsy)的提取物。
[0035] 可W被包括在生物介質中的樣品的另外的非限制性實例包括均質化的模型病毒 (homogenized model virus)和動物細胞、植物細胞、細菌細胞、W及真菌細胞的細胞培養 物，其中基因表達狀態可W被操縱W探索基因之間的關系并且表達報告分子(例如，e-半乳 糖巧酶）。
[0036] 生物介質還可W包括被純化的生物分子的溶液，包括例如蛋白質、膚、DNA、RNA、多 糖、W及脂類的溶液。運些生物分子可W是天然的或重組的。
[0037] 帶標簽的、固定化的膚底物可W用生物介質解育持續足W允許在生物介質中的酶 與帶標簽的、固定化的膚底物的至少一部分反應的時間段。
[0038] 例如，如果生物介質包含對膚底物是特異性的蛋白酶，則蛋白酶可W在帶標簽的、 固定化的膚底物上進行蛋白水解。蛋白水解反應將帶標簽的、固定化的膚底物裂解成第一 部分(包含附接至帶元素標簽的支持體的第一氨基酸)和第二部分(包含附接至元素標簽的 末尾氨基酸）。
[0039] 如果期望，更完全的反應可W通過增加解育的持續時間、調整生物介質的pH、調整 生物介質的溫度、和/或增加酶濃度來獲得。生物介質的最優的pH和溫度將取決于特定的 酶，所述特定的酶如本領域技術人員所理解的是活性的。
[0040] "微米顆粒、微米球、微米珠、納米珠、納米顆粒、珠、或顆粒"可交換地被使用并且 可W表示各種尺寸和形狀的顆粒并且為了本發明的目的，具有相似的功能 (functionality)。
[0041 ]"元素污染的顆粒（element stained pa;rticle)(或特別地吸收銅系元素的顆 粒r包含被用W標記微米球的多種元素（同位素）。污染元素（S化in e 1 ement)均勻地擴散 在整個所述微米球的主體中，或W導致W有區別的方式形成元素的體積分布的方式滲透所 述微米球。運些乳膠微米球可W由聚苯乙締、聚甲基丙締酸甲醋、丙締臘等等形成。顆粒的 表面可W用簇基衍生物、氨基衍生物、徑基衍生物、琉基衍生物、酷阱衍生物或類似物被化 學地官能化。微米球的平均尺寸可W在直徑0.3微米至10微米之間的范圍。合適的顆粒，例 如在美國申請公布號2010/0144056中被描述，該申請通過引用W其整體并入。
[0042] 在解育步驟之后，固定化的膚底物可W任選地從生物介質中分離。
[0043] 通常，固定化的膚底物可W使用本領域已知的色譜法、離屯、法、過濾法、或透析法 從生物介質中分離。例如，AMICON " ULTRA-0.5離屯、過濾器裝置可W被用于從被裂解的 底物中分離小的納米珠(0.3-1.0微米）。在此情況下，膚底物的帶元素標簽的被裂解的部分 可W從在底部的自旋過濾器的溢流道(floW-t虹OUgh)被收集，同時固定化的被裂解的底物 可W被保持在上部室中。顆粒的多重洗涂可W使用運些裝置進行。具有較大尺寸（1-10微 米)的固定化的膚底物的微米顆粒可W經受在l〇,〇〇〇G下離屯、持續10分鐘W實現顆粒的完 全沉降。在形成小球的微米顆粒的頂部的液體將包含帶元素標簽的膚底物的被裂解的部 分。
[0044] 當固定化的膚底物從生物介質中分離時，生物介質的剩余組分被稱為"分析物溶 液(analyte solution)"。分析物溶液的組分(例如，元素標簽)可W被檢測，例如使用元素 分析。
[0045] 在分析法的另外的步驟中，元素分析被用W檢測在生物介質中的元素標簽的存 在。
[0046] 通常，元素分析指的是其中樣品被分析其元素組成和任選地其同位素組成的過 程。元素分析法的非限制性實例包括探測原子的外層電子結構的光學原子光譜法，例如火 焰原子吸收法、石墨爐原子吸收法、W及電感禪合等離子體原子發射法;探測原子的質量的 質譜原子光譜法，例如電感禪合質譜法；W及探測原子的內層電子結構的X射線巧光法、顆 粒誘導X射線發射法、X射線光電子光譜法、W及俄歇電子光譜法（Auger electron spectroscopy)。
[0047] 如本文所使用，術語"體積元素分析(volume elemental analysis)"指的是其中 被分析的樣品W檢測關于該樣品的全部體積的平均原子組成的方式被詢問的過程。
[0048] 如本文所使用，術語"顆粒元素分析"指的是其中包含分散在液體中的固體顆粒的 被分析的樣品W使得原子組成對于單獨的顆粒被記錄的方式被詢問的過程。顆粒元素分析 的實例是質譜細胞計量術，其中分析儀器是基于質譜儀的流式細胞儀。
[0049] 元素分析可W被用W檢測元素標簽和/或帶元素標簽的支持體。例如，在帶元素標 簽的支持體是編碼的珠的情況下，元素分析可W被用W檢測元素標簽和帶元素標簽的編碼 的珠兩者。在固定化的膚底物(例如，附接至帶元素標簽的支持體的膚底物或其第一部分） 已經從生物介質中分離的情況下，元素分析可W被用W檢測在生物介質中的元素標簽。
[0050] 元素分析可W被用W提供元素標簽和/或帶元素標簽的支持體的定量測量。
[0051] 在某些實施方案中，生物介質使用顆粒元素分析被分析。此方法允許精確測量酶 活性，而不需要分離帶標簽的、固定化的膚底物。例如，尚未被裂解的帶標簽的、固定化的底 物（即，尚未經歷蛋白水解的帶標簽的、固定化的膚底物)將提供指示元素標簽和帶元素標 簽的支持體兩者的存在的信號。相反地，已經被裂解的帶標簽的底物將提供有區別的且可 鑒定的信號，其對應于如上文描述的第一部分（附接至帶元素標簽的支持體)或第二部分 (附接至元素標簽）。
[0052] 因此，顆粒元素分析可W被用W鑒定且定量在單獨的顆粒的水平下的酶活性的存 在。此外，因為被裂解的帶標簽的膚底物提供與完整的、未反應的帶標簽的、固定化的膚底 物相比有區別的且可鑒定的信號，所W該過程可W在單步驟中進行，而不需要在分析之前 分離。
[0053] 通常，酶動力學通過米氏常數(Michaelis constant化M和最大反應速率V默來表 征。首先，保持酶底物的不變的濃度，產物形成的速率可W通過測量作為時間的函數的產物 濃度來確定。例如，在元素編碼的珠上的帶標簽的、固定化的膚底物可W與特定的蛋白酶組 合W形成反應混合物，并且如上文對于被裂解的產物的元素分析所描述的，等份部分在特 定的時間間隔(例如，2分鐘、4分鐘、6分鐘等等)被取出并且被處理W獲得反應速率V。其次， 可W對于在不變的蛋白酶濃度下的不同的初始的帶標簽的、固定化的膚底物濃度確定產物 形成的速率。假定單底物蛋白酶動力學反應，米-曼氏方程(Michaelis-Menten equation) 可W被用W從獲得的數據確定Km和V嚴:。
[0054] 本文描述的方法可W W多重形式進行，其中多種酶的活性同時地被測量。
[0055] 如本文所使用，"多重測定(multiplexed assay)"指的是其中多個測定反應（例 如，設及多種分析物的同時的、有區別的反應)在單個反應室中進行和/或其中多種分析物 在單個檢測步驟中被分析的測定。
[0056] 例如，在本文描述的解育步驟中，多種有區別的帶標簽的、固定化的膚底物可W在 相同的生物介質中被解育。每種底物可W用有區別的元素標簽來加標簽，并且被固定化在 有區別的帶元素標簽的支持體上。運允許每種膚底物使用元素分析(例如，使用質譜細胞計 量術)唯一地被鑒定。
[0057] 生物介質還可W包含多種酶。因為通過有區別的元素標簽的存在，每種膚底物可 W唯一地被鑒定，因此每種對應的酶（即，對該底物特異性的酶）的活性也可W被定量地確 定。
[0058] 例如，生物介質可W包含兩種或更多種膚底物，所述兩種或更多種膚底物是用于 兩種或更多種不同的蛋白酶的底物。
[0059] 另外，至少五種不同的膚底物可W有區別地被加標簽且被固定化W形成至少五種 有區別的帶標簽的、固定化的膚底物，其中每種膚底物是用于不同的蛋白酶的底物。至少五 種元素標簽中的每種和帶元素標簽的支持體可W被檢測且被定量，例如通過質譜細胞計量 術。
[0060] 進一步地，至少十種不同的膚底物可W有區別地被加標簽且被固定化W形成至少 十種有區別的帶標簽的、固定化的膚底物，其中每種膚底物是用于不同的蛋白酶的底物。至 少十種不同的元素標簽中的每種和帶元素標簽的支持體可W被檢測且被定量，例如通過質 譜細胞計量術。
[0061] 進一步地，至少十五種不同的膚底物可W有區別地被加標簽且被固定化W形成至 少十五種有區別的帶標簽的、固定化的膚底物，其中每種膚底物是用于不同的蛋白酶的底 物。至少十五種不同的元素標簽中的每種和帶元素標簽的支持體可W被檢測且被定量，例 如通過質譜細胞計量術。
[0062] 進一步地，至少二十種不同的膚底物可W有區別地被加標簽且被固定化W形成至 少二十種有區別的帶標簽的、固定化的膚底物，其中每種膚底物是用于不同的蛋白酶的底 物。至少二十種不同的元素標簽中的每種和帶元素標簽的支持體可W被檢測且被定量，例 如通過質譜細胞計量術。
[0063] 因為考慮到元素標簽可W不同于帶元素標簽的支持體，在單測定中可W被多重化 的不同的膚底物的最大數通常取決于可W通過質譜細胞計量術同時地被檢測且被定量的 可區別的元素標簽的數目。此外，W使用用于鑒定不同的珠類型的多種比率的若干不同的 金屬相似的方式，用于附接至不同的膚底物的元素標簽也可W選自不同的金屬的唯一的組 合。因為金屬和其穩定的同位素的數目可W大于50,所W不同的膚底物的數目可W是非常 大的(超過IO 6個不同元素標簽是可行的）。然而，它遵守質譜細胞計量術的操作限值并且數 據收集能力有助于確定可W同時地被分析的膚底物的最大數。因此，預計至少100種不同的 膚底物可W有區別地被加標簽且被固定化W形成至少100種有區別的帶標簽的、固定化的 膚底物是合理的。更具體地，10種至100種不同的膚底物的上限可W有區別地被加標簽且被 固定化W形成至少100種有區別的帶標簽的、固定化的膚底物。
[0064] 生物介質還可W包含多種酶激活劑和/或抑制劑。例如，生物介質可W包含對兩種 或更多種不同的酶是特異性的兩種或更多種不同的酶抑制劑。
[0065] 本文描述的過程和方法有助于，例如用于基因報告表達的有效的、精確的、W及定 量的測定的準備。
[0066] 在生物醫學和藥學研究中，報告基因測定廣泛地被用于研究基因調節和鑒定影響 基因表達的因素。將由一個或更多個基因調節元件（即，對于功能性mRNA的轉錄所必需的序 列區連同對于報告蛋白所必需的編碼序列）組成的報告基因構建物引入到活細胞中，然后 是表達的蛋白或其酶活性的定量，運使得能夠間接測量基因表達。因此，轉染的e-半乳糖巧 酶報告基因可W指示用于在給定的細胞中的感興趣的蛋白質的調節元件的存在。在測試樣 品的單一等分部分中檢測多種酶的能力，如在本文陳述的方法中描述的，有助于鑒定內源 酶活性和由轉染到細胞中的基因編碼的報告酶活性(例如，e-半乳糖巧酶）。
[0067] 特定應用的一個實例是作為用于前列腺癌的預測標志物(prognostic marker)的 多種激膚釋放酶化all化rein)的用途，所述激膚釋放酶是絲氨酸蛋白酶。已知，不同的激膚 釋放酶蛋白影響前列腺并且運些蛋白酶具有已知的氨基酸序列。已經提議，在血清中與前 列腺特異性抗原(PSA)濃度結合的激膚釋放酶蛋白酶濃度可W被用W比單獨地測量PSA濃 度更精確地確定前列腺癌的發病率并且從而降低前列腺活檢的數目。PSA也是激膚釋放酶 蛋白酶家族的成員。
[0068] 另外，在受影響的組織中的膜蛋白酶濃度可W被用W確定結腸直腸癌(CRC)的發 病率。膜蛋白酶激活基質金屬蛋白酶(在CRC中的MMP-2、MMP-7、MMP-9)并且與該基質金屬蛋 白酶共表達。在腫瘤環境內的膜蛋白酶和MMP的共分離(co-segregation)對激活MMP是重要 的；此過程可W解釋隨著增加的膜蛋白酶濃度，在結腸直腸癌中的差的預后。膜蛋白酶和 MMP-起在結腸直腸的增殖、進展、和侵入中是特別地重要的。
[0069] 運些僅僅是由本公開內容提供的方法可W提供關于在特定的生物過程中多種酶 的活性的有利信息的許多各種應用中的兩種。
[0070] 另外，本文公開的方法還有助于產生用于酶活性的高通量篩選的底物懸浮陣列。 篩選測定通常包括兩組反應的比較:沒有效應物的第一組反應，W及除了效應物存在之外， 第二組相同的反應。例如，包含蛋白酶和選擇的酶效應物的生物介質可W在每種反應物的 不同濃度下被制備。然后，可W將在元素編碼的珠上的固定化的底物添加至每種生物介質 并且解育直到反應完成。獲得的混合物典型地被稀釋至IO 6個珠/mL,并且珠通過質譜細胞 計量術被分析。然后，可W比較在有和沒有酶效應物下的反應之間的數據。
[0071] 如本文所使用，術語"支持體"指的是膚底物可W被附接至的固體表面。
[0072] 支持體的非限制性實例包括合成的膜、珠(例如，彈性體、瓊脂糖、娃酸鹽）、W及在 塑料微孔(plastic microwell)、載玻片、W及反應管中的平面表面。
[0073] 例如，支持體可W包括固體珠。固體珠可W包括聚合物的、玻璃的、或陶瓷的珠。玻 璃的或陶瓷的珠還可W包括金屬涂層。金屬涂層可W包括金屬、金屬合金、或其組合。
[0074] 在珠是聚合物的珠的情況下，珠可W包含聚苯乙締、聚甲基丙締酸甲醋、丙締臘、 或其組合。在某些實施方案中，珠包含聚苯乙締。
[0075] 固體支持體可W是編碼的珠（即，其中一種或更多種有區別的元素被附接至珠和/ 或被包含在珠內的固體珠，從而當通過元素分析詢問時，提供有區別的信號）。例如，支持體 可W包含如在美國申請公布號2010/0144056 Al中描述的元素污染的珠，該申請通過引用 W其整體并入。
[0076] 編碼的珠可W包含兩種或更多種有區別的污染元素。例如，編碼的珠可W包含兩 種或更多種有區別的銅系元素。
[0077] 在某些實施方案中，支持體包含其中污染元素在整個珠的主體中均勻地擴散的元 素污染的珠。
[0078] 可選擇地，支持體包含其中污染元素 W導致所述污染元素的有區別的體積分布的 方式滲透所述微米球的元素污染的珠。
[0079] 固體支持體可W具有從約0.1微米至約10微米、從約0.3微米至約10微米、從約0.5 微米至約10微米、從約0.8微米至約10微米、W及從約1微米至約10微米的顆粒尺寸。
[0080] 如本文所使用，術語"元素標簽"指的是包含附接至支持分子結構的元素或多種元 素，并且基于其元素組成與分析物W及與其他元素標簽是可區別的化學部分。
[0081] 為了與分析物是可區別的，元素標簽可W包含在分析物中不存在，或僅W痕量存 在的一種或更多種元素。例如，元素標簽可W包含金屬元素。
[0082] 在某些實施方案中，元素標簽可W包含銅系元素或過渡元素。典型的銅系元素的 非限制性實例包括館、禮、鋪、W及鏡。元素標簽可W包含選自由W下組成的組的過渡后金 屬元素(post-transition metal element):侶、嫁、銅、錫、巧、鉛、W及祕。
[0083] 元素分析(例如，質譜細胞計量術)可W被用W精確地檢測且區別相同元素的不同 的同位素。因此，元素標簽可W基于其同位素組成是可區別的。例如，元素標簽可W包含元 素的多種同位素。
[0084] 在相同的樣品中，元素標簽在功能上與眾多其他元素標簽是可區別的，因為元素 標簽的元素組成或同位素組成不同于其他標簽的元素組成或同位素組成。
[0085] 使用對本領域普通技術人員熟知的標準化學，膚底物可W通過標準的連接部分被 連接至元素標簽或聚合物元素標簽。
[0086] 在元素標簽包含金屬元素的情況下，元素標簽還可W包含一種或更多種馨合基 團。
[0087] 元素標簽可W包含包括多個共價附接的馨合基團的聚合物載體。
[0088] 如本文所使用，術語"聚合物"指的是包含如下分子的物質:所述分子的特征為W 足W在添加或除去一個或幾個構成單元下提供不顯著地變化的一組性質的量彼此連接的 一種或更多種原子或原子團的物質（構成單位)的多個重復。更通常地，聚合物分子可W在 其主鏈和側基方面被描述，所述主鏈是跨越該分子的長度的原子的被連接的連接物 (connected link)，所述側基被附接至每個組成單元的主鏈部分。側基可W在化學上和在 功能上不同于主鏈。
[0089] 例如，元素標簽可W包含聚合物，其中聚合物包含對金屬離子具有高親和度，并且 可W充當用于運些離子的馨合基團或配體的多個側基。
[0090] 元素標簽可W是如在美國申請公布號2008/0003616 Al中描述的基于聚合物的元 素標簽，該申請通過引用W其整體并入。
[0091] 例如，元素標簽可W包含聚合物，其中聚合物包含包括二乙締=胺五乙酸醋 (DTPA)配體或1，4,7,10-四氮雜環十二燒-1，4,7,10-四乙酸(DOTA)配體、或其酷胺或醋的 至少一種結合金屬的側基，W及至少一種金屬原子。
[0092] 結合金屬的側基的數目可W是在約10和約250之間。例如，元素標簽可W包含包括 從約10種至約50種過渡金屬或銅系原子的聚合物。在某些實施方案中，聚合物包含從約20 種至約50種過渡金屬或銅系原子。特別地，聚合物包含從約25種至約35種過渡金屬或銅系 原子。
[0093] 元素標簽包含至少一種過渡金屬或其他金屬原子。可選擇地，元素標簽包含至少 一種銅系原子。
[0094] 聚合物可W選自由W下組成的組:直鏈聚合物、共聚物、支鏈聚合物、接枝共聚物、 嵌段共聚物、星形聚合物、W及超支化聚合物。例如，聚合物的主鏈可W衍生自被取代的聚 丙締酷胺、聚甲基丙締酸醋、或聚甲基丙締酷胺。
[0095] 通常，本文描述的過程和方法可W被用W檢測具有對膚底物特異性的活性的任何 類型的酶的存在。
[0096] 在某些實施方案中，酶是蛋白酶，蛋白酶寬泛地指的是進行蛋白水解的任何酶。更 特別地，蛋白酶催化將氨基酸(例如，在膚鏈、多膚鏈、或蛋白質鏈中連接的氨基酸)連接在 一起的膚鍵的水解。
[0097] 可W根據本文公開的方法鑒定的蛋白酶的非限制性實例包括絲氨酸蛋白酶、蘇氨 酸蛋白酶、半脫氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、W及金屬蛋白酶。
[0098] 絲氨酸蛋白酶的非限制性實例包括膜蛋白酶、糜蛋白酶、角蛋白酶、纖溶酶、凝血 酶、纖維蛋白溶酶、膠原酶、枯草桿菌蛋白酶、W及彈性蛋白酶。
[0099] 半脫氨酸蛋白酶的非限制性實例包括calapin、組織蛋白酶(A、B、和C)、脫天蛋白 酶、木瓜蛋白酶、W及渡蘿蛋白酶。
[0100] 天冬氨酸蛋白酶的非限制性實例包括胃蛋白酶、早老蛋白-1、早老蛋白-2、腎素、 丫-分泌酶、P Iasm巧S in、組織蛋白酶-D、W及組織蛋白酶-E。
[0101] 本文描述的過程和方法還可被用W檢測在生物介質中的酶激活劑或抑制劑的存 在。例如，酶激活劑或抑制劑的活性可W使用如上文描述的篩選測定來檢測，其中來自具有 預期的激活劑或抑制劑的反應的數據與來自其中激活劑或抑制劑不存在的另外相同的反 應的數據比較。
[0102] 如本文所使用，術語"膚底物"通常指的是包含通過膚鍵連接的兩個或更多個氨基 酸的分子。
[0103] 例如，膚底物可W包括膚、多膚、或蛋白質。如本領域技術人員所理解，在膚、多膚、 和蛋白質之間的尺寸邊界不是固定的，并且如本文所使用，運些術語可交換地指的是包含 通過一個或更多個共價化學鍵連接的兩個或更多個氨基酸的化合物。
[0104] 底物可W是合成的或天然存在的實體。
[0105] 天然存在的膚底物的非限制性實例包括蛋白質，例如血紅蛋白、肌紅蛋白、血影蛋 白、纖連蛋白、膠原蛋白、角蛋白、彈性蛋白、明膠、膜島素、W及白蛋白。
[0106] 膚底物的第一氨基酸和末尾氨基酸可W是C-末端氨基酸或N-末端氨基酸。當膚底 物的第一氨基酸是C-末端氨基酸時，膚底物的末尾氨基酸是N-末端氨基酸。相反地，當膚底 物的第一氨基酸是N-末端氨基酸時，膚底物的末尾氨基酸是C-末端氨基酸。
[0107] 生物介質還可W包含一種或更多種另外的組分。
[0108] 例如，生物介質還可W包含酶活性的候選效應物。如本文所使用，術語"效應物"指 的是能夠直接地或間接地增加或降低酶的活性的分子。如本文所使用，術語"候選效應物" 指的是可W對增加或降低酶的活性起作用的分子。
[0109] 效應物的非限制性實例包括大分子，例如蛋白質、糖蛋白、多糖、糖胺聚糖、蛋白聚 糖、整合素、酶、凝集素、選擇素（selectin)、細胞粘附分子、毒素、細菌菌毛、轉運蛋白、激 素、抗體、主要組織相容性復合物、免疫球蛋白超家族、W及巧粘蛋白。效應物的另外的非限 制性實例包括小分子，例如公認的藥物(putative化Ug)、單糖、二糖、寡糖、氨基酸、寡膚、 核巧、核巧酸、寡核巧酸、脂類、類視黃醇類、類固醇類、W及糖膚。
[0110] 生物介質還可W包含一種或更多種內標（internal standard)。通常，內標指的是 向生物介質添加的區別于分析物的已知量的化合物。
[0111]將內標添加至生物介質在質譜法作為分析法被使用時是特別地有用的。當生物介 質被分析時，從內標獲得的信號可W被用W校正分析結果。例如，通過將來自分析物的質譜 信號的強度與W已知量存在的內標的信號強度比較，可W得出分析物的定量測量。
[0112] 已經詳細地描述了本發明，將明顯的是，修改和變型是可能的而不偏離在所附的 權利要求書中定義的本發明的范圍。 實施例
[0113] 提供W下非限制性實施例W進一步例證本發明。
[0114] 實施例1:使用質譜細胞計量術的顆粒元素分析
[0115] 對于蛋白酶，巧蛋白酶-1、脫天蛋白酶-3、MMP-9 W及ADAMlO，合成四種正交的膚底 物。每種底物在C-末端處攜帶生物素標簽并且在N-末端處攜帶基于DTPSA的銅系復合物。蛋 白酶屬于酶的四種不同的家族并且在正常的生理過程中W及在多種疾病中起重要作用。例 如，基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)在骨發育和傷口愈合期間重新構建細胞外基質方面是必需 的，并且還設及癌癥轉移和關節炎。ADAM10,作為另外的實例，在蛋白酶解加工淀粉樣前體 蛋白W形成e-淀粉體中是必需的，e-淀粉體被沉積在阿爾茲海默患者的腦中發現的淀粉樣 斑塊中。
[0116] 然后，每個膚底物通過附接至具有硫醇官能化的表面的唯一編碼的珠被固定化。 每個編碼的珠包含用不同比例的兩種銅系元素污染的聚苯乙締，并且因此當使用質譜細胞 計量術詢問時提供有區別的信號。
[0117] 然后，每種固定化的底物用元素標簽加標簽，其中每種元素標簽包含過渡金屬或 銅系元素。當使用元素分析詢問時，元素標簽提供有區別的信號。
[0118] 然后，將帶標簽的、固定化的膚底物在包含生物介質的容器中解育，所述生物介質 包含從化La細胞裂解物中獲得的樣品。在約25°C下，底物與樣品一起解育持續2小時。
[0119] 然后，生物介質通過質譜細胞計量術來詢問。因為每個顆粒通過質譜細胞計數器， 所W獲得的質譜信號可W被用W定量膚底物的狀態。例如，過渡金屬元素或銅系元素的檢 測對應于特定的元素標簽的存在。如果此信號與指示對應的銅系元素污染的編碼的珠支持 體的存在的第二信號相一致，則推測底物仍舊是完整的，并且尚未經歷蛋白水解。相反地， 如果沒有對應于編碼的珠的信號被檢測到，則推測被檢測的顆粒是已經通過蛋白水解被裂 解的底物的第二部分(即，帶元素標簽的部分）。W此方式，獲得在樣品中的酶活性的定量分 析。
[0120] 例如，激膚釋放酶可W被用作用于前列腺癌的預測標志物。多種激膚釋放酶基因 把是蛋白酶的激膚釋放酶編碼;運些蛋白酶具有已知的氨基酸序列。運些激膚釋放蛋白酶 的底物也是已知的。因此，激膚釋放蛋白酶的一種或更多種的已知的膚底物可W具有附接 至該膚的C-末端或N-末端氨基酸的編碼的珠并且該膚底物的其他氨基酸可W使用本領域 已知的方法被附接至元素標簽或帶元素標簽的聚合物。在膚底物通過附接至編碼的珠而被 固定化并且用元素標簽被加標簽之后，膚底物可W與感興趣的生物樣品一起解育并且通過 質譜細胞計量術詢問。質譜細胞計量術數據可W提供關于特定的激膚釋放蛋白酶的活性的 信息并且允許關于激膚釋放酶濃度的推論。已經提議，激膚釋放酶蛋白酶濃度和前列腺特 異性抗原(PSA)濃度在血清中的組合可W被用W比單獨地測量PSA濃度更精確地確定前列 腺癌的發病率。此數據可能可W降低前列腺活檢的數目。
[0121] 另外，膜蛋白酶濃度可W被用W確定結腸直腸癌(CRC)的發病率。膜蛋白酶激活基 質金屬蛋白酶(在CRC中的MMP-2、MMP-7、MMP-9)并且與該基質金屬蛋白酶共表達。在腫瘤環 境內的膜蛋白酶和匪P的共分離對激活MMP是重要的。用于膜蛋白酶和MMP的底物是已知的 并且可W如本文描述的被編碼且被加標簽W提供固定化的、帶標簽的膚底物。在底物被固 定并且被加標簽之后，底物可W通過質譜細胞計量術被詢問W提供關于目標酶活性的活性 和濃度的信息。收集數據可W解釋對于在具有在受影響的組織中增加的膜蛋白酶濃度的患 者中的結腸直腸癌所觀察到的差的預后。膜蛋白酶和MMP-起在結腸直腸的增殖、進展、W 及侵入中是特別地重要的，所W知道運些蛋白酶在特定的組織中的活性可W提供關于結腸 直腸癌的進展的另外的信息。
[0122] 當引入本發明或其某(些)實施方案的要素時，冠詞"一 (a)"、"一 (an)"、"該(the)" 和"所述（said)"意圖意指有一個或更多個的該要素。術語"包含（comprising)"、"包括 (including)"和"具有化aving)"意圖是包含性的并且意指除了列出的要素之外可W有另 外的要素。
[0123] 鑒于上文，將理解，實現本發明的若干目的并且獲得其他有利的結果。
[0124] 因為在上文的產物和方法中可W做出各種變化而不偏離本發明的范圍，所W意圖 是所有在上文的描述中包含的和在附圖中示出的內容將被解釋為是說明性的并且沒有限 制性意義。
【主權項】
1. 一種用于確定生物流體中的蛋白酶活性的方法，所述方法包括 將編碼的珠附接至肽底物的第一氨基酸以形成固定化的肽底物，所述肽底物包含所述 第一氨基酸和末尾氨基酸并且是用于蛋白酶的底物； 將元素標簽附接至所述肽底物的所述末尾氨基酸以形成固定化的帶標簽的肽底物； 用生物流體孵育所述固定化的帶標簽的肽底物； 通過元素分析檢測所述生物流體中的所述元素標簽和所述編碼的珠；以及 基于檢測所述元素標簽，確定所述生物流體內的蛋白酶活性。2. 如權利要求1所述的方法，其中檢測所述元素標簽和所述編碼的珠包括使用質譜細 胞計量術。3. 如權利要求1或2所述的方法，其中所述肽底物包含兩種或更多種肽底物，其中所述 兩種或更多種肽底物是用于兩種或更多種不同的蛋白酶的底物。4. 如權利要求1至3中任一項所述的方法，其中檢測所述元素標簽和所述編碼的珠包括 使用質譜細胞計量術定量所述元素標簽。5. 如權利要求1至4中任一項所述的方法，還包括將所述固定化的肽底物從所述生物流 體中分離以形成分析物溶液以及檢測所述元素標簽。6. 如權利要求5所述的方法，其中所述元素標簽通過質譜細胞計量術來檢測。7. 如權利要求1至6中任一項所述的方法，其中所述編碼的珠包含用于所述編碼的珠的 唯一的元素或唯一的元素組合。8. 如權利要求1至7中任一項所述的方法，其中所述肽底物的所述第一氨基酸是C-末端 氨基酸。9. 如權利要求1至7中任一項所述的方法，其中所述肽底物的所述第一氨基酸是N-末端 氨基酸。10. 如權利要求1至8中任一項所述的方法，其中所述肽底物的所述末尾氨基酸是N-末 端氨基酸。11. 如權利要求1至7和權利要求9中任一項所述的方法，其中所述肽底物的所述末尾氨 基酸是C-末端氨基酸。12. 如權利要求1至11中任一項所述的方法，其中所述元素標簽包括過渡金屬元素。13. 如權利要求1至11中任一項所述的方法，其中所述元素標簽包含選自由以下組成的 組的過渡后金屬元素:鋁、鎵、銦、錫、鉈、鉛、以及鉍。14. 如權利要求1至11中任一項所述的方法，其中所述元素標簽包含鑭系元素。15. 如權利要求1至14中任一項所述的方法，其中所述元素標簽被附接至包含10種至 100種過渡金屬、過渡后金屬、或鑭系原子的聚合物。16. 如權利要求15所述的方法，其中所述元素標簽被附接至包含20種至50種過渡金屬、 過渡后金屬、或鑭系原子的聚合物。17. 如權利要求15所述的方法，其中所述元素標簽被附接至包含25種至35種過渡金屬、 過渡后金屬、或鑭系原子的聚合物。18. 如權利要求1至17中任一項所述的方法，其中五種或更多種肽底物是用于五種或更 多種不同的蛋白酶的底物。19. 如權利要求1至17中任一項所述的方法，其中十種或更多種肽底物是用于十種或更 多種不同的蛋白酶的底物。20. -種用于檢測在生物流體中的蛋白酶活性的方法，其中所述方法包括： 將編碼的固定化部分附接至至少五種不同的肽底物的第一氨基酸以形成至少五種不 同的編碼的固定化的肽底物，其中所述至少五種不同的肽底物中的每種是用于不同的蛋白 酶的底物； 將不同的元素標簽附接至所述至少五種不同的編碼的固定化的肽底物中的每種的末 尾氨基酸以形成至少五種不同的固定化的帶標簽的肽底物； 用生物流體孵育所述至少五種不同的固定化的帶標簽的肽底物；以及 通過質譜細胞計量術檢測所述生物流體中的所述元素標簽和編碼的固定化部分；以及 基于檢測所述元素標簽和所述編碼的固定化部分，確定所述生物流體中的所述蛋白酶 活性。21. 如權利要求20所述的方法，還包括將所述固定化的肽底物從所述生物流體中分離 以形成分析物溶液以及通過質譜細胞計量術檢測所述分析物溶液中的所述不同的元素標 簽。22. 如權利要求20或21所述的方法，其中檢測所述元素標簽和所述編碼的固定化部分 包括使用質譜細胞計量術。23. 如權利要求20至22中任一項所述的方法，其中所述編碼的固定化部分是編碼的珠 并且包含唯一的元素或唯一的元素組合。24. 如權利要求20至23中任一項所述的方法，其中所述肽底物中的每種的所述第一氨 基酸是C-末端氨基酸。25. 如權利要求20至24中任一項所述的方法，其中所述肽底物中的每種的所述第一氨 基酸是N-末端氨基酸。26. 如權利要求20至24中任一項所述的方法，其中所述肽底物中的每種的所述末尾氨 基酸是N-末端氨基酸。27. 如權利要求20至23和權利要求25中任一項所述的方法，其中所述肽底物中的每種 的所述末尾氨基酸是C-末端氨基酸。28. 如權利要求20至27中任一項所述的方法，其中所述元素標簽包含過渡金屬元素。29. 如權利要求20至27中任一項所述的方法，其中所述元素標簽包含鑭系元素。30. 如權利要求20至27中任一項所述的方法，其中所述元素標簽包含選自由以下組成 的組的過渡后金屬元素:鋁、鎵、銦、錫、鉈、鉛、以及鉍。31. 如權利要求20至30中任一項所述的方法，其中所述元素標簽被附接至包含10種至 100種過渡金屬、過渡后金屬、或鑭系原子的聚合物。32. 如權利要求31所述的方法，其中所述元素標簽被附接至包含20種至50種過渡金屬、 過渡后金屬、或鑭系原子的聚合物。33. 如權利要求31所述的方法，其中所述元素標簽被附接至包含25種至35種過渡金屬、 過渡后金屬、或鑭系原子的聚合物。34. 如權利要求20至33中任一項所述的方法，其中所述至少五種肽底物包含至少10種 肽底物，其中所述至少1 〇種肽底物中的每種是用于不同的蛋白酶的底物。
【文檔編號】C12Q1/37GK105874078SQ201480072222
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2014年11月26日
【發明人】奧爾加·奧爾納特斯基
【申請人】富魯達加拿大公司