復合納米微球固相萃取小柱及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于分析化學中與蛋白質組學相關的材料富集技術領域，涉及一種介孔Si02/Ti02納米復合材料的制備方法，主要用于磷酸化蛋白的選擇性富集和檢測，富集后的樣品進行質譜檢測，從而大大提高對磷酸化蛋白的檢測靈敏度。
【背景技術】
[0002]磷酸化是一個共價磷酸基團可逆結合到一個或者多個氨基酸，這是細胞調控機制中最常見的蛋白質修飾。在生物學理論研宄中，磷酸化作用是調節和控制蛋白質活力和功能最基本、最普遍，也是最重要的機制，參與多種細胞監管功能，如控制細胞周期、信號傳導、分化、增殖、改造和新陳代謝作用；在醫藥學臨床實踐中，磷酸化蛋白起著誘導內皮細胞的增殖、減少細胞凋亡、增加腦組織缺氧耐受性、促進血管生成等重要醫療作用，參與各類疾病的臨床研宄，如腫瘤的研宄以及新的藥物靶標的發現等。磷酸化蛋白質組學的研宄是促進其生物學理論與醫學應用緊密結合的橋梁。因此，檢測被修飾的磷酸化蛋白，對深入研宄其細胞調控機制并將其運用至各類頑疾的調查研發具有極為重要的意義。
[0003]為了分析蛋白的磷酸化作用，已有研宄者用蛋白酶消解蛋白，將所得的肽片段直接通過質譜技術分析D [參見:(a)Pinkse，M.W.H.;Uitto，P.M.;Hilhorst，M.J.;Ooms，Β.;Heck，A.J.R.Anal.Chem.2004，76，3935-3943.(b) Yue，G.E.;Roper，M.G.;Balchunas，C.;Pulsipher，A.;Coon，J.J.；Shabanowitz? J.;Hunt，D.F.；Landers? J.P.;Ferrance，J.P.Anal.Chim.Acta 2006，564，116-122.]目前該方法遇到許多問題:一，，由于消化后的肽混合物過于復雜，磷酸化一般以亞化學計量方式發生，因此非磷酸化肽的豐度要比磷酸化肽高得多；二，用于檢測磷酸化肽的質譜分析技術靈敏度低；三，在低壽命的質譜條件下，磷酸根離子的離子化效率在檢測方面變得更低。可見，目前的質譜分析技術對于磷酸化肽的檢測較為困難。為了解決檢測磷酸化肽的各種困難，各種技術都在向磷酸化肽的富集方向發展。[參見:(a) Leitner，A.Trends Anal.Chem.2010，29，177-185.(b)Dunn，J.D.;Reid，G.E.;Bruening，M.L Mass Spectrom.Rev.2010，29，29-54.(c) Rogers，L D.;Foster，L.J.Mo 1.B1syst.2009，5，1122-1129.(d)Han，G.;Ye，M.;Zou，H.Analyst 2008，133，1128-1138.(30)Mamone? G.;Picariello，G.;Ferranti，P.;Addeo，F.Proteomics2010，10，380-393.]
[0004]目前，以共價或非共價相互作用為基礎的磷酸化肽富集方法在各項研究中使用。磷酸化肽在固定的金屬磷酸鹽離子對的相互作用下，通過結合螯合金屬離子采用金屬離子親和層析法(IMAC)[參見:(a) Andersson? L ;Porath，J.Anal.B1chem.1986，154，250-254.(b)Posewitz，M.C.;Tempst，P.Anal.Chem.1999，71，2883-2892.]。在金屬氧化物和磷酸基團之間的相互作用下，金屬氧化物親和層析(M0AC，例如，二氧化鈦、氧化,告)也被用于磷酸化肽的富集[參見:(a) Larsen，KR.；Thingholm? Τ.Ε.；Jensen? 0.N.；Roepstorff，P.; Jorgensen，Τ.J.D.Mol.Cell.Proteomics 2005，4，873-886.(b)Kweon，H.K.;Hakansson，K.Anal.Chem.2006，78，1743-1749.]。雖有報道各種富集方法，但到目前為止，未曾有報道采用相關功能化介孔Si02/Ti02復合納米材料實現選擇性富集。

【發明內容】

[0005]為了克服上述現有技術的不足，本發明提供了一種基于功能化介孔Si02/Ti0^合納米微球的固相萃取小柱及其制備方法，能夠用于富集生物體液以及復雜基質中的磷酸化肽。
[0006]技術方案:一種功能化介孔Si02/Ti0^合納米微球的固相萃取小柱，所述的固相萃取柱的基質為功能化的介孔S12Zt12復合納米微球，介孔S1 2納米微球直徑為50?150nm，平均孔徑為4?5nm，介孔S12納米微球表面附著T1 2納米球，T12納米球直徑為3?5nm ;固相萃取柱空管容積為100 μ L?lmL，填裝高度為0.2?0.5cm,空管材質為聚烯烴。
[0007]制備所述的功能化介孔Si02/Ti0；^合納米微球的方法，由原始介孔S12納米微球經胺基化修飾、T12納米球經羧基化修飾，然后通過酰胺反應所得，共價化學修飾按以下步驟進行:
[0008](I)介孔S12納米微球表面胺基化:在無水乙醇溶劑中加入介孔S12納米微球和3-氨丙基三乙氧基硅烷(APS)，介孔S12納米微球與APS的質量比為2:1?1: 5，介孔S1^米微球的質量濃度為2mg/mL?20mg/mL，混合后通N 2半小時以排出空氣，然后在攪拌作用下于50?90°C條件下反應5?24小時，反應完成后離心分離5min，轉速為9000轉/min，用乙醇洗滌沉淀物，離心產物真空干燥，得干燥后的胺基化的介孔Si02m米微球；
[0009](2)T12納米球表面羧基化:在二氯甲烷溶劑中加入制備得到的T1 2納米球及3-巰基丙酸(MPA)，1102納米球和MPA的質量比為20:1?4: 1，T1 2納米球的質量濃度為2mg/mL?20mg/mL，混合后通N2半小時以排出空氣，然后在攪拌作用下于10?40°C條件下反應0.5?2小時，反應完成后離心分離5min，轉速為9000轉/min，用乙醇洗滌沉淀物，離心產物真空干燥，得干燥后的羧基化的打02納米球。
[0010](3)功能化介孔Si02/Ti02復合納米微球的制備:在水溶液中加入制備得到的介孔S12納米微球和T12納米球以及交聯劑1-乙基-(3- 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、琥珀酰亞胺(NHS)，Si02/Ti0,量比為4:1?3: 1，S1 2與EDC、NHS質量比為(20?5):1: 1，介孔S12納米球的質量濃度為2mg/mL?20mg/mL，混合后通1半小時以排出空氣，然后在攪拌作用下于10?40°C條件下反應0.5?2小時，反應完成后離心分離5min，轉速為9000轉/min，用乙醇洗滌沉淀物，離心產物真空干燥，得功能化介孔Si02/Ti02復合納米微球。
[0011]所述的一種功能化介孔3102/1102復合納米微球的固相萃取小柱，制備方法為:
[0012](I)將一片多孔性聚乙烯下篩板放入固相萃取柱空管的底部，聚乙烯篩板孔徑為5 ?20 μ m ;
[0013](2)將相當于固相萃取柱空管容積三分之一到三分之二的功能化介孔Si02/Ti02復合納米微球干法填裝入柱內；
[0014](3)在填裝的功能化介孔3;102/1102復合納米微球上放入另一片多孔性聚乙稀上篩板，聚乙烯篩板孔徑為5?20 μ m，壓緊填料使填裝柱高度保持在0.2?0.5cm,制備得到固相萃取小柱。
[0015]所述介孔Si02/Ti02復合納米微球固相萃取小柱用于富集的步驟包括:在進行富集之前，首先用(5?20)mL甲醇、乙腈或者相應的緩沖溶液活化介孔Si02/Ti02復合納米微球，然后在負壓驅動下使樣品溶液流過柱子，采用適量體積清洗液洗去基體的雜質，使用合適的洗脫液把分析物洗脫收集到容器中，然后進行分析。
[0016]與現有的固相富集小柱相比，本發明所提供的功能化介孔Si02/Ti02復合納米微球固相萃取小柱具有以下優點:
[0017](I)環境友好:本發明的介孔型Si02/Ti02納米復合材料本身是環境友好的，并且在制備過程中，步驟簡單，只需消耗少量的有機溶劑，不會引入其他有毒有害物質；
[0018](2)穩定性好，可再生和重復利用。吸附在介孔型Si02/Ti02納米復合材料上的目標物能容易地用少量有機溶劑洗脫下來，鍵合的官能團不會被破壞，可以重復利用。
[0019](3) 二氧化硅被胺功能化可固定磷酸化多肽基團，而二氧化鈦通過螯合金屬離子捕獲、富集。本發明是由經胺基化修飾后的二氧化硅納米顆粒與經羧基化修飾后的二氧化鈦納米顆粒，通過酰胺化作用結合，從而制得對磷酸化蛋白具有多重富集作用的納米復合型材料；
[0020](4)在完成發明的過程中，選擇酪蛋白作為研宄目標物，對所述固相萃取小柱的各項性能指標進行了反復測試。結果表明對于上述樣品中的磷酸化多肽的加標回收率均能達到92% -105%，解吸過程簡單，2mL的乙腈或者其鹽溶液就可將上述物質洗脫下來，實驗結束后，將固相萃取小柱用乙腈、甲醇各5mL依次洗滌，無需其他操作，即可重復使用。
【附圖說明】
[0021]圖1為功能化多孔硫化鋅納米微球固相萃取柱示意圖，圖中為:固相萃取柱管1、上篩板2、下篩板3、功能化介孔Si02/Ti02復合納米微球填料4 ;
[0022]圖2為合成得到的介孔型S12納米微球透射電鏡圖A(TEM)，T1 2納米球透射電鏡圖B以及復合后的介孔型Si02/Ti02納米復合材料透射電鏡圖C ；
[0023]圖3為Si02、T12、介孔型Si02/Ti02m米復合材料的FT-1R表征圖；
[0024]圖4為本發明的固相萃取小柱富集后的酪蛋白的質譜圖；
[0025]圖5為β -酪蛋白沒有經過富集的標準質譜圖。
【具體實施方式】
[0026]以下通過實施例形式，對本發明的上述內容再作進一步的詳細說明，但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實例，凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范圍。
[0027]下面結合附圖，通過具體實施例對本發明進一步詳述。
[0028]實施例1:功能化介孔Si02/Ti02復合納米微球填料的制備
[0029]實驗材料:十六烷基三甲基溴化銨，批號為J1315062，購自上海阿拉丁試劑有限公司；油酸鈉，批號為20120920，購自國藥集團化學試劑有限公司；鈦酸正四丁酯，批號為:20140121，購自上海阿拉丁試劑有限公司;1，3，5-三甲苯，批號為:11329044，購自上海阿拉丁試劑有限公司；硅酸四乙酯，批號為:L1306074，購自上海阿拉丁試劑有限公司；2，5-二羥基苯甲酸，批號為J1312017，購自南京化學試劑有限公司；3_巰基丙酸，批號為:38194，購自上海阿拉丁試劑有限公司；胰蛋白酶(1:250)，批號為20130929，上海阿拉丁試劑有限公司；β-酪蛋白，批號為SLBK9882V，上海阿拉丁試劑有限公司；3_氨基丙基三乙氧基硅烷(APS)，批號Κ1220037，上海阿拉丁試劑有限公司；1_乙基_(3_ 二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)，批號090M14531V，上海阿拉丁試劑有限公司；琥珀酰亞胺(NHS)，批號MKBG7914V，上海阿拉丁試劑有限公司。
[0030]實驗儀器及設備:圓底燒瓶、KQ-500DE超聲波清洗器、聚四氟乙烯反應釜、DHG-9143BS電熱鼓風干燥箱、DF-101S磁力加熱攪拌器、AY120電子分析天平、TGL-16C離心機。
[0031]實驗過程:
[0032](l)Si02m米微球的制備
[0033]將3.5ml的2mol/L氫氧化鈉溶液和480ml離子水混合于大燒杯中，依次加入1.0g十