檢測脫氧核糖核酸酶的dna探針、試劑盒和方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及酶檢測領域，具體而言，涉及脫氧核糖核酸酶的檢測方法及一種脫氧 核糖核酸酶檢測DNA探針和試劑盒。
【背景技術】
[0002] 脫氧核糖核酸酶(DNase酶)普遍存在于細胞中，參與了多種生理生化過程，例如 DNA復制和修復、細胞凋亡等。其也可用作疾病的標志物，如在關節炎、腎炎患者體內，其DNA 酉每I表達水平低[Nadano，D. ;Yasuda，T. ;Kishi，K.Measurement ofdeoxyribonuclease I activity inhuman tissues and body fluids by a single radial enzyme-diffusion method.Clin.Chem.l993,39,448-452.];DNase酶也可用于疾病的治療，如DNase I可用于 治療囊性纖維瘤。
[0003] 傳統的DNase檢測方法包括高效液相色譜(HPLC)或酶聯免疫吸附試驗(ELISA)等。 然而，這些方法普遍存在靈敏度不高，檢測耗時，對儀器設備要求高等缺點。為解決上述問 題，比色法、電化學方法等技術被開發出來。比色法是基于DNase I裂解底物產生的短DNA片 段可被凝膠電泳或分光光度法檢測，該法雖然操作簡單、成本低，但靈敏度較低;在電化學 方法中，二茂鐵基寡核苷酸被用于DNA酶檢測；二茂鐵是電化學活性的信號分子(Hillier， S.C.；Frost,C.G.；Jenkins ,A.T.；Braven,H.T.；Keay,R.ff.；Flower,S.E.；Clarkson, J . M. An electrochemical study ofenzymatic oligonucleotide digestion .Bioelectrochem 2004,63,307-310 ·)，DNA酶I使二茂鐵從電極釋放，電流下降， 從而可利用伏安法檢測DNA酶I活性。該法雖能達到較低的檢測限，但其結果受電極修飾、操 作環境等影響大，難以作為一種常規的檢測技術。
[0004] 在大量的研究和生產中，需要穩定的DNA分子，即DNA分子需處于無 DNase酶或對 DNase酶含量有一定限制的環境中，因此，對脫氧核糖核酸酶殘留與否的檢測就非常重要， 特別是急需一種簡便、高靈敏、高通量的常規DNase含量檢測方法，該檢測方法可廣泛用于 檢測生物制品（如BSA)、試劑、表面環境(如實驗臺，容器、儀器表面等）中的DNase酶等，確保 研究的準確性和生產的穩定性。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的之一在于建立一種高靈敏度、高通量、簡便常規的脫氧核糖核酸酶 檢測方法，能準確地檢測不同樣本中不同脫氧核糖核酸酶的活性及含量。
[0006] 本發明的另一目的在于提供一種包含莖環結構的DNA探針，該探針可用于脫氧核 糖核酸酶定量檢測。
[0007] 本發明的另一目的在于提供脫氧核糖核酸酶檢測試劑盒。
[0008] 實現上述目的的技術方案如下。
[0009] 一種DNA探針，其包含有一個莖環結構，且2個末端或內部分別連接有能量供體基 團和能量受體基團，能量供體基團和能量受體基團之間能進行能量轉移，所述DNA探針的堿 基長度為15-50個核苷酸，且包含一個能被DNase切割的位點，被降解后的探針的能量供體 基團和能量受體基團在不同的探針片段上；
[0010] 所述莖環結構中，其莖結構包括位于探針兩端的5~15bp的回文互補序列，其環結 構包括長度為5_20nt的核苷酸序列，探針退火后形成發夾結構，兩個回文互補部分Tm值大 于 35°C。
[0011] 優選莖區至少包括1個T，2個T，3個T，4個T，5個T，6個T;和/或環區至少包括1個A、1 個C、1個T和1個G。
[0012] 在其中一個實施例中，所述DNA探針至少包括一個具脫氧核糖核酸酶抗性和/或提 高酶解特異性的修飾的核糖核苷酸。能防止DNA探針被酶降解的核苷酸修飾方式都可以，能 提高探針和酶反應的特異性修飾方式都適用本發明，優選核糖2-位修飾、磷酸骨架修飾。所 述磷酸骨架修飾具體為硫代磷酸酯修飾、二硫代磷酸酯修飾、磷酸三酯修飾等。所述核糖修 飾具體為2 ' -0-甲基核糖核苷酸、2 ' -F核糖核苷酸、2 甲氧基乙氧基核糖核苷酸、2 脫氧 核糖核苷酸、2'-0_烯丙基核糖核苷酸、2'-0_戊基核糖核苷酸或2'-0_ 丁基核糖核苷酸，更 優選為:所述DNA探針的末端的核糖核苷酸為硫代磷酸核糖核苷酸。
[0013] 在其中一個實施例中，能量供體基團為熒光基團，能量受體基團為其對應的熒光 淬滅基團。
[0014] 在其中一個實施例中，熒光基團和熒光淬滅基團選自FAM、TAMRA、HEX、CY染料、 BQH、Dabcyl〇
[0015] 在其中一個實施例中，所述DNA探針的堿基組成選自SEQ IDN0.1-SEQ IDN0.8任一 所示序列，也可以同時選擇多條堿基組成如SEQ IDN0.1-SEQ IDN0.8所示序列構成的多條 探針。
[0016] 一種脫氧核糖核酸酶的檢測試劑盒，包括有上述的DNA探針。
[0017] -種脫氧核糖核酸酶的檢測方法，該方法包括以下步驟:1)制備如上述DNA探針作 為底物;2)將樣本與步驟1)中所述底物接觸;3)PCR熒光定量檢測，檢測步驟2)接觸反應后 的底物的熒光強度。
[0018] 在其中一個實施例中，其步驟還包括在PCR熒光定量檢測前反應體系中加入緩沖 液，所述緩沖液成分包括0.01 ~5M NaCl，0.01 ~5M KCl，50mM~1M Tris-HCl，10~100mM 皿區(：12，緩沖液的?11值6.5~9.0。優選0.3-2.51似(：1，0.2-211((：1，100111]\1-800111]\11^8-!1(：1， 20mM-100mM MgCh，優選500mM NaCl，200mM KCl，500mM Tris-HCl，100mM MgCl2，pH8.0。
[0019] 檢測樣本可為試劑、水、體液或包含DNase酶的任何液體樣本或可配置為液體的樣 本。
[0020] 優選DNA探針的濃度為0 · 01pmol/ul-10pmol/ul。優選的DNase酶為DNase I， Exonuclease I。
[0021] 本發明的方法基于熒光共振能量轉移原理而建立:攜帶熒光基團和淬滅基團的寡 核苷酸發生共振能量轉移(FRET)，在加入DNA酶后，寡核苷酸底物被切割，熒光基團被釋放， 熒光強度可代表DNA酶含量。一般來說，DNase含量越高，探針被降解得越多，PCR熒光信號更 強。
[0022] 本發明所述檢測方法和檢測試劑盒的體優勢體現在：1)靈敏度高(可達0.0005U/ ul DNase I);2)特異性好（只對DNase有作用，對RNase沒有作用）；3)可高通量檢測：能同時 對大量樣本進行檢測;反應體積小，成本低，簡單快速(可在1小時完成檢測），適宜實驗室的 常規質控需求;4)可實時觀測；5)廣譜性:可檢測不同樣本中，不同脫氧核糖核酸酶的含量 和活性;6)安全:不使用任何有害化合物。
【附圖說明】
[0023]圖1實施例1中DNA探針的合成。
[0024] 圖2實施例2中DNA探針對DNase檢測結果示意圖。
[0025]圖3實施例3中DNA探針特異性檢測結果示意圖。
[0026] 圖4實施例4中DNase I濃度梯度檢測；其中，A為SEQ ID N0.7對不同濃度的DNase I進行檢測的結果示意圖；B為SEQ ID NO. 1-8對DNase I檢測靈敏度的差異比較結果示意 圖。
[0027] 圖5實施例5中對Exonuclease I濃度梯度檢測，其中，A為用SEQ ID N0.7對不同濃 度的Endonuclease I進行檢測，B為8條探針對Endonuclease I檢測靈敏度的差異的比較結 果示意圖。
[0028] 圖6實施例6中SEQ ID N0.7對商品酶的DNase活性測試的結果示意圖。
[0029] 圖7實施例7中SEQ ID N0.7對E.coli菌體裂解上清液中DNase活性的定量測定結 果示意圖，其中RFU:相對熒光單位。
【具體實施方式】
[0030] 為了便于理解本發明，下面將對本發明進行更全面的描述。本發明可以以許多不 同的形式來實現，并不限于本文所描