一株耐受微氧和高鹽環境的銅綠假單胞菌及其在降解石油中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一株銅綠假單胞菌及其應用，尤其涉及一株耐受微氧和高鹽環境的銅 綠假單胞菌Yal及其在降解石油中的應用或在降解被石油污染的土壤或水體中的石油的 應用，屬于生物技術領域。
【背景技術】
[0002] 隨著我國石油工業的發展，石油開采力度與需求總量逐年上升。然而石油在給人 們帶來巨大經濟利益的同時，也對周邊生態環境造成了巨大的威脅。在勘察、開采、運輸以 及儲存過程中，石油所造成的土壤污染問題是一個長期存在的環境問題。目前受石油污染 的土地面積在不斷擴大，污染程度愈發嚴重，給油田以及周邊的生態環境帶來了嚴重的破 壞（2002年，Rahman等）。石油經類進入土壤后，會破壞土壤結構，分散土粒，使土壤的透 水性降低；其富含的反應基能與無機氮、磷結合并限制硝化作用和脫磷酸作用，從而使土壤 有效磷、氮的含量減少；特別是其中的多環芳烴，因有致癌、致變、致畸等活性和能通過食物 鏈在動植物體內逐級富集，從而更具危害（1985年，Bossert and Bartha;1980年，Liu)。 同時，土壤中的石油組分會污染地表水體，甚至隨著時間推移而逐步滲漏并污染地下水，并 且，石油開采過程也會產生大量含油廢水。引用被石油污染的水源進行農灌，會影響農作物 正常生長發育，降低農作物的抵抗力。而且隨著農作物的生長，石油污染物會逐漸富集，最 終影響到人類的身體健康（2002年，Abed等）。因此治理石油所造成的土壤和水體污染具 有十分重要的現實意義，也是目前環境保護領域中的研究熱點。
[0003] 目前石油污染的處理方法按其性質可分為三種，即物理方法，化學方法和生物方 法。相較而言，生物方法具有物理方法和化學方法無可比擬的優勢：首先是處理費用低，其 處理成本大約只有物化方法的三分之一；其次是修復操作簡單，可以原位進行修復；再次 生物法修復對環境的二次污染較小（2012年，Zhen-Yu W等）。但是，利用微生物降解石油 并修復石油污染的土壤與水體在實際應用中面臨自然環境的挑戰，主要表現為高鹽和微氧 等不利因素限制了部分具備高效降解石油能力的微生物的生長和繁殖，從而極大地限制了 實際應用效果（2011年，Ld)k〇wska等）。目前，對于銅綠假單胞菌在高鹽和微氧等條件下 降解石油能力的相關報道較少。從大慶油田采出液及原油污染物中分離出一株具備石油降 解能力的銅綠假單胞菌，2%鹽度培養條件對該菌的生長具有一定的促進作用，降油率可以 達到17. 4%，但是該菌株在5%鹽度及以上時僅能維持緩慢生長，降油率和降粘率大幅度 下降（2007年，郝東輝等），無法滿足和適應工業實際應用或不同地域的大規模應用。
[0004] 參考文獻：
[0005] 1. Rahman K S M, Thahira-Rahman J, Lakshmanaperumalsamy P, et al. J. Bioresource technology, 2002, 85(3):257-261.
[0006] 2. Bossert I, and Bartha R. J. Soil Science, 1985, 140 (1) : 75-77.
[0007] 3. Liu D. J. Bulletin of environmental contamination and toxicology, 1980, 25(1):616-622.
[0008] 4. Abed R Μ M, Safi NMD, Kostcr J, et al.J. Applied and Environmental Mi crobiology, 2002, 68(4):1674-1683.
[0009] 5. Zhen-Yu ff, Ying X U, Ha〇-Yun ff, et al. J. Pedosphere, 2012, 22(5) :717-725.
[0010] 6. Lcbkowska M, ZborowskaE, Karwowska E, et al. J. Ecological Engineeri ng, 2011, 37(11) :1895-1900.
[0011] 7.郝東輝，宋建蓉，王自豪，等.J.中國科技論文在線，2007, 1-8.

【發明內容】

[0012] 針對現有技術的不足，本發明要解決的問題是提供一株耐受微氧和高鹽環境的銅 綠假單胞菌Yal及其在降解石油中的應用或在降解被石油污染的土壤或水體中的石油的 應用。
[0013] 本發明的耐受微氧和高鹽環境的銅綠假單胞菌，其特征在于：所述菌株命名為銅 綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa) Yal，該菌株已于2015年9月18日保藏于"中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心"，其保藏編號為CGMCC N0. 11426。
[0014] 上述耐受微氧和高鹽環境的可降解石油的銅綠假單胞菌菌株，其生物學特征是： 細胞呈現短桿狀（見圖1)，單個，大小為（〇. 6 μ m~0. 8 μ m) X (1. 0 μ m~1. 3 μ m)，可運動； 菌落扁平無定型，向周邊擴散或略有蔓延，表面濕潤；菌落呈灰白色，周圍培養基常有水溶 性色素擴散；可在以石油為唯一碳源的無機鹽固體培養基上培養時能夠降解石油，同時產 生降解圈（見圖2)。生理生化特征是：革蘭氏染色陰性，微好氧，化能異養菌，發酵葡萄糖產 酸產氣，過氧化氫酶試驗、甲基紅試驗和明膠水解試驗呈現陽性，抗酸染色試驗、吲哚試驗、 VP試驗、淀粉水解試驗呈現陰性。最適生長溫度為28~37°C，最適合生長pH值為6. 5~ 7. 5。生理生化實驗結果詳見表1，與銅綠假單胞菌模式菌株相比完全一致。
[0015] 表1 :Yal菌株（CGMCC N0. 11426)與銅綠假單胞菌標準菌株的生理生化特征比較
[0017] 注：" + "表示菌株陽性；表示菌株陰性。
[0018] *:東秀珠、蔡妙英等，常見細菌系統鑒定手冊，科學出版社，2001，第一版， p364_398〇
[0019] 上述用于菌體形態觀察的液體培養基組成：每1000ml去離子水中含有胰蛋白胨 17g，大豆蛋白胨3g，氯化鈉5g，磷酸氫二鉀2. 5g，葡萄糖2. 5g，并調節pH 7. 5。
[0020] 上述用于菌體形態觀察的固體培養基組成：每1000ml去離子水中含有胰蛋白胨 17g，大豆蛋白胨3g，氯化鈉5g，磷酸氫二鉀2. 5g，葡萄糖2. 5g，瓊脂粉15g，并調節pH 7. 5。
[0021] 上述形態特征觀測的實驗方法參考東秀珠、蔡妙英等編著的《常見細菌系統鑒定 手冊》，科學出版社，2001，第一版，p353-363。
[0022] 上述生理生化試驗培養基及實驗方法參考東秀珠、蔡妙英等編著的《常見細菌系 統鑒定手冊》，科學出版社，2001，第一版，p364-398。
[0023] 對本發明所述銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa) YalCGMCC N0. 11426測定 16S rRNA的基因序列的結果顯示，其基因序列長度為1396bp，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。
[0024] 通過使用美國生物工程信息中心（National Center for Biotechnology Information, NCBI)BLASTN程序比對，發現本發明的Yal菌株16S rRNA的基因序列與 NCBI注冊的多株銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa) 16S rRNA的基因序列具有高 度同源性（>97% )，個別菌株的相似性甚至更高，可以確定Yal菌株是一株銅綠假單胞 菌（Pseudomonas aeruginosa)。選取同源性比較高的典型銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)的16S rRNA基因序列作為參比對象；采用鄰近法（Neighbour-Joining)運用 Mega 5軟件構建Yal菌株與參比菌株之間的系統進化樹，選用Bacillus licheniformis作 為外群分支，結果見附圖3。
[0025] 本發明所述的耐受微氧和高鹽環境的銅綠假單胞菌Yal菌種的選育方法是：
[0026] 將采集到的石油污染的土壤樣品用無菌生理鹽水溶解，振蕩混勻制成土壤懸液， 梯度稀釋后涂布到以石油為唯一碳源的無機鹽固體培養基平板上，30°C條件下靜置培養， 至有明顯的石油降解圈出現，挑取石油降解圈較大的菌落，劃線轉接到固體培養基上，30°C 條件下靜置培養，至有明顯的單菌落產生，經兩次純化后，得到耐受微氧和高鹽環境的銅綠 假單胞菌菌種，編號Yal，甘油凍藏保菌。該菌株已于2015年9月18日保藏于"中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中心"，其保藏編號為CGMCC N0. 11426。
[0027] 本發明所述耐受微氧和高鹽環境的銅綠假單胞菌在降解石油中的應用或在降解 被石油污染的土壤或水體中的石油的應用。
[0028] 其中：所述耐受微氧和高鹽環境的銅綠假單胞菌在營養培養基上能實現細胞的快 速繁殖和擴增，在含石油培養基上能實現對石油的充分降解；其培養溫度為28~37°C，搖 床培養轉速為180~220rpm。
[0029] 本發明所述耐受微氧和高鹽環境的銅綠假單胞菌降解被石油污染的土壤或水體 中的石油的微氧條件是氧氣濃度為2%~6% ;降解溫度優選為30~35°C。
[0030] 本發明所述耐受微氧和高鹽環境的銅綠假單胞菌在降解被石油污染的土壤或水 體中的石油的過程中，其耐受總鹽量是0. 5%~5%。
[0031] 本發明所述的耐受微氧和高鹽環境的銅綠假單胞菌Yal在2%~6%的微氧條件 下可以正常生長。
[0032] 檢測該菌株對微氧耐受性的方法及步驟是：
[0033] (1)菌種選擇：選用本發明所述銅綠假單胞菌Yal (CGMCC N0. 11426);
[0034] (2)斜面培養活化：將菌種接種于斜面培養基，28~37°C條件下，靜置培養20~ 40小時，備用；
[0035] (3)種子培養：將步驟（2)培養的菌株，在無菌條件下用接種環接1~2環于40~ 50mL(25