檢測食品中蠟樣芽孢桿菌的含擴增內標的pcr方法及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種檢測食品中蠟樣芽孢桿菌的有擴增內標 的PCR方法及試劑盒。
【背景技術】
[0002] 蠟樣芽孢桿菌是一種產芽孢的革蘭氏染色陽性桿菌，在自然界中分布廣泛，常存 在于土壤、灰塵、污水中，植物和許多生熟食品中常見。目前已從多種食品種分離出該菌，包 括肉、乳制品、蔬菜、魚、土豆、糊、醬油、布丁、炒米飯以及各種甜點等。人類食用受蠟樣芽孢 桿菌污染的食物可能引起食物中毒，癥狀通常表現為惡心、嘔吐、腹瀉等胃腸道感染癥狀， 也可導致胃腸外感染，如腦膜炎、肺炎、心內膜炎和全身性感染等。我國每年都有很多因食 用受蠟樣芽孢桿菌污染的食品而導致的食物中毒事件，嚴重威脅人民群眾的生命健康。因 此，建立一種能快速檢測食品中蠟樣芽孢桿菌的檢測方法，對我國人民的公共衛生安全具 有重要意義。
[0003] 目前蠟樣芽孢桿菌的檢測方法主要有培養法、實時熒光定量PCR (real-time PCR) 方法、環介導等溫擴增技術（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)方法和酶 聯免疫吸附方法（Enzyme Linked ImmunosorbentAssay，ELISA)等。我國賭樣芽孢桿菌的 國家標準檢測方法（GB 4789. 14-2014)以及出入境檢驗檢疫行業標準（SN/T 0176-2013) 都采用的是培養法，需要經過增菌培養、分離純培養、生化鑒定等實驗過程，耗時費力特異 性不強，對于仍然具有致病性的"活的非可培養狀態"（Viable But Non-Culturable，VBNC) 的細菌敏感性較低，可能導致檢測結果呈假陰性。

【發明內容】

[0004] 鑒于上述各種方法的不足，本發明旨在克服現有技術的不足，提供一種檢測周期 短、敏感性高、特異性強、操作簡單、成本低廉、可準確地檢測食品中蠟樣芽孢桿菌的試劑盒 及方法，可在Id之內得到結果，同時無需昂貴的儀器和復雜的試劑，避免因為樣品存在DNA 聚合酶的抑制因子而得到假陰性結果，可用于多種食品中蠟樣芽孢桿菌的檢測等。
[0005] 本發明的技術解決方案是：
[0006] -種檢測食品中蠟樣芽孢桿菌的有擴增內標的PCR方法及試劑盒，其特殊之處在 于：
[0007] 該試劑盒包含：無菌去離子水，PCR反應預混液，對照品：
[0008] 所述PCR反應預混液含有PCR反應緩沖液，MgCl2，脫氧核糖核苷三磷酸，檢測用引 物，擴增內標對照Taq DNA聚合酶，DNA染料；
[0009] 所述檢測用引物為如下4條引物的混合物：
[0010] A：AAGAATCCTGATGTGAATTTTGAGG
[0011] B:CCCTTGCTACTCCGACTATAATACC
[0012] C：GGAATTCGCAGTGATCGCCGCTTGAG
[0013] D:CGCGTCGACAGCATCGCGGTTATAGG
[0014] 所述對照品分為陰性對照品和陽性對照品，陰性對照品為引物C和引物D為引物 進行PCR擴增后得到的擴增產物的重組質粒，陽性對照品為混合質粒。
[0015] 所述重組質粒的制備方法是：分別用A/B和C/D兩對引物與相應的模板DNA進行 擴增，將擴增產物回收純化后連接至PMD 19 (simple)-T載體，轉化至大腸桿菌T0P10感受 態細胞，接種至含抗生素的培養基上培養，PCR篩選陽性菌落后進行測序驗證。取經驗證后 序列正確無誤的細菌進行擴大培養，提取質粒，再把兩種質粒進行混合，作為陽性對照。
[0016] 一種檢測食品中蠟樣芽孢桿菌的有擴增內標的PCR方法，其具體操作步驟是：
[0017] (a)樣品的米集：無菌米集可疑食品；
[0018] (b)增菌培養：將采集的可疑食品混合均勻后無菌取樣25g，放入無菌研缽、組織 研磨器內研磨碎或放入均質袋內均質2min，加入無菌的LB培養基225ml，37 ± I °C振蕩培養 l〇h，得增菌液；
[0019] ((3)0嫩提取：取培養后的增菌液，振蕩混勻，取1.51111于離心管中100017^11離心 lmin，除去較大塊的食品碎片，取上清10000r/min離心10min，除去上清液，用無菌去離子 水重懸、洗絳沉淀，l〇〇〇〇r/min離心10min，棄上清，用少量無菌去離子水重懸沉淀，沸水浴 5min，冰浴5min，取上清液，得樣品模板DNA ;
[0020] (d)PCR反應管制備：PCR反應管的制備及PCR反應預混液的融化置于冰上進行。 依次取PCR反應預混液24ul、樣品模板DNA Iul加入至PCR反應管中混合均勻，制得樣品模 板DNA的PCR反應管；按樣品模板DNA的PCR反應管的制備方法依次制備陰性對照品和陽 性對照品的PCR反應管；陰性對照品的PCR反應管中的樣品模板DNA用試劑盒中的陰性對 照品代替，陽性對照品的PCR反應管中的樣品模板DNA用試劑盒中提供的陽性對照品代替； 每擴增一次都要至少有一管陰性對照和一管陽性對照。
[0021] (e)擴增檢測：將制備好的樣品模板DNA、陰性對照品、陽性對照品的PCR反應管置 于PCR儀上進行PCR擴增，得PCR擴增產物，PCR的具體反應程序為：94°C預變性4min ;94°C 變性30s，51. 2°C退火30s，72°C延伸75s，共30個循環；72°C延伸IOmin。
[0022] (f)檢測結果判定：取I. 5g瓊脂糖溶于IOOrnl電泳緩沖液中，混合均勻后煮沸，冷 卻，傾倒凝膠板；凝膠冷卻凝固后，將PCR擴增產物2-5ul加入凝膠孔中進行電泳；電泳結 束后，將凝膠放置于紫外燈下觀察，判定結果：①陽性對照的凝膠孔有2條電泳條帶而陰性 對照的凝膠孔有1條帶，則PCR反應檢測成功；②若陽性對照的凝膠孔有2條帶，陰性對照 有1條帶，被檢樣品無條帶，則說明提取的DNA中含有抑制PCR反應的因素，建議重新提取 DNA后再進行檢測；③若陰性對照有2條帶，說明PCR反應管制備過程中有交叉污染，結果 不可靠，建議重新進行PCR檢測；④陽性對照有2條帶，陰性對照有1條帶，被檢樣品的凝 膠孔只出現1條約1164bp的電泳條帶與陽性對照的凝膠孔相應條帶大小一致，則結果判斷 為陰性；⑤被檢樣品的凝膠孔出現的2條電泳條帶與陽性對照的凝膠孔中相應條帶大小一 致，陰性對照有1條帶，則判定為被檢樣品陽性。
[0023] 所LB培養基是采用胰蛋白胨10g、酵母5g、氯化鈉 IOg及蒸餾水1000ml，加熱攪拌 溶解，使用氫氧化鈉調節pH至7. 0,在121 °C高壓蒸汽滅菌20min制得。
[0024] 所述電泳的條件為電場強度5V/cm，電泳時間40min。
[0025] 本發明的有益效果：與現有的檢測方法相比，本試劑盒及檢測方法使用方便、可靠 性好、檢測周期短、靈敏度高、特異性強、成本低廉、操作步驟簡單，適用于高通量操作、標準 化操作，又能鑒別因試劑中存在PCR反應抑制成分而導致的假陰性結果，對提高食品安全 水平具有重要意義。
【附圖說明】
[0026] 圖1檢測成功的結果；
[0027] 圖2提取的DNA中有PCR抑制劑時擴增得到的結果；
[0028] 圖3 PCR反應管制備過程中有交叉污染時擴增得到的結果；
[0029] 圖4檢測樣品中蠟樣芽孢桿菌陰性時擴增得到的結果；
[0030] 圖5檢測樣品被蠟樣芽孢桿菌污染，擴增呈陽性時得到的結果。
[0031] 圖中：M-DNA分子量標準；陽-陽性對照品；陰-陰性對照品；檢-檢測的可疑樣 品。
【具體實施方式】
[0032] 實施例
[0033] 以下結合附圖實施例對本發明作進一步詳細描述。
[0034] 1.采集食品樣品，混合均勾后無菌采集25g或25ml，用無菌均質袋均質2min，與 225ml無菌營養肉湯培養基混合，置于37±1°C增菌培養8-1