一種用vcam-1檢測msc促血管新生能力的方法
【技術領域】
[0001 ]本發明涉及干細胞領域,具體而言,涉及用VCAM-1 (血管細胞粘附分子-1)檢測MSC (間充質干細胞)促血管新生能力的方法。
【背景技術】
[0002] 血管內皮細胞粘附分子-l(VCAM-l),也稱為⑶106,是一種屬于免疫球蛋白超家族 的細胞表面唾液酸糖蛋白。VCAM-1有兩個亞型,具有六個或七個由選擇性剪接產生兩種形 式的VCAM-1的胞外Ig樣結構域,主要的存在形式是具有七個胞外Ig樣結構域的亞型。VCAM-1是一種內皮細胞配體,與白細胞上表達的VLA-4抗原和α4β7整合素結合,從而介導白細胞-內皮細胞粘附和信號轉導。炎癥性腸病,動脈粥樣硬化,同種異體移植物排斥,感染和哮喘 反映中內皮細胞上VCAM-1被誘導表達。在這些反映中,VCAM-1為白細胞迀移構成一個支架。 VCAM-1也可以激活內皮細胞內的信號導致的"內皮細胞門"的開啟,通過它白細胞得以迀 移。VCAM-1已經被認為是一種潛在的抗炎治療靶點,減少VCAM-1的表達將減緩動脈粥樣硬 化的發展。此外,在血管內皮細胞的VCAM-1激活的信號由細胞因子調控,這表明它在炎癥過 程中對于內皮細胞粘附分子的表達和功能是很重要的。
[0003] VCAM-1在大多數靜止內皮細胞低表達,在血管損傷、應激等情況下可被IL-1、TNF-a、IL_4等細胞因子誘導,主要表達于新生血管區。其體內的可溶形式通過介導內皮細胞趨 化而顯示血管生成活性。
[0004] 血管是人體的重要組成部分,血管生成(angiogenesis)是從已有血管發芽生成新 血管的過程,整個血管的內表面都是由一層內皮細胞所覆蓋的,血管的生成與血管內皮細 胞迀移和增殖相關。
[0005] 體內外實驗證明MSC具有治療性血管生成作用,它可以通過直接分化成內皮細胞 或者血管平滑肌細胞參與血管新生,另外它還能夠分泌多種促血管形成因子,改善微環境, 促進血管內皮細胞增殖和迀移,進而促進血管新生。
[0006] MSC的促血管新生的特性對肢體缺血的治療有著非常重要的臨床意義。但是目前 缺乏檢測和評價MSC的促血管新生能力的方法,阻礙了細胞的臨床應用。
[0007] 本發明的發明人通過研究發現,MSC的促血管新生能力中,VCAM-1表現出高度的相 關性,基于這一發現發明了本發明。
[0008] 本發明的目的在于提供一種全新的、能夠有效檢測MSC促血管新生能力的方法。
【發明內容】
[0009] 本發明的第一技術方案為,一種用VCAM-1檢測MSC促血管新生能力的方法,其特征 在于,檢測MSC中VCAM-1的蛋白含量,測定總蛋白含量,根據總蛋白中的VCAM-1的蛋白含量 百分比來檢測MSC的促血管新生能力。
[0010] 第二技術方案為,基于第一技術方案,其特征在于,所述MSC為包含VCAM-1陽性的 MSC〇
[0011] 第三技術方案為,基于第二技術方案,其特征在于,
[0012] 步驟1,將MSC和內皮細胞共培養后,檢測內皮細胞的增殖數,得到MSC促進內皮細 胞增殖率,
[0013]步驟2,測定MSC的總蛋白含量,
[0014] 步驟3,檢測MSC的VCAM-1的蛋白含量,
[0015] 步驟4,計算總蛋白中的VCAM-1的蛋白含量百分比,
[0016] 步驟5,應用統計學方法分析VCAM-1的蛋白含量百分比與步驟1中的MSC促進內皮 細胞增殖率之間的相關性,對VCAM-1的蛋白含量百分比與促血管新生能力之間的關系進行 定量。
[0017] 第四技術方案為,基于第三技術方案,其特征在于,所述內皮細胞為HUVEC細胞。
[0018] 第五技術方案為,基于第一至四中任一項技術方案,其特征在于,通過ELISA檢測 VCAM-1的蛋白含量。
[0019]第六技術方案為,基于第一至四中任一項技術方案,其特征在于,用Bradford法測 定總蛋白含量。
[0020]第七技術方案為,基于第五技術方案,其特征在于,用Bradford法測定VCAM-1的蛋 白含量。
【附圖說明】
[0021]通過閱讀下文優選實施方式的詳細描述,各種其他的優點和益處對于本領域普通 技術人員將變得清楚明了。附圖僅用于示出優選實施方式的目的,而并不認為是對本發明 的限制。而且在整個附圖中,用相同的參考符號表示相同的部件。其中在附圖中,參考數字 之后的字母標記指示多個相同的部件,當泛指這些部件時,將省略其最后的字母標記。在附 圖中:
[0022]圖1示出了不同MSC樣品的促內皮增殖率;
[0023]圖2示出了不同MSC樣品的每lg總蛋白中的VCAM-1的蛋白含量;
[0024] 圖3示出了不同MSC樣品的促內皮增殖率與VCAM-1的蛋白含量之間的相關性;
[0025] 圖4示出了激光多普勒檢測缺血下肢的血流灌注量。
【具體實施方式】
[0026] 本發明提供了許多可應用的創造性概念,該創造性概念可大量的體現于具體的上 下文中。在下述本發明的實施方式中描述的具體的實施例僅作為本發明的【具體實施方式】的 示例性說明,而不構成對本發明范圍的限制。
[0027] 以下對本發明的【具體實施方式】進行說明。
[0028]步驟(1)在transwe 11體系中培養MSC和HUVEC細胞(人臍靜脈內皮細胞),共培養后 檢測HUVEC細胞的增殖數,得到MSC促進內皮細胞增殖率。
[0029] 步驟(2)提取MSC的總蛋白,利用Bradford法測定總蛋白濃度。
[0030] 步驟(3)利用ELISA試劑盒檢測蛋白樣本中VCAM-1的含量。
[0031 ]步驟(4)計算每1 g總蛋白中的VCAM-1的蛋白含量(計算總蛋白中的VCAM-1的蛋白 含量百分比)。
[0032]步驟(5)應用統計學方法分析VCAM-1的蛋白含量與促進HUVEC增殖率之間的相關 性。
[0033]步驟(6)進行體內功能驗證實驗,確定VCAM-1對于MSC的促血管新生能力的作用。
[0034]以下通過實施例對各步驟進行詳細說明。
[0035] 實施例
[0036]步驟1.檢測樣品細胞的促內皮細胞增殖能力
[0037] 在transwell體系的下腔中種植臍靜脈內皮(HUVEC)細胞,在上腔中種植MSC細胞, 每組設定3個復孔,共培養后檢測HUVEC的增殖數。因為內皮細胞是直接形成血管的細胞,通 過樣品細胞(MSC)對內皮細胞的作用反映其促血管生成的作用。實驗中選取了 8個不同個體 來源的MSC細胞進行實驗,用于檢測的細胞均為P5代,實驗結果顯示不同的細胞均不同程度 的促進HUVEC增殖,但是存在個體差異(圖1 ),具體的數據見表一。
[0038] 表一、不同樣品細胞的促進HUVEC增殖率
[0039]
[0040] 步驟2、3、4.ELISA檢測樣品細胞的VCAM-1含量
[0041 ]收集步驟1中的8個MSC細胞樣本,裂解細胞進行總蛋白提取。利用Bradford法測定 總蛋白濃度(步驟2),利用ELI SA試劑盒檢測各個蛋白樣本中VCAM-1的含量(步驟3、4)。實驗 結果顯示MSC細胞表達VCAM-1,每lg總蛋白中的VCAM-1含量均不相同(圖2)。具體的數據見 表二。
[0042] 表二、不同樣品細胞的VCAM-1含量
[0043]
[0044」步驟5.細胞的VCAM-1含量與其促內皮
細胞增殖能力的相夫性分析
[0045] 將步驟1和3的數據進行相關性分析,結果表明細胞中VCAM-1含量高的MSC可以更 顯著的促進HUVEC增殖率。即VCAM-1含量與促進HUVEC增殖率之間具有相關性,統計學分析 表明,Pearson相關系數= 0.9222,p = 0.0031,二者之間存在顯著的正相關關系(圖3)。因此 能夠用總蛋白中的VCAM-1的蛋白含量百分比來定量和檢測MSC的促血管新生能力
[0046] 步驟6.體內驗證實驗證明VCAM-1具有促血管新生能力
[0047] 通過流式分選獲得VCAM-1陽性的MSC和VCAM-1陰性的MSC,分別標注為VCAM-1+MSC 和VCAM-1-MSC,通過建立下肢缺血動物模型,下肢缺血手術方法是阻斷動物的左下肢股靜 脈、大隱動靜脈及股動靜脈肌支的血流。造模成功后,在術肢手術部位局部注射MSC,進行細 胞移植治療,來衡量其促血管新生能力。實驗分為3組,即VCAM-1+MSC細胞治療組(1 X 106), VCAM-1-MSC細胞治療組(1 X 106),對照組(局部注射PBS)。利用激光多普勒檢測術肢的血流 灌注量,血流恢復情況,由此來評價細胞的促血管新生能力。由圖4可見,裸鼠經過下肢缺血 手術后其左后肢明顯缺血(檢測顯示為藍色、黑色),3周后對照組的術肢仍然缺血明顯,而 經過VCAM-1+MSC細胞和VCAM-1-MSC細胞治療的裸鼠下肢的血流得到恢復和改善(檢測顯示 為黃色、紅色)。由此驗證了,表達VCAM-1的MSC細胞不僅具有促血管新生能力,根據VCAM-1 含量與促進HUVEC增殖率之間的相關性,還可以應用VCAM-1來評價MSC的促血管新生能力。 尤其是VCAM-1+MSC細胞能夠更加正確的對促血管新生的能力進行檢測和評價。
[0048] 應該注意的是,上述實施例對本發明進行說明而不是對本發明進行限制,并且本 領域技術人員在不脫離所附權利要求的范圍的情況下可設計出替換實施例。在權利要求 中,不應將位于括號之間的任何參考符號構造成對權利要求的限制。單詞"包含"不排除存 在未列在權利要求中的元件或步驟。
【主權項】
1. 一種用VCAM-1檢測MSC促血管新生能力的方法,其特征在于,檢測MSC中VCAM-1的蛋 白含量,測定總蛋白含量,根據總蛋白中的VCAM-1的蛋白含量百分比來檢測MSC的促血管新 生能力。2. 根據權利要求1記載的用VCAM-1檢測MSC促血管新生能力的方法,其特征在于,所述 MSC為包含VCAM-1陽性的MSC。3. 根據權利要求2記載的用VCAM-1檢測MSC促血管新生能力的方法,其特征在于, 步驟1,將MSC和內皮細胞共培養后,檢測內皮細胞的增殖數,得到MSC促進內皮細胞增 殖率, 步驟2,測定MSC的總蛋白含量, 步驟3,檢測MSC的VCAM-1的蛋白含量, 步驟4,計算總蛋白中的VCAM-1的蛋白含量百分比, 步驟5,應用統計學方法分析VCAM-1的蛋白含量百分比與步驟1中的MSC促進內皮細胞 增殖率之間的相關性,對VCAM-1的蛋白含量百分比與促血管新生能力之間的關系進行定 量。4. 根據權利要求3記載的用VCAM-1檢測MSC促血管新生能力的方法,其特征在于,所述 內皮細胞為HUVEC細胞。5. 根據權利要求1至4中任一項記載的用VCAM-1檢測MSC促血管新生能力的方法,其特 征在于,通過ELISA檢測VCAM-1的蛋白含量。6. 根據權利要求1至4中任一項記載的用VCAM-1檢測MSC促血管新生能力的方法,其特 征在于,用Bradford法測定總蛋白含量。7. 根據權利要求5記載的用VCAM-1檢測MSC促血管新生能力的方法,其特征在于,用 Bradford法測定VCAM-1的蛋白含量。
【專利摘要】本發明公開了一種用VCAM-1檢測MSC促血管新生能力的方法,其特征在于發現了一種已知蛋白VCAM-1的新用途,通過ELISA檢測VCAM-1的蛋白表達,用Bradford法測定總蛋白含量,利用每1g總蛋白中VCAM-1的蛋白含量來反映細胞的促血管新生能力,以此方法可以對MSC的促血管新生能力進行定量。
【IPC分類】G01N33/68, C12Q1/06
【公開號】CN105483206
【申請號】CN201610007342
【發明人】梁璐, 趙欽軍, 韓之海
【申請人】北京漢氏聯合生物技術股份有限公司
【公開日】2016年4月13日
【申請日】2016年1月6日