基于AgNCs/HpDNA探針的microRNA SDA檢測法
【技術領域】
[0001 ] 本發明涉及醫學和分子診斷領域，是一種基于AgNCs/HpDNA探針的mi croRNA SDA 檢測法，特別是涉及一種基于發夾型DNA模板合成銀納米團簇探針結合鏈取代等溫擴增的 單個mi croRNA檢測方法。
【背景技術】
[0002] MicroRNA(miRNA)是一類長度約為21nt的內源非編碼小RNA分子，其可通過與mRNA 之間精確或非精確互補配對，參與調控mRNA的表達水平。多個miRNA可協同調控一個mRNA， 或一個miRNA也可同時影響多個靶基因，從而形成一個高度復雜的調控網絡，影響著從分子 到細胞再到組織水平的一系列生物功能。miRNA表達異常與疾病及癌癥發生密切相關。尤為 重要的是，已發現多種miRNA標志物可用于癌癥早期診斷、預后及進程監控。其中，上海交通 大學崔大祥課題組用微陣列芯片miRNA全基因組掃描結合qRT-PCR技術篩選得到miR-16-5p 和miR-19b-3p兩種血衆miRNA標志物，并指出二者可用于指示胃癌發生發展進程(Zhang, J.,Song,Y.,Zhang,C.,et al.(2015)Circulating miR-16-5p and miR-19b-3p as two novel potential biomarkers to indicate progression of gastric cancer. Theranostics, 5,733-745.)。其中，qRT-PCR是進行miRNA定量檢測的金標準，但由 于其需分步進行逆轉錄和熱循環擴增及檢測，導致該法耗時且費力。所以仍有必要進一步 發展便捷快速的miRNA檢測新方法。
[0003] 等溫擴增技術的出現使核酸擴增技術因擺脫了熱循環變性步驟和儀器的束縛，而 受到了眾多研究者的關注。作為第一代等溫擴增技術，鏈取代擴增Strand-displacement amplification(SDA)受DNA修復中堿基切除修復機制的啟發迅速發展起來，至今，已發展出 包括多引物SDA(multiply primed SDA)，剪切誘導SDA(nicking_initiated SDA)，環介導 等溫擴增（loop-mediated isothermal ampl if icat ion (LAMP))和結構轉換誘發SDA (structure-switching-triggered SDA)等多種亞型。其中，由于結構轉換誘發SDA不需要 特殊設計剪切位點和額外使用剪切酶，而僅通過待測靶核酸與發夾結構探針的結合并導致 后者打開而誘導SDA反應，特別適合對短鏈核酸分子及miRNA進行檢測。目前，常用于結構 轉換誘發SDA的檢測探針是一端連接有熒光染料及另一端連接熒光淬滅子的發夾型DNA分 子信標(molecular beacon (MB))，但由于其需要對DNA進行偶聯修飾，使檢測成本增高，檢 測應用受限。
[0004] 隨著以DNA模板合成銀納米團族(DNA-templated silver nanoclusters(AgNCs/ DNA))的興起，使得可能發展出除熒光染料或量子點修飾以外的新型核酸熒光探針。銀納米 團簇是僅由幾個或幾十個銀原子組成的直徑小于lnm的集合體，其易于合成，且熒光可調 控。更重要的是，AgNCs/DNA中由于DNA模板的引入，可僅通過改變DNA序列、長度和構象來獲 得特定的光物理學特性。近來，已有多種DNA序列合成AgNCs用于核酸或miRNA檢測。Yang和 Shah以5 ' -CCTCCTTCCTCC-3 '為AgNCs成核區序列，并連接以miRNA雜交序列，借助該探針的 熒光淬滅效應，對miR-160和miR-172進行了檢測（Yang，S.W.and Vosch，T. (2011)Rapid detection of microRNA by a silver nanocluster DNA probe.Anal.Chem.,83,6935-6939. hLiu利用指數等溫擴增反應生成用于紅色熒光AgNCs合成的DNA模板，并借助熒光強 度與DNA模板濃度間關系，對miR-141進行了測定。這些檢測或借助熒光淬滅效應，或分別進 行信號擴增和信號檢測，導致特異性不好，或操作繁瑣（Liu，Y.-Q.，Zhang，M.，Yin，B._ C. and Ye，B·_C·(2012)Attomolar ultrasensitive microRNA detection by DNA-scaffolded silver-nanocluster probe based on isothermal amp 1 if i cat ion .Anal · Chem · ,84,5165-5169.)。而隨著Yeh 報道了 雜交介導的富G 序列對 AgNCs/DNA的熒光增強效應，使建立基于light-up信號的核酸檢測平臺成為可能（Yeh， H.C.,Sharma,J.,Han,J.J.,Martinez ,J.S. and fferner,J.H.(2010)A DNA-silver nanocluster probe that fluoresces upon hybridization. Nano Lett.,10,3106-3110.)。但是，單純的雜交檢測雖然簡便，卻也很難確保較好的特異性。因而，為進一步提高 檢測特異性，簡化操作步驟，我們首次將基于AgNCs/DNA的富G序列熒光增強效應與結構轉 換誘發SDA擴增技術結合，并研究二者的相互作用，以期實現可調控、簡便及高特異檢測。

【發明內容】

[0005] 為了克服上述現有技術的不足，本發明的目的是提供一種基于AgNCs/HpDNA探針 的miRNA SDA檢測法，具體是一種基于發夾型DNA模板合成銀納米團簇(AgNCs/HpDNA)探針 結合SDA反應對miRNA進行檢測的方法，即針對前期篩選得到的miRNA標志物miR-19b-3p，設 計并構建AgNCs/HpDNA探針，驗證該探針的富G序列熒光增強性能，在此基礎上，對miRNA標 志物進行單個檢測，及單個堿基錯配檢測。
[0006] 本發明的目的是通過以下技術方案實現的：
[0007] 第一方面，本發明提供一種HpDNA，序列如SEQ ID N0:1所示。
[0008] 第二方面，本發明提供一種基于所述HpDNA的AgNCs/HpDNA，所述AgNCs/HpDNA是通 過如下方法制備：
[0009] 將AgN〇3溶液、NaBH4溶液加入HpDNA中，震蕩，靜置，即得AgNCs/HpDNA。
[0010 ] 優選地，所述HpDNA、AgN〇3、NaBH4的終摩爾濃度之比為1:17:17;所述震蕩的時間為 45s~lmin，震蕩具體為劇烈震蕩;所述靜置具體為暗環境中室溫下放置18h。
[0011] 第三方面，本發明提供一種所述的AgNCs/HpDNA在檢測胃癌血衆miRNA標志物miR- 19b-3p中的應用，所述miR-19b-3p的序列如SEQ ID N0:2所示。
[0012] 第四方面，本發明提供一種基于所述AgNCs/HpDNA的胃癌血衆miRNA標志物miR- 19b-3p SDA檢測方法，所述檢測方法包括：以所述AgNCs/HpDNAs為分子探針，在含富G序列 垂懸端的引物作用下進行SDA反應，借助富G序列雜交熒光增強效應，實現miR-16-5p檢測， 該引物序列如SEQ ID N0:3。
[0013] 優選地，所述SDA反應的總體積為50yL，其中， 緩沖液 lxNb2.1 5μΙ, dN'TPs 100m Μ Ο.?μL, miR-19b-3p 20 μΜ 0.125-6.25^L,
[0014] 引物 100 μΜ ],25μΙ, AgNCs/HpDNA 5μΜ 25pL, Bsu 聚合酶：C 無 DTT.) 2:叫，. 余量為無酶水。
[0015] 優選地，所述緩沖液lXNb2.1 包括50mM NaAc、10mM Tris-HAc、10mM Mg(Ac)2和 100yg/mL BSA，緩沖液pH 7.9(25°C)。
[0016] 優選地，所述SDA反應的反應條件為:在55°C環境中孵育55min。熒光檢測的激發波 長為490nm和430nm。第五方面，本發明提供所述的檢測方法在單個堿基錯配核酸序列檢測 中的應用。
[0017] 本發明所采用的技術方案是：
[0018] 如圖1所示，用于合成AgNCs的發夾型探針(GRE 19b(5s)C)含三個區，分別為頸區 HpS、環區HpL和3 '垂懸區HpGO。其中，特別設計的垂懸區富含C序列用于合成AgNCs，且HpGO (5'-CCCCCCCCCCCCCCCGCCCGCC-3'）在雜交作用下與互補鏈中的富G垂懸序列靠近而得到綠