尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性測定試劑盒及其方法
【技術領域】
[0001 ]本發明屬于生命科學領域，涉及一種試劑盒，具體涉及一種尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性測定試劑盒及其方法。
【背景技術】
[0002]尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶是生物體糖原合成過程中的關鍵酶。在葡萄糖合成糖原前催化葡萄糖活化，將1-磷酸葡萄糖與UTP分子合成為UDP-葡萄糖(UDPG)。
[0003]目前尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的測定方法主要是酶偶聯法，提取方法不盡相同，很多文獻報道的提取方法繁瑣，成分復雜，測定體系大，操作不夠簡便快捷。現需要專門研制一種試劑盒，可以簡便、快速、準確的對尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶進行測定。

【發明內容】

[0004]為了克服現有技術的缺陷，本發明旨在提供一種尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性測定試劑盒及其方法，可快速準確的對尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性進行測定。
[0005]為實現上述技術目的，達到上述技術效果，本發明通過以下技術方案實現:
尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性測定試劑盒，包括以下試劑:
提取液，50mL X 1瓶，4°C保存，由一定量的Tr i s、蒸餾水、HC1、乙二胺四乙酸二鈉鹽、DTT和蔗糖混勻后制成；
試劑一，液體25mL X 1瓶，4°C避光保存，由一定量的所述提取液、蒸餾水、MgCl2、UDPG混勻后制成；
試劑二，粉劑X 1瓶，_20°C避光保存，由一定量的NADP組成；
試劑三，粉劑X 1瓶，_20°C避光保存，由一定量的6-磷酸葡萄糖脫氫酶組成；
試劑四，粉劑X 1瓶，_20°C避光保存，由一定量的磷酸葡萄糖變位酶組成；
試劑五，液體5mLX 1瓶，4°C保存，由一定量的PPi與蒸餾水溶解后制成。
[0006]進一步的，所述提取液，是由63mL蒸餾水溶解0.38g Tris，加HC1調pH為7.5后，取其中50mL該混合溶液，加入18.6mg乙二胺四乙酸二鈉鹽、15.4mg DTT和5g蔗糖充分混勻后制成；
進一步的，所述試劑一，是由剩余13mL上述混合溶液再加入13mL蒸饋水、10.2mg MgCb和16mg UDPG混勻后制成；
進一步的，所述試劑二中，NADP的質量為21mg;
進一步的，所述試劑三中，6_磷酸葡萄糖脫氫酶的質量為12.5mg；
進一步的，所述試劑四中，磷酸葡萄糖變位酶的質量為5mg;
進一步的，所述試劑五中，PPi的質量為44.6mg，蒸饋水的體積為5mL。
[0007]尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGP)可逆催化反應生成1磷酸葡萄糖，在磷酸葡萄糖變位酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶作用下將NADP轉化為NADPH，340nm的吸光值增加速率反映了 UGP活性。
[0008]—種采用上述試劑盒且基于分光光度法的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性測定方法，包括以下步驟:
步驟1儀器和用品的準備；
天平、低溫離心機、研缽、紫外分光光度計、1 mL石英比色皿；
步驟2試劑的配制；
所述試劑二在臨用前加5mL蒸餾水充分溶解，制成試劑二水溶液；
所述試劑三在臨用前加5 mL蒸餾水充分溶解，制成試劑三水溶液；
所述試劑四在臨用前加5 mL蒸餾水充分溶解，制成試劑四水溶液；
步驟3樣本中粗酶液的提取；
1)組織:按照質量(g):提取液體積(mL)為1:(5?10)的比例加入所述提取液，冰浴勻漿后于4°C，12000rpm離心lOmin，取上清，即粗酶液，并置于冰上待測；
2)細胞:按照細胞數量(104個):提取液體積(mL)為(500?1000 ): 1的比例，冰浴超聲波破碎細胞，然后4°C，12000rpm離心lOmin，取上清，即粗酶液，并置于冰上待測；
3)液體:直接檢測；
步驟4尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性的測定操作；
1)分光光度計預熱30min，調節波長至340nm，蒸饋水調零；
2)取lmL石英比色皿，依次加入500yL所述試劑一、lOOyL所述試劑二水溶液、lOOyL所述試劑三水溶液、lOOyL所述試劑四水溶液、lOOyL所述試劑五和lOOyL所述粗酶液，充分混勻，記錄340nm處30s的吸光值AjP330s的吸光值Α2，ΔΑ=Α2-Αι ；
步驟5尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性的計算；
1)按照組織樣本蛋白濃度計算:
酶活單位定義:每毫克組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADP定義為一個酶活力單位； UGP(U/mg prot)=AA^(eXd)XV^^(V#XCpr)^T=321.54X ΔΑ + Cpr;
2)按照組織樣本質量計算:
酶活單位定義:每克組織每分鐘消耗1 nmol的NADP定義為一個酶活力單位； UGP(U/g)=AA^(eXd)XV^^(ff XV樣+%?) +T=321.54X ΔA+W;
3)按照細胞數量計算:
酶活單位定義:每104個細胞每分鐘消耗1 nmol的NADP定義為一個酶活力單位；UGPCU/104。611)=厶八+(￡\(1)\￥反總 + (%\細胞數量 + %總)+T = 321.54ΧΔΑ+細胞數量；
4)按照液體體積計算；
酶活單位定義:每毫升液體每分鐘消耗1 nmol的NADP定義為一個酶活力單位； UGP(U/mL)= Δ A+ (ε X d) X細+乂樣+Τ=321.54 X Δ A;
其中，VM^=lmL，表示反應體系總體積；
ε=6.22X 103 L / mol /cm，表示NADPH的摩爾消光系數；
d=1 cm，表示比色皿光徑；
^m=l mL，表示加入提取液體積；
V樣=0.lmL，表示加入樣本體積；
T=5min，表示反應時間； w表示樣本鮮重，單位為g ；
Cpr表示樣本蛋白濃度，單位為mg/mL。
[0009]進一步的，步驟三中，冰浴超聲波破碎細胞的方法為將功率設置為300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min。
[0010]本發明的有益效果是:
1、使用本發明的試劑盒測定尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶是所用到的儀器和用品相對較為普遍，對測定條件的要求也較低，符合普通實驗室的測定條件。
[0011 ] 2、本發明的方法在現有的酶偶聯法基礎上，將提取液成分及提取步驟簡化，提取液成分及濃度的調整達到了提取更加充分的效果，并且在低溫保存時間延長。
[0012]3、本發明的測定體系較小，所需樣本量以及測定試劑量少，適用于珍貴樣本測定。
[0013]4、本發明的檢測過程中大部分試劑使用體積一致，且檢測時間較短，達到了測定過程的簡單化和快捷化效果。
[0014]5、本發明的方法大大降低了檢測成本，并且檢測結果靈敏可靠。
[0015]上述說明僅是本發明技術方案的概述，為了能夠更清楚了解本發明的技術手段，并可依照說明書的內容予以實施，以下以本發明的較佳實施例詳細說明。本發明的【具體實施方式】由以下實施例詳細給出。
【具體實施方式】
[0016]下面將結合實施例，來詳細說明本發明。
[0017]一種尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性測定試劑盒，包括以下試劑:
提取液，50mL X 1瓶，4°C保存，由0.38g Tris與63mL蒸餾水溶解，加HC1調pH為7.5后配制成混合溶液，取其中50mL該混合溶液，加入18.6mg EDTA.2Na、15.4mg DTT和5g蔗糖充分混勾后制成；
試劑一，液體25mL X 1瓶，4°C避光保存，由剩余13mL上述混合溶液再加入13mL蒸餾水、10.2mg MgCh和 16mg UDPG混勻后制成；
試劑二，粉劑X 1瓶，_20°C避光保存，由2 lmg NADP組成；
試劑三，粉劑X 1瓶，_20°C避光保存，由12.5mg 6-磷酸葡萄糖脫氫酶組成；
試劑四，粉劑X 1瓶，_20°C避光保存，由5mg磷酸葡萄糖變位酶組成；
試劑五，液體5mLX 1瓶，4°C保存，由44.6mg PPi與5mL蒸餾水溶解后制成。
[0018]尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGP)可逆催化反應生成1磷酸葡萄糖，在磷酸葡萄糖變位酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶作用下將NADP轉化為NADPH，340nm的吸光值增加速率反映了 UGP活性。
[0019]—種采用上述試劑盒且基于分光光度法的尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性測定方法，通過如下三種實施例來說明。
[0020]實施例一
步驟1儀器和用品的準備；
天平、低溫離心機、研缽、紫外分光光度計、1 mL石英比色皿；
步驟2試劑的配制；
所述試劑二在臨用前加5mL蒸餾水充分溶解，制成試劑二水溶液； 所述試劑三在臨用前加5 mL蒸餾水充分溶解，制成試劑三水溶液；
所述試劑四在臨用前加5 mL蒸餾水充分溶解，制成試劑四水溶液；
步驟3組織樣本中粗酶液的提取；
按照質量(g):提取液體積(mL)為1:(5?10)的比例加入所述提取液，冰浴勻漿后于4°C，12000rpm離心lOmin，取上清，即粗酶液，并置于冰上待測；
步驟4尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性的測定操作；
1)分光光度計預熱30min，調節波長至340nm，蒸饋水調零；
2)取lmL石英比色皿，依次加入500yL所述試劑一、lOOyL所述試劑二水溶液、lOOyL所述試劑三水溶液、lOOyL所述試劑四水溶液、lOOyL所述試劑五和lOOyL所述粗酶液，充分混勻，記錄340nm處30s的吸光值AjP330s的吸光值Α2，ΔΑ=Α2-Αι ；
步驟5按照組織蛋白濃度計算尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶活性；
酶活單位定義:每毫克組織蛋白每分鐘消耗1 nmol的NADP定義為一個酶活力單位； UGP(U/mg prot)=AA^(eXd)XV^^(V#XCpr)^T=321.54X ΔΑ + Cpr;
其中，VM^=lmL，表示反應體系總體積；
ε=6.22X 103 L / mol /cm，表示NADPH的摩爾消光系數；
d=1 cm，表示比色皿光徑；
V樣=0.lmL，表示加入樣本體積；
T=5min，表示反應時間；
Cpr表示樣本蛋白濃度，單位為mg/mL。
[0021]
實施例二
步驟1儀器和用品的準備；
天平、低溫離心機、研缽、紫外分光光度計、1 mL石英比色皿；
步驟2試劑的配制