本發明(ming)屬于(yu)微生物(wu)合成生物(wu)學(xue)領域，具(ju)體涉及(ji)一種利用(yong)植(zhi)物(wu)維生素c合成途徑構(gou)建大(da)腸(chang)桿菌菌株合成維生素c的方法(fa)。

背景技術：

維生(sheng)素c（簡寫(xie)vc），又名抗壞血酸(suan)，是一(yi)(yi)種水(shui)溶性維生(sheng)素。人(ren)類(lei)(lei)、猿猴(hou)、天竺(zhu)鼠(shu)和一(yi)(yi)些魚(yu)類(lei)(lei)、鳥類(lei)(lei)無法自行合成(cheng)維生(sheng)素c，需通過(guo)食(shi)物來(lai)供應(ying)身體(ti)(ti)所(suo)需。vc是一(yi)(yi)種必需維生(sheng)素，參(can)與(yu)膠原蛋白的合成(cheng)，可(ke)預(yu)防動脈硬化；vc是一(yi)(yi)種強抗氧化劑，具有(you)保(bao)護細胞、解(jie)毒和保(bao)護肝臟作用；vc還(huan)可(ke)用于增強肌體(ti)(ti)免疫力(li)，預(yu)防感(gan)冒等(deng)(deng)急(ji)、慢(man)性傳染病，還(huan)可(ke)用于病后(hou)恢(hui)復期(qi)、創傷(shang)愈(yu)合期(qi)及過(guo)敏性疾病的輔助治療，vc缺乏引起(qi)壞血病，造成(cheng)牙齦萎縮(suo)、出(chu)血等(deng)(deng)等(deng)(deng)病癥(zheng)。人(ren)類(lei)(lei)vc的主要食(shi)物來(lai)源：柑(gan)桔類(lei)(lei)水(shui)果、蔬菜(cai)等(deng)(deng)。食(shi)物中的vc能被(bei)人(ren)體(ti)(ti)小腸(chang)吸收(shou)，分布(bu)到體(ti)(ti)內所(suo)有(you)的水(shui)溶性結構中，普通成(cheng)人(ren)體(ti)(ti)內vc代謝活(huo)性池中vc量(liang)1500mg左右(you)。

維生(sheng)素(su)c主(zhu)要應用在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)制藥(yao)、保健品、軟飲(yin)料及(ji)飼料添(tian)加等領(ling)域，主(zhu)要消費市場在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)歐美(mei)(mei)等發達國(guo)(guo)(guo)(guo)家。目前，全球(qiu)vc市場需(xu)求量約12萬噸。我國(guo)(guo)(guo)(guo)是(shi)(shi)全球(qiu)最(zui)大(da)的(de)(de)c生(sheng)產(chan)(chan)國(guo)(guo)(guo)(guo)和(he)出(chu)口(kou)國(guo)(guo)(guo)(guo)，每年(nian)出(chu)口(kou)超過(guo)10億美(mei)(mei)元。但(dan)是(shi)(shi)，每當人(ren)們提到vc產(chan)(chan)業(ye)，自然就會聯(lian)想(xiang)到無情的(de)(de)價(jia)格戰，以羅氏(roche)為主(zhu)的(de)(de)跨國(guo)(guo)(guo)(guo)公司試圖擠(ji)垮中(zhong)國(guo)(guo)(guo)(guo)的(de)(de)vc企業(ye)，從1996年(nian)至2001年(nian)，出(chu)現兩次降價(jia)狂潮，使vc價(jia)格從12美(mei)(mei)元/kg降到2001年(nian)的(de)(de)2.8美(mei)(mei)元/kg，使我國(guo)(guo)(guo)(guo)20多家企業(ye)被迫(po)停產(chan)(chan)。在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)幾(ji)輪競(jing)爭中(zhong)，由于中(zhong)國(guo)(guo)(guo)(guo)企業(ye)首創“兩步(bu)發酵(jiao)法(fa)”生(sheng)產(chan)(chan)vc核心技(ji)術，在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)人(ren)力等成(cheng)(cheng)本(ben)(ben)上也(ye)有明(ming)顯(xian)競(jing)爭優勢(shi)，保住了(le)vc產(chan)(chan)業(ye)的(de)(de)一席之(zhi)地，使國(guo)(guo)(guo)(guo)內企業(ye)與roche(dsm)和(he)basf形(xing)成(cheng)(cheng)了(le)三足(zu)鼎立之(zhi)勢(shi)。但(dan)是(shi)(shi)vc產(chan)(chan)業(ye)化技(ji)術的(de)(de)研(yan)發工作(zuo)并沒有停息(xi)，如：eastman與genencor合(he)(he)作(zuo)開發的(de)(de)生(sheng)化觸媒法(fa)，即(ji)用多個(ge)酶(mei)進行多步(bu)轉(zhuan)化，從玉米制造維生(sheng)素(su)c。其他國(guo)(guo)(guo)(guo)際大(da)廠也(ye)都(dou)在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)不斷(duan)降低制造成(cheng)(cheng)本(ben)(ben)，如巴斯夫除(chu)了(le)致力于將目前的(de)(de)制造工藝(yi)進行優化外，也(ye)在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)開發或(huo)引進新(xin)的(de)(de)低成(cheng)(cheng)本(ben)(ben)制造工藝(yi)。目前，歐美(mei)(mei)廠商目前都(dou)在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)積極探索(suo)vc新(xin)的(de)(de)合(he)(he)成(cheng)(cheng)路徑。國(guo)(guo)(guo)(guo)內在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)“二步(bu)發酵(jiao)法(fa)”生(sheng)產(chan)(chan)vc研(yan)究和(he)應用領(ling)域均處(chu)于世(shi)界領(ling)先水平，但(dan)新(xin)的(de)(de)途徑研(yan)究投入不足(zu)，在(zai)(zai)(zai)(zai)(zai)細菌“一步(bu)發酵(jiao)法(fa)”合(he)(he)成(cheng)(cheng)vc研(yan)究領(ling)域已經處(chu)于明(ming)顯(xian)劣勢(shi)。

在二步發酵法中，依次在d-山梨醇脫氫酶(sldh)、l-山梨糖脫氫酶(sdh)及l-山梨酮脫氫酶(sndh)的作用下，可以有效地將d-山梨醇轉化為維生素c的前體物質2-klg（尹光琳等，微生物學報，1980，20(3)，246-251）。細菌山梨醇“一步發酵法”研發工作走在最前列的首推dsm，取得一系列領先成果，包括葡糖桿菌gluconobacteroxydansdsm17078全部kga代(dai)謝密(mi)切相關的(de)(de)(de)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(l-山(shan)(shan)梨酮(tong)脫氫(qing)酶(mei)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)、d-山(shan)(shan)梨醇脫氫(qing)酶(mei)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)，以(yi)及(ji)l-山(shan)(shan)梨糖脫氫(qing)酶(mei)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)a、b、c、d)的(de)(de)(de)分(fen)離(li)克(ke)隆（usptopatent，20110250636），及(ji)以(yi)上基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)敲除或過表達(da)對(dui)kga生(sheng)物合成(cheng)(cheng)的(de)(de)(de)影(ying)響(xiang)；糖轉運蛋白基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)sts24和sts01的(de)(de)(de)敲除或過表達(da)對(dui)kga生(sheng)物合成(cheng)(cheng)的(de)(de)(de)影(ying)響(xiang)（unitedstatespatent5437989）；pqq生(sheng)物合成(cheng)(cheng)基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)對(dui)kga合成(cheng)(cheng)的(de)(de)(de)影(ying)響(xiang)（yuan等(deng)bmcbiotechnology，2016,16，1-14）；以(yi)及(ji)其他基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)(vcs01和vcs08等(deng))對(dui)kga合成(cheng)(cheng)的(de)(de)(de)影(ying)響(xiang)（europeanpatentapplicationep1103603）。此外(wai)，還嘗(chang)試了(le)多(duo)種技術手段對(dui)葡(pu)糖桿(gan)菌(jun)(jun)進行基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)改良，取得了(le)理想的(de)(de)(de)研究效果。申報相關國際發明專利30多(duo)項，專利覆蓋了(le)50多(duo)個細菌(jun)(jun)相關基(ji)(ji)因(yin)(yin)(yin)(yin)以(yi)及(ji)10多(duo)個細菌(jun)(jun)種類的(de)(de)(de)利用，包括大腸桿(gan)菌(jun)(jun)、假單胞菌(jun)(jun)、泛菌(jun)(jun)、谷氨(an)酸棒桿(gan)菌(jun)(jun)、普(pu)通酮(tong)古龍(long)酸菌(jun)(jun)、氧(yang)化葡(pu)萄糖酸桿(gan)菌(jun)(jun)、醋細菌(jun)(jun)和葡(pu)糖醋桿(gan)菌(jun)(jun)等(deng)。

大(da)部分(fen)(fen)的(de)(de)(de)(de)(de)植(zhi)(zhi)(zhi)物(wu)(wu)(wu)(wu)和(he)動物(wu)(wu)(wu)(wu)都可以通(tong)過(guo)(guo)一(yi)(yi)系列(lie)的(de)(de)(de)(de)(de)酶(mei)(mei)促(cu)反應轉化(hua)(hua)(hua)d-葡萄糖合成(cheng)(cheng)(cheng)維(wei)(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)素(su)(su)c。在(zai)(zai)(zai)真核生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)物(wu)(wu)(wu)(wu)中(zhong)，維(wei)(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)素(su)(su)c可以通(tong)過(guo)(guo)兩個不(bu)(bu)同的(de)(de)(de)(de)(de)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)化(hua)(hua)(hua)途(tu)徑(jing)合成(cheng)(cheng)(cheng)。在(zai)(zai)(zai)鼠類及(ji)其(qi)它(ta)的(de)(de)(de)(de)(de)哺(bu)乳(ru)動物(wu)(wu)(wu)(wu)中(zhong)，葡萄糖通(tong)過(guo)(guo)一(yi)(yi)個復(fu)雜途(tu)徑(jing)轉化(hua)(hua)(hua)成(cheng)(cheng)(cheng)l-古洛糖酸(suan)-1,4-內酯。這一(yi)(yi)途(tu)徑(jing)是由終端酶(mei)(mei)l-古洛糖酸(suan)-1,4-內酯氧(yang)化(hua)(hua)(hua)酶(mei)(mei)在(zai)(zai)(zai)動物(wu)(wu)(wu)(wu)界中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)普遍存(cun)(cun)在(zai)(zai)(zai)推斷而來的(de)(de)(de)(de)(de)。而在(zai)(zai)(zai)人類及(ji)其(qi)它(ta)一(yi)(yi)些動物(wu)(wu)(wu)(wu)中(zhong)，編碼l-古洛糖酸(suan)-1,4-內酯氧(yang)化(hua)(hua)(hua)酶(mei)(mei)的(de)(de)(de)(de)(de)基因發(fa)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)了突變(bian)，造(zao)成(cheng)(cheng)(cheng)其(qi)合成(cheng)(cheng)(cheng)維(wei)(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)素(su)(su)c能力的(de)(de)(de)(de)(de)喪失。大(da)多(duo)數的(de)(de)(de)(de)(de)植(zhi)(zhi)(zhi)物(wu)(wu)(wu)(wu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)都有(you)大(da)量維(wei)(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)素(su)(su)c的(de)(de)(de)(de)(de)合成(cheng)(cheng)(cheng)，它(ta)在(zai)(zai)(zai)過(guo)(guo)氧(yang)化(hua)(hua)(hua)物(wu)(wu)(wu)(wu)、臭氧(yang)及(ji)自(zi)由基的(de)(de)(de)(de)(de)解毒方面起著至關重要的(de)(de)(de)(de)(de)作用(yong)。另外(wai)，維(wei)(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)素(su)(su)c在(zai)(zai)(zai)通(tong)過(guo)(guo)水溶性(xing)抗氧(yang)化(hua)(hua)(hua)劑(α-生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)育酚)、玉米(mi)黃質和(he)ph介導的(de)(de)(de)(de)(de)psii活性(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)再生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)調節光(guang)合作用(yong)活性(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)過(guo)(guo)程中(zhong)是必不(bu)(bu)可少的(de)(de)(de)(de)(de)。植(zhi)(zhi)(zhi)物(wu)(wu)(wu)(wu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)可以積累大(da)量的(de)(de)(de)(de)(de)維(wei)(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)素(su)(su)c，特別(bie)是在(zai)(zai)(zai)綠色組(zu)織和(he)貯藏器官中(zhong)。因為在(zai)(zai)(zai)植(zhi)(zhi)(zhi)物(wu)(wu)(wu)(wu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)存(cun)(cun)在(zai)(zai)(zai)由d-半乳(ru)糖生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)成(cheng)(cheng)(cheng)維(wei)(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)素(su)(su)c的(de)(de)(de)(de)(de)完(wan)整合成(cheng)(cheng)(cheng)途(tu)徑(jing)，目前研究人員已經開(kai)始(shi)嘗試(shi)利用(yong)植(zhi)(zhi)(zhi)物(wu)(wu)(wu)(wu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)或微藻(zao)(zao)培養物(wu)(wu)(wu)(wu)通(tong)過(guo)(guo)發(fa)酵(jiao)(jiao)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)產(chan)(chan)維(wei)(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)素(su)(su)c。據報(bao)道，running等人分(fen)(fen)離得(de)(de)到的(de)(de)(de)(de)(de)小球藻(zao)(zao)突變(bian)體產(chan)(chan)維(wei)(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)素(su)(su)c的(de)(de)(de)(de)(de)產(chan)(chan)量從0.64mg/g干細(xi)(xi)胞(bao)(bao)提高到45mg/g細(xi)(xi)胞(bao)(bao)（journalofappliedphycology，1994,6(2)，99-104），但是這與(yu)工(gong)業上采用(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)經典(dian)二步(bu)發(fa)酵(jiao)(jiao)法的(de)(de)(de)(de)(de)高產(chan)(chan)量尚無競(jing)爭性(xing)。進(jin)一(yi)(yi)步(bu)提高利用(yong)植(zhi)(zhi)(zhi)物(wu)(wu)(wu)(wu)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)或藻(zao)(zao)類一(yi)(yi)步(bu)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)產(chan)(chan)維(wei)(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)素(su)(su)c的(de)(de)(de)(de)(de)產(chan)(chan)量需要進(jin)行系統的(de)(de)(de)(de)(de)代謝工(gong)程改(gai)(gai)造(zao)，然(ran)而植(zhi)(zhi)(zhi)物(wu)(wu)(wu)(wu)中(zhong)維(wei)(wei)(wei)生(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)(sheng)素(su)(su)c合成(cheng)(cheng)(cheng)途(tu)徑(jing)的(de)(de)(de)(de)(de)研究進(jin)展非(fei)常緩慢使(shi)得(de)(de)代謝工(gong)程改(gai)(gai)造(zao)很難操作。

植(zhi)(zhi)物中初始(shi)的(de)(de)(de)(de)維生(sheng)素c合(he)(he)成(cheng)模型是(shi)根據動物中的(de)(de)(de)(de)合(he)(he)成(cheng)機(ji)理建(jian)立(li)的(de)(de)(de)(de)。然(ran)而(er)，植(zhi)(zhi)物細胞中是(shi)不含l-古(gu)洛糖(tang)酸-1,4-內酯氧化酶的(de)(de)(de)(de)，多年來一直(zhi)未得到植(zhi)(zhi)物中維生(sheng)素c合(he)(he)成(cheng)途徑的(de)(de)(de)(de)直(zhi)接證據，直(zhi)到后(hou)來利(li)用擬(ni)南芥中影(ying)響維生(sheng)素c生(sheng)物合(he)(he)成(cheng)突變體的(de)(de)(de)(de)鑒定(ding)，提出了(le)經過gdp-甘露糖(tang)和l-半(ban)乳糖(tang)的(de)(de)(de)(de)維生(sheng)素c從頭合(he)(he)成(cheng)途徑。在隨后(hou)的(de)(de)(de)(de)幾年間(jian)，研究(jiu)者提出了(le)植(zhi)(zhi)物細胞中還可能存在一些其它的(de)(de)(de)(de)維生(sheng)素c合(he)(he)成(cheng)途徑，但目前對這(zhe)些新(xin)合(he)(he)成(cheng)途徑的(de)(de)(de)(de)認識比較有限。

植物細胞中(zhong)維生(sheng)(sheng)素(su)c從(cong)葡(pu)萄糖(tang)(tang)(tang)(tang)開始合(he)成(cheng)(cheng)(cheng)(cheng)途(tu)徑(jing)涉及10個酶(mei)(mei)，擬(ni)南芥中(zhong)這10個酶(mei)(mei)包括：athxk1、atpgi、atdin9、atpmm、atvtc1、atgme、atvtc2、atvtc4、atgaldh和atgldh（conklin，genetics，2000,154，847-856）。葡(pu)萄糖(tang)(tang)(tang)(tang)在(zai)己(ji)糖(tang)(tang)(tang)(tang)激酶(mei)(mei)hxk催(cui)化(hua)(hua)下(xia)轉(zhuan)化(hua)(hua)為(wei)葡(pu)萄糖(tang)(tang)(tang)(tang)-6-磷(lin)酸(suan)(suan)，再經(jing)磷(lin)酸(suan)(suan)葡(pu)萄糖(tang)(tang)(tang)(tang)異(yi)構(gou)(gou)酶(mei)(mei)pgi轉(zhuan)化(hua)(hua)為(wei)果糖(tang)(tang)(tang)(tang)-6-磷(lin)酸(suan)(suan)，磷(lin)酸(suan)(suan)甘(gan)(gan)(gan)露(lu)(lu)糖(tang)(tang)(tang)(tang)異(yi)構(gou)(gou)酶(mei)(mei)（pmi或din9）將(jiang)果糖(tang)(tang)(tang)(tang)-6-磷(lin)酸(suan)(suan)轉(zhuan)化(hua)(hua)為(wei)d-甘(gan)(gan)(gan)露(lu)(lu)糖(tang)(tang)(tang)(tang)-6-磷(lin)酸(suan)(suan)，在(zai)甘(gan)(gan)(gan)露(lu)(lu)糖(tang)(tang)(tang)(tang)變位酶(mei)(mei)（pmm）催(cui)化(hua)(hua)下(xia)轉(zhuan)化(hua)(hua)為(wei)d-甘(gan)(gan)(gan)露(lu)(lu)糖(tang)(tang)(tang)(tang)-1-磷(lin)酸(suan)(suan)，進一步(bu)經(jing)過gdp-甘(gan)(gan)(gan)露(lu)(lu)糖(tang)(tang)(tang)(tang)焦磷(lin)酸(suan)(suan)化(hua)(hua)酶(mei)(mei)（vtc1）催(cui)化(hua)(hua)形成(cheng)(cheng)(cheng)(cheng)gdp-d-甘(gan)(gan)(gan)露(lu)(lu)糖(tang)(tang)(tang)(tang)，再經(jing)過gdp-甘(gan)(gan)(gan)露(lu)(lu)糖(tang)(tang)(tang)(tang)-3’5’異(yi)構(gou)(gou)酶(mei)(mei)（gme）作用下(xia)合(he)成(cheng)(cheng)(cheng)(cheng)gdp-l-半(ban)(ban)(ban)(ban)(ban)乳(ru)(ru)(ru)糖(tang)(tang)(tang)(tang)。gdp-l-半(ban)(ban)(ban)(ban)(ban)乳(ru)(ru)(ru)糖(tang)(tang)(tang)(tang)通過半(ban)(ban)(ban)(ban)(ban)乳(ru)(ru)(ru)糖(tang)(tang)(tang)(tang)途(tu)徑(jing)合(he)成(cheng)(cheng)(cheng)(cheng)vc，其中(zhong)需(xu)要gdp-l-半(ban)(ban)(ban)(ban)(ban)乳(ru)(ru)(ru)糖(tang)(tang)(tang)(tang)磷(lin)酸(suan)(suan)化(hua)(hua)酶(mei)(mei)（vtc2）將(jiang)gdp-l-半(ban)(ban)(ban)(ban)(ban)乳(ru)(ru)(ru)糖(tang)(tang)(tang)(tang)轉(zhuan)化(hua)(hua)為(wei)l-甘(gan)(gan)(gan)露(lu)(lu)糖(tang)(tang)(tang)(tang)-1-磷(lin)酸(suan)(suan)，l-半(ban)(ban)(ban)(ban)(ban)乳(ru)(ru)(ru)糖(tang)(tang)(tang)(tang)-1-磷(lin)酸(suan)(suan)酯(zhi)酶(mei)(mei)（vtc4）將(jiang)l-甘(gan)(gan)(gan)露(lu)(lu)糖(tang)(tang)(tang)(tang)-1-磷(lin)酸(suan)(suan)轉(zhuan)化(hua)(hua)為(wei)l-半(ban)(ban)(ban)(ban)(ban)乳(ru)(ru)(ru)糖(tang)(tang)(tang)(tang)，l-半(ban)(ban)(ban)(ban)(ban)乳(ru)(ru)(ru)糖(tang)(tang)(tang)(tang)脫氫(qing)酶(mei)(mei)（galdh）將(jiang)l-半(ban)(ban)(ban)(ban)(ban)乳(ru)(ru)(ru)糖(tang)(tang)(tang)(tang)轉(zhuan)化(hua)(hua)為(wei)l-半(ban)(ban)(ban)(ban)(ban)乳(ru)(ru)(ru)糖(tang)(tang)(tang)(tang)-1，4-內(nei)酯(zhi)，最后在(zai)l-半(ban)(ban)(ban)(ban)(ban)乳(ru)(ru)(ru)糖(tang)(tang)(tang)(tang)-1，4-內(nei)酯(zhi)脫氫(qing)酶(mei)(mei)（gldh）作用下(xia)合(he)成(cheng)(cheng)(cheng)(cheng)維生(sheng)(sheng)素(su)c。植物中(zhong)維生(sheng)(sheng)素(su)c合(he)成(cheng)(cheng)(cheng)(cheng)途(tu)徑(jing)的發(fa)(fa)現使得(de)實現由(you)葡(pu)萄糖(tang)(tang)(tang)(tang)、淀粉或者(zhe)纖維素(su)直接發(fa)(fa)酵(jiao)生(sheng)(sheng)產維生(sheng)(sheng)素(su)c成(cheng)(cheng)(cheng)(cheng)為(wei)可能(neng)。

技術實現要素：

本發明的目的在(zai)于(yu)提供一(yi)種利(li)用大(da)(da)腸(chang)桿菌(jun)生產維(wei)生素(su)c的方法，該方法通過將植物維(wei)生素(su)c合成(cheng)途(tu)徑中的11個基(ji)因轉化到大(da)(da)腸(chang)桿菌(jun)中，使(shi)大(da)(da)腸(chang)桿菌(jun)能夠(gou)直接利(li)用葡萄糖為(wei)(wei)碳源，轉化為(wei)(wei)維(wei)生素(su)c。

為達到上述目的，本(ben)發明(ming)的技術(shu)方(fang)案(an)是。

一(yi)種利用植物的(de)維(wei)生素c合(he)(he)成(cheng)途徑創制一(yi)步(bu)發酵(jiao)合(he)(he)成(cheng)維(wei)生素c大(da)(da)腸桿(gan)菌(jun)菌(jun)株的(de)方法：將(jiang)植物的(de)維(wei)生素c合(he)(he)成(cheng)的(de)基因構建(jian)多(duo)基因單順(shun)反子組(zu)成(cheng)的(de)原核表達載(zai)體；將(jiang)所(suo)述原核表達載(zai)體轉化(hua)到大(da)(da)腸桿(gan)菌(jun)中。

優選地，所述植物的維生(sheng)素c合成的基因來源于草莓。

優(you)選地，所述植物的(de)(de)維生(sheng)素c合成的(de)(de)基因通過(guo)多基因定(ding)點突變(bian)方法消(xiao)除了基因中常用的(de)(de)限制性內切酶位點。這些(xie)位點包括ecori、sali、bamhi、kpni,xbai、saci和hindiii。

優選(xuan)地，多基(ji)因單(dan)順反子組成的(de)原核表達載(zai)體由(you)t7表達系統組成，11個改(gai)造的(de)維生素c合成基(ji)因全(quan)部使用t7啟(qi)動(dong)子和終止子控制，構建基(ji)因表達元件。

所(suo)述維生素c合(he)(he)成的(de)(de)原核表達(da)載(zai)(zai)(zai)體(ti)(ti)的(de)(de)構建方法為：利(li)用改良的(de)(de)“重疊延伸(shen)pcr技(ji)術(shu)”構建維生素c合(he)(he)成所(suo)有11個基(ji)因(yin)的(de)(de)表達(da)盒。在pcambia-1301載(zai)(zai)(zai)體(ti)(ti)的(de)(de)基(ji)礎上，通過在ecori和(he)(he)hindiii限制性內切酶(mei)切點(dian)間(jian)(jian)插(cha)入(ru)的(de)(de)多克隆位點(dian)片段，可(ke)以構成多基(ji)因(yin)表達(da)單元，該載(zai)(zai)(zai)體(ti)(ti)的(de)(de)ecori和(he)(he)sali，sali和(he)(he)bamhi，bamhi和(he)(he)kpni,kpni和(he)(he)xbai,xbai和(he)(he)hindiii限制性內切酶(mei)切點(dian)之間(jian)(jian)均可(ke)以插(cha)入(ru)基(ji)因(yin)表達(da)盒，從而構成多基(ji)因(yin)表達(da)載(zai)(zai)(zai)體(ti)(ti)。

所述構建的大(da)腸(chang)桿菌表達載體pyb2130通過(guo)電擊法導入到(dao)大(da)腸(chang)桿菌中。

優選地(di)，所(suo)(suo)述大腸桿菌包括bl21（de3）等(deng)所(suo)(suo)有(you)含有(you)t7rna聚合酶的菌株。

本發(fa)明的有益(yi)效果如下。

1，當大腸桿菌獲得植物的維(wei)生(sheng)素c合成(cheng)(cheng)基因后能夠合成(cheng)(cheng)維(wei)生(sheng)素c。

2，通過(guo)本(ben)發明構建的(de)大腸桿菌菌株可以直接(jie)將葡萄糖(tang)轉化(hua)為維生素c。

3，該套體系操作簡單，避免了使用兩步(bu)發酵過程的麻煩。

附圖說明

圖1為本發明實施例中構建(jian)的維生(sheng)素c原(yuan)核表達載(zai)體pyb2130。

圖(tu)2為本(ben)發明實(shi)施例中大腸桿菌發酵后檢測。

具體實施方式

以下(xia)實施(shi)例中涉(she)及(ji)的構建維生素c合成原核表(biao)達載(zai)體pyb2130，其具體的構建方法如下(xia)。

草莓果實總rna，cdna合成(cheng)試劑盒(he)為clontech公(gong)(gong)司(si)產品(pin)；dna柱回收試劑盒(he)購(gou)置(zhi)amersham公(gong)(gong)司(si)；試劑rna抽提(ti)試劑盒(he)rneasyplantminikit為qiagen公(gong)(gong)司(si)產品(pin)；各種(zhong)限制性內(nei)切(qie)酶和t4dnaligase均購(gou)自上海takara公(gong)(gong)司(si)。總rna采用qiagen公(gong)(gong)司(si)的rneasyplantminikit提(ti)取。

取約50μl草莓草莓果實總rna進行(xing)cdna合成，cdna的合成按clontech公(gong)司smartcdnalibraryconstructionkit說(shuo)明書(shu)操(cao)作(zuo)進行(xing)第一鏈合成。

1、構建改造的(de)草莓己糖磷酸激酶基因（fvhxk1）。

從草莓中克隆己糖磷酸激(ji)酶(mei)基因并利用定(ding)點突變方法將90位(wei)(wei)(wei)xhoi限(xian)制性(xing)(xing)(xing)內切(qie)酶(mei)位(wei)(wei)(wei)點；229位(wei)(wei)(wei)hindiii限(xian)制性(xing)(xing)(xing)內切(qie)酶(mei)位(wei)(wei)(wei)點；632位(wei)(wei)(wei)saci限(xian)制性(xing)(xing)(xing)內切(qie)酶(mei)位(wei)(wei)(wei)點；720位(wei)(wei)(wei)kpni限(xian)制性(xing)(xing)(xing)內切(qie)酶(mei)位(wei)(wei)(wei)點；935和(he)1148位(wei)(wei)(wei)bgii限(xian)制性(xing)(xing)(xing)內切(qie)酶(mei)位(wei)(wei)(wei)點；1238位(wei)(wei)(wei)bamhi限(xian)制性(xing)(xing)(xing)內切(qie)酶(mei)位(wei)(wei)(wei)點；1342位(wei)(wei)(wei)ecori限(xian)制性(xing)(xing)(xing)內切(qie)酶(mei)位(wei)(wei)(wei)點消(xiao)除。

以合(he)成的cdna第一鏈為模板，擴增引物：hxk1:atggggaaggtggcggtgggt（seqidno.1所示(shi)(shi)），hxk2:ttaggagtcctcgacaccaag（seqidno.2所示(shi)(shi)）。pcr反應條件：98℃預變(bian)性3min；94℃變(bian)性30s，60℃退(tui)火(huo)30s，72℃延伸90s，30個循環；72℃保溫10min。pcr結(jie)束后(hou)，采用酚：氯仿(fang)抽提，再(zai)加入(ru)2倍體積(ji)的無水乙醇進行沉(chen)淀。沉(chen)淀用30μl水溶解，取1μl為模板。

90位xhoi限制性內切酶位突變引物(wu)：90z：gagattgaaaagcttgagga（seqidno.3所示(shi)）；90f：tcctcaagcttttcaatctc（seqidno.4所示(shi)）。

229位hindiii限制性內切酶位突變引物：229z：agcaagcctaagatgctcatcag（seqidno.5所示）；229f：ctgatgagcatcttaggcttgct（seqidno.6所示）。

632位saci限制性內切(qie)酶位突(tu)變引物：632z：cagagttcaccaaatcagtgga（seqidno.7所示）；632f：tccactgatttggtgaactctg（seqidno.8所示）。

720位(wei)kpni限(xian)制性內(nei)切(qie)酶位(wei)突變(bian)引(yin)物(wu)：720z：aggtaacacaatccgcatgt（seqidno.9所示）；720f：acatgcggattgtgttacct（seqidno.10所示）。

935位bglii限制性內(nei)切酶位突(tu)變引物：935z：agaactttgagaagattatttc（seqidno.11所示）；935f：gaaataatcttctcaaagttct（seqidno.12所示）。

1148位(wei)(wei)bglii限制性內切酶位(wei)(wei)突變引物(wu)：1148z：gaaggatatcttagagacct（seqidno.13所示）；1148f：aggtctctaagatatccttc（seqidno.14所示）。

1238位bamhi限制性內切酶位突變引(yin)物：1238z：ctgggattctgggagtcctta（seqidno.15所(suo)示）；1238f：taaggactcccagaatcccag（seqidno.16所(suo)示）。

以引物(wu)hxk1和(he)90f；90z和(he)229f；229z和(he)632f；632z和(he)720f；720z和(he)935f；935z和(he)1148f；1148z和(he)1238f；1238z和(he)hxk2進行pcr擴(kuo)增，擴(kuo)增條(tiao)件(jian)為(wei)：94℃預熱(re)1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min。共25個循環，pcr結束后，dna片(pian)斷用(yong)10%丙烯(xi)酰(xian)胺膠回(hui)收(shou)(shou)，將(jiang)上述8個回(hui)收(shou)(shou)片(pian)斷取10-100ng為(wei)模板混合(he)，以hxk1和(he)hxk2為(wei)引物(wu)將(jiang)上述片(pian)斷拼接，擴(kuo)增條(tiao)件(jian)為(wei)：94℃預熱(re)1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，2min。共25個循環。pcr結束后，dna柱回(hui)收(shou)(shou)pcr片(pian)斷。將(jiang)片(pian)段進行ta克隆，獲得(de)質(zhi)粒t1，并將(jiang)質(zhi)粒t1高效轉化到大腸桿菌dh5α感受態細胞中(zhong)。

2、構(gou)建改造的草莓己(ji)糖磷酸異構(gou)酶（pgi）基(ji)因fvpgi。

從(cong)草莓(mei)中克隆草莓(mei)己糖磷酸異構酶(mei)并(bing)利用定(ding)點(dian)突(tu)變方法將264位(wei)xbai限制性(xing)內(nei)(nei)切(qie)酶(mei)位(wei)點(dian)；293位(wei)saci限制性(xing)內(nei)(nei)切(qie)酶(mei)位(wei)點(dian)；1126位(wei)bamhi限制性(xing)內(nei)(nei)切(qie)酶(mei)位(wei)點(dian)；1294位(wei)sphi限制性(xing)內(nei)(nei)切(qie)酶(mei)位(wei)點(dian)；1504位(wei)bgii限制性(xing)內(nei)(nei)切(qie)酶(mei)位(wei)點(dian)消除。

擴增引物為：pgi1:5’-atggcatctatctctggtatctgttc-3’（seqidno.17所示）pgi2:5’-taggagtacagtgcatcgacgttg-3’（seqidno.18所示）。pcr反應(ying)條(tiao)件：98℃預變(bian)性(xing)3min；94℃變(bian)性(xing)30s，60℃退火30s，72℃延伸120s，30個(ge)循環；72℃保溫(wen)10min。pcr結(jie)束后，采(cai)用酚：氯仿抽(chou)提，再加入2倍體積的無水乙醇進行沉淀。沉淀用30μl水溶解，取1μl為模板。

264位(wei)xbai和293位(wei)saci限制性內切酶(mei)位(wei)突變(bian)引物：264z：tcttgactggctgtaccagcacaaggagttcg（seqidno.19所示(shi)）；264f：cgaactccttgtgctggtacagccagtcaaga（seqidno.20所示(shi)）。

1126位(wei)bamhi限制性內切(qie)酶位(wei)突變引物：1126z：ggaaccaaggatatggttgttct（seqidno.21所(suo)示）；1126f：agaacaaccatatccttggttcc（seqidno.22所(suo)示）。

1294位(wei)sphi限制性內切(qie)酶位(wei)突變引物：1294z：ggagcacggatcagcttgca（seqidno.23所示(shi)）；1294f：tgcaagctgatccgtgctcc（seqidno.24所示(shi)）。

1504位bglii限制性內(nei)切酶位突變引物：1504z：gaagaagtaacacctagaact（seqidno.25所(suo)示）；1504f：agttctaggtgttacttcttc（seqidno.26所(suo)示）。

以引(yin)(yin)物pgi1和(he)(he)(he)264f；264z和(he)(he)(he)1126f；1126z和(he)(he)(he)1294f；1294z和(he)(he)(he)1504f；1504z和(he)(he)(he)pgi2進行pcr擴(kuo)增(zeng)，擴(kuo)增(zeng)條件(jian)(jian)為(wei)(wei)：94℃預(yu)熱1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min。共25個(ge)循(xun)環，pcr結束后，dna片(pian)斷用10%丙烯酰胺膠(jiao)回收(shou)，將上述8個(ge)回收(shou)片(pian)斷取10-100ng為(wei)(wei)模板混合(he)，以pgi1和(he)(he)(he)pgi2為(wei)(wei)引(yin)(yin)物將上述片(pian)斷拼接(jie)，擴(kuo)增(zeng)條件(jian)(jian)為(wei)(wei)：94℃預(yu)熱1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，2min。共25個(ge)循(xun)環。pcr結束后，dna柱(zhu)回收(shou)pcr片(pian)斷。將片(pian)段進行ta克(ke)隆，獲得質粒t2，并將質粒t2高效轉化到大(da)腸桿菌dh5α感受態細胞中。

3、構(gou)建改造的草(cao)莓磷酸甘露糖異構(gou)酶(mei)（pmi）基因(yin)fvpmi。

從草莓(mei)中克隆(long)甘露糖(tang)異構酶(mei)(mei)基(ji)因并利用定點突變方(fang)法(fa)將817位(wei)(wei)hindiii限制性(xing)內(nei)切酶(mei)(mei)位(wei)(wei)點；1038位(wei)(wei)kpni限制性(xing)內(nei)切酶(mei)(mei)位(wei)(wei)點；1110和1221位(wei)(wei)psti限制性(xing)內(nei)切酶(mei)(mei)位(wei)(wei)點消除(chu)。

以合成的(de)cdna第一鏈為(wei)模板(ban)，擴增引物為(wei)：pmi1:5’-atggagaagtccatgatcgagaagtc-3’（seqidno.27所(suo)示(shi)）pmi2:5’-ttatggcagctggaagaacatggagt-3’（seqidno.28所(suo)示(shi)）。pcr反應條(tiao)件：98℃預變性3min；94℃變性30s，60℃退火(huo)30s，72℃延伸90s，30個(ge)循環(huan)；72℃保溫10min。pcr結束(shu)后，采用(yong)酚：氯仿(fang)抽提，再加(jia)入(ru)2倍體積的(de)無水乙醇進行沉淀。沉淀用(yong)30μl水溶解，取1μl為(wei)模板(ban)。

817位hindiii限制性內切酶位突變(bian)引物：817z：ctcaactatgtcaaggtt（seqidno.29所示(shi)）；817f：aaccttgacatagttgag（seqidno.30所示(shi)）。

1038位kpni和1110位psti限(xian)制性內切酶(mei)位突變引物(wu)：1038z：ggttcctcccaccttttgacgagtttgaggtcgatcggtgccatcttccccagggagaatcagtggaatttcctgaag（seqidno.31所示）；1038f：cttcaggaaattccactgattctccctggggaagatggcaccgatcgacctcaaactcgtcaaaaggtgggaggaacc（seqidno.32所示）。

1221位psti限(xian)制性內切酶位突變(bian)引物：1221z：cttttcgtgcctgaaggt（seqidno.33所示）；1221f：accttcaggcacgaaaag（seqidno.34所示）。

以(yi)引物(wu)pmi1和(he)817f；817z和(he)1038f；1038z和(he)1221f；1221z和(he)720f；720z和(he)935f；935z和(he)1148f；1148z和(he)1238f；1238z和(he)pmi2進(jin)行(xing)pcr擴(kuo)增(zeng)，擴(kuo)增(zeng)條(tiao)件(jian)為：94℃預熱1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min。共25個循(xun)環，pcr結束后，dna片(pian)斷(duan)用(yong)10%丙(bing)烯酰(xian)胺膠回收，將上述(shu)(shu)8個回收片(pian)斷(duan)取(qu)10-100ng為模(mo)板混合，以(yi)pmi1和(he)pmi2為引物(wu)將上述(shu)(shu)片(pian)斷(duan)拼(pin)接，擴(kuo)增(zeng)條(tiao)件(jian)為：94℃預熱1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，2min。共25個循(xun)環。pcr結束后，dna柱回收pcr片(pian)斷(duan)。將片(pian)段進(jin)行(xing)ta克隆，獲得(de)質粒(li)t3，并將質粒(li)t3高效(xiao)轉化到大腸桿(gan)菌dh5α感受態細(xi)胞中。

4、構建改(gai)造的草莓磷酸甘露糖變位酶（pmm）基因fvpmm。

從草(cao)莓中克隆磷酸甘(gan)露(lu)糖變(bian)位(wei)酶(mei)(mei)基因并利用定點(dian)突變(bian)方法將(jiang)139位(wei)bamhi限制(zhi)性內切酶(mei)(mei)位(wei)點(dian)；537位(wei)hindiii限制(zhi)性內切酶(mei)(mei)位(wei)點(dian)消除。

以合成的cdna第一鏈為(wei)模(mo)板，擴增引物為(wei)：pmm1:5’-atggctgtcatgaagcctggtgtc-3’（seqidno.35所(suo)(suo)示）pmm2:5’-ttaggaagagaagaacagagccttaac-3’（seqidno.36所(suo)(suo)示）。pcr反應條件：98℃預變性3min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，30個循(xun)環；72℃保溫10min。pcr結束后，采用酚：氯仿抽提，再(zai)加入2倍體積(ji)的無水(shui)乙醇進行沉(chen)淀。沉(chen)淀用30μl水(shui)溶(rong)解，取1μl為(wei)模(mo)板。

139位(wei)(wei)bamhi限制性內切酶位(wei)(wei)突變引物(wu)：139z：cagtgggcattgttggaggaacc（seqidno.37所示(shi)）；139f：ggttcctccaacaatgcccactg（seqidno.38所示(shi)）。

537位hindiii限(xian)制性內切酶位突變(bian)引物：537z：gatatgctttgatgtttttcctc（seqidno.39所(suo)(suo)示(shi)）；537f：gaggaaaaacatcaaagcatatc（seqidno.40所(suo)(suo)示(shi)）。

以引(yin)物pmm1和(he)(he)139f；139z和(he)(he)537f；537z和(he)(he)pmm2進行(xing)pcr擴(kuo)增，擴(kuo)增條件為(wei)：94℃預熱(re)1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min。共25個循(xun)環，pcr結束后，dna片(pian)(pian)斷用(yong)10%丙烯酰胺(an)膠回收，將(jiang)(jiang)上(shang)述8個回收片(pian)(pian)斷取10-100ng為(wei)模板混合，以pmm1和(he)(he)pmm2為(wei)引(yin)物將(jiang)(jiang)上(shang)述片(pian)(pian)斷拼接(jie)，擴(kuo)增條件為(wei)：94℃預熱(re)1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，2min。共25個循(xun)環。pcr結束后，dna柱回收pcr片(pian)(pian)斷。將(jiang)(jiang)片(pian)(pian)段進行(xing)ta克隆，獲得質粒(li)t4，并(bing)將(jiang)(jiang)質粒(li)t4高效轉(zhuan)化到大腸桿菌dh5α感受態細胞中。

5、構建改造的草莓gdp-d-甘露(lu)糖焦磷酸(suan)化酶(mei)（gmpase，vtc1）基因fvvtc。

從草莓(mei)中克(ke)隆gdp-d-甘露糖焦磷(lin)酸(suan)化酶(mei)基(ji)因并利(li)用定點突變方法將367位ecori限制(zhi)性內(nei)切酶(mei)位點；904位sphi限制(zhi)性內(nei)切酶(mei)位點消除。

以合成的(de)cdna第一鏈為模(mo)板，擴增引物為：vtc1z:5’-atgaaggcactgattctggtcggt-3’（seqidno.41所(suo)示(shi)）vtc1f:5’-ttacatgacgatctcaggcttc-3’（seqidno.42所(suo)示(shi)）。pcr反(fan)應條件：98℃預變性3min；94℃變性30s，60℃退火(huo)30s，72℃延(yan)伸60s，30個循(xun)環；72℃保溫(wen)10min。pcr結束后，采用酚(fen)：氯仿(fang)抽提，再加入2倍體(ti)積的(de)無水乙(yi)醇進行沉(chen)淀。沉(chen)淀用30μl水溶解，取1μl為模(mo)板。

367位ecori限(xian)制性內(nei)切酶位突(tu)變引物：367z：tggattccataaatcccatg（seqidno.43所示）；367f：catgggatttatggaatcca（seqidno.44所示）。

904位sphi限制性內(nei)切酶位突變引物：904z：tcggatcaagaagcttgcttg（seqidno.45所(suo)示）；904f：caagcaagcttcttgatccga（seqidno.46所(suo)示）。

以引(yin)物(wu)vtc1z和(he)367f；367z和(he)904f；904z和(he)vtc1f進行pcr擴增(zeng)，擴增(zeng)條(tiao)件(jian)(jian)為：94℃預熱1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min。共(gong)25個循環，pcr結束(shu)后(hou)，dna片(pian)斷(duan)(duan)用(yong)10%丙烯酰胺膠回(hui)收，將(jiang)上述(shu)(shu)8個回(hui)收片(pian)斷(duan)(duan)取10-100ng為模板混合，以vtc1z和(he)vtc1f為引(yin)物(wu)將(jiang)上述(shu)(shu)片(pian)斷(duan)(duan)拼(pin)接，擴增(zeng)條(tiao)件(jian)(jian)為：94℃預熱1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，2min。共(gong)25個循環。pcr結束(shu)后(hou)，dna柱回(hui)收pcr片(pian)斷(duan)(duan)。將(jiang)片(pian)段(duan)進行ta克隆，獲得質(zhi)粒t5，并將(jiang)質(zhi)粒t5高效(xiao)轉(zhuan)化到大腸桿菌dh5α感(gan)受態細胞中(zhong)。

6、構建改造的(de)草莓gdp-d-甘(gan)露糖-3，5-表異構酶（gme）fvgme。

從草莓(mei)中克隆gdp-d-甘露(lu)糖-3，5-表(biao)異構(gou)酶基(ji)因并利(li)用(yong)定點突變方法將(jiang)217位(wei)ecori限(xian)制(zhi)性內切酶位(wei)點；667位(wei)psti限(xian)制(zhi)性內切酶位(wei)點消除。

以合成(cheng)的(de)cdna第一(yi)鏈為(wei)(wei)模板，擴增引(yin)物為(wei)(wei)：gme1:5’-atgggttctgctggtgagtctg-3’（seqidno.47所(suo)示(shi)）gme2:5’-ttactccttaccatcagcagcac-3’（seqidno.48所(suo)示(shi)）。pcr反應條(tiao)件(jian)：98℃預變性3min；94℃變性30s，60℃退(tui)火30s，72℃延伸60s，30個循環；72℃保溫(wen)10min。pcr結束后，采(cai)用酚(fen)：氯仿(fang)抽提(ti)，再加入2倍體積的(de)無水(shui)乙醇進行沉淀。沉淀用30μl水(shui)溶解，取(qu)1μl為(wei)(wei)模板。

217位ecori限(xian)制性內(nei)切酶(mei)位突變引(yin)物：217z：gagttccatcttgtggatctcag（seqidno.49所示）；217f：ctgagatccacaagatggaactc（seqidno.50所示）。

667位(wei)(wei)psti限制(zhi)性(xing)內切酶位(wei)(wei)突(tu)變引物(wu)：667z：ctgaagaaaggctctcacatccac（seqidno.51所(suo)示）；667f：gtggatgtgagagcctttcttcag（seqidno.52所(suo)示）。

以引物gme1和217f；217z和667f；667z和gme2進行pcr擴增(zeng)，擴增(zeng)條(tiao)件(jian)為(wei)(wei)：94℃預熱1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min。共25個(ge)循(xun)環，pcr結(jie)束(shu)后，dna片斷(duan)(duan)(duan)用10%丙(bing)烯酰胺膠回(hui)(hui)收(shou)(shou)，將上(shang)述8個(ge)回(hui)(hui)收(shou)(shou)片斷(duan)(duan)(duan)取10-100ng為(wei)(wei)模板混(hun)合，以gme1和gme2為(wei)(wei)引物將上(shang)述片斷(duan)(duan)(duan)拼接，擴增(zeng)條(tiao)件(jian)為(wei)(wei)：94℃預熱1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，2min。共25個(ge)循(xun)環。pcr結(jie)束(shu)后，dna柱回(hui)(hui)收(shou)(shou)pcr片斷(duan)(duan)(duan)。將片段進行ta克隆，獲得質粒t6，并將質粒t6高效轉化到大(da)腸桿菌dh5α感受態細胞(bao)中。

7、構建改造(zao)的(de)草莓gdp-l-半乳糖磷(lin)酸化酶（ggp，vtc2）基因(yin)fvvtc2。

從草(cao)莓中克隆gdp-l-半乳糖磷酸化酶(mei)(mei)基因并利用定點(dian)突(tu)變方法將258位(wei)(wei)sphi限制性(xing)(xing)(xing)內切(qie)酶(mei)(mei)位(wei)(wei)點(dian)；624位(wei)(wei)hindiii限制性(xing)(xing)(xing)內切(qie)酶(mei)(mei)位(wei)(wei)點(dian)；1070位(wei)(wei)ndei限制性(xing)(xing)(xing)內切(qie)酶(mei)(mei)位(wei)(wei)點(dian)；1236位(wei)(wei)bamhi限制性(xing)(xing)(xing)內切(qie)酶(mei)(mei)位(wei)(wei)點(dian)；1337位(wei)(wei)psti限制性(xing)(xing)(xing)內切(qie)酶(mei)(mei)位(wei)(wei)點(dian)消除。

以合成的(de)cdna第(di)一鏈為(wei)模(mo)(mo)板，擴(kuo)增引(yin)物為(wei)：vtc2z:5’-atgatgctgaagatcaagcgtg-3’（seqidno.53所(suo)示）；vtc2f:5’-ttactggagaaccagacactcct-3’（seqidno.54所(suo)示）。pcr反應條件：98℃預變性3min；94℃變性30s，60℃退(tui)火30s，72℃延伸90s，30個循環；72℃保溫10min。pcr結束后(hou)，采用(yong)酚：氯仿(fang)抽(chou)提，再(zai)加入(ru)2倍(bei)體(ti)積(ji)的(de)無水(shui)乙醇進行沉淀。沉淀用(yong)30μl水(shui)溶解(jie)，取(qu)1μl為(wei)模(mo)(mo)板。

258位sphi限制性內切酶位突變引物：258z：gcttgcagaaagggctatttc（seqidno.55所示(shi)）；258f：gaaatagccctttctgcaagc（seqidno.56所示(shi)）。

624位hindiii限(xian)制(zhi)性內切酶(mei)位突(tu)變引(yin)物：624z：gaaaccttcttgcttgcacttc（seqidno.57所(suo)示）；624f：gaagtgcaagcaagaaggtttc（seqidno.58所(suo)示）。

1070位ndei限(xian)制性內切酶位突變引物(wu)：1070z：caccacatgtccactaatttc（seqidno.59所(suo)示）；1070f：gaaattagtggacatgtggtg（seqidno.60所(suo)示）。

1236位(wei)kpni限(xian)制(zhi)性內切(qie)酶位(wei)突變引物(wu)：1236z：gaggaaccagatgtcaatcctc（seqidno.61所示）；1236f：gaggattgacatctggttcctc（seqidno.62所示）。

以(yi)引物vtc2z和258f；258z和624f；624z和1070f；1070z和1236f；1236z和vtc2f進行(xing)pcr擴(kuo)(kuo)增(zeng)，擴(kuo)(kuo)增(zeng)條件(jian)為：94℃預熱1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min。共25個循(xun)環，pcr結束后，dna片(pian)(pian)斷(duan)(duan)用10%丙烯(xi)酰胺膠回(hui)收(shou)(shou)，將上(shang)(shang)述8個回(hui)收(shou)(shou)片(pian)(pian)斷(duan)(duan)取10-100ng為模板混合，以(yi)vtc2z和vtc2f為引物將上(shang)(shang)述片(pian)(pian)斷(duan)(duan)拼接，擴(kuo)(kuo)增(zeng)條件(jian)為：94℃預熱1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，2min。共25個循(xun)環。pcr結束后，dna柱回(hui)收(shou)(shou)pcr片(pian)(pian)斷(duan)(duan)。將片(pian)(pian)段進行(xing)ta克隆，獲得質粒t7，并將質粒t7高效轉化到(dao)大(da)腸桿菌(jun)dh5α感受態細(xi)胞中。

8、構(gou)建改造的(de)草莓(mei)l-半乳糖-1-磷(lin)酸(suan)酶（gpp，vtc4）基因fvvtc4。

從(cong)草莓(mei)中克(ke)隆l-半(ban)乳糖-1-磷酸酶(mei)基因并利用定點突變方(fang)法將(jiang)42位psti限制性(xing)內(nei)切酶(mei)位點；161位saci限制性(xing)內(nei)切酶(mei)位點；270位bamhi限制性(xing)內(nei)切酶(mei)位點消除(chu)。

以合(he)成(cheng)的(de)cdna第(di)一鏈為模(mo)板，擴增(zeng)引物：vtc4z:atggctgaaaatgattcgcttgctctgttcttggcctctgcagt（seqidno.63所(suo)示），vtc4f:ttaggagtcctcgacaccaag（seqidno.64所(suo)示）。pcr反應(ying)條件：98℃預變(bian)性3min；94℃變(bian)性30s，60℃退火30s，72℃延伸90s，30個循環；72℃保(bao)溫(wen)10min。pcr結(jie)束后，采用酚：氯仿抽提，再加入(ru)2倍體(ti)積的(de)無水乙醇進行沉淀。沉淀用30μl水溶解(jie)，取1μl為模(mo)板。

161位saci限(xian)制性內切酶位突變(bian)引(yin)物：161z：gagttcatatttaatcatctca（seqidno.65所(suo)示(shi)(shi)）；161f：tgagatgattaaatatgaactc（seqidno.66所(suo)示(shi)(shi)）。

270位(wei)bamhi限制(zhi)性內切酶位(wei)突變引物：270z：gtggaacccctggatggcac（seqidno.67所示）；270f：gtgccatccaggggttccac（seqidno.68所示）。

以(yi)引物(wu)vtc4z和(he)161f；161z和(he)270f；270z和(he)vtc4f進行(xing)pcr擴增(zeng)，擴增(zeng)條件(jian)為：94℃預(yu)熱(re)1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min。共(gong)25個(ge)循環，pcr結束后(hou)，dna片(pian)斷(duan)用10%丙(bing)烯酰(xian)胺(an)膠(jiao)回(hui)收，將(jiang)上述(shu)(shu)8個(ge)回(hui)收片(pian)斷(duan)取10-100ng為模板混合(he)，以(yi)vtc4z和(he)vtc4f為引物(wu)將(jiang)上述(shu)(shu)片(pian)斷(duan)拼接，擴增(zeng)條件(jian)為：94℃預(yu)熱(re)1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，2min。共(gong)25個(ge)循環。

pcr結束(shu)后(hou)，dna柱(zhu)回收pcr片斷。將片段進行ta克(ke)隆，獲得(de)質粒t8，并將質粒t8高效轉化到(dao)大腸(chang)桿菌dh5α感(gan)受(shou)態細胞(bao)中。

9、構建改造的草莓l-半乳(ru)糖醛酸內(nei)酯脫氫酶（galdh）基因fvgaldh。

從草莓中克(ke)隆l-半乳糖醛酸內酯(zhi)脫(tuo)氫酶基因并(bing)利用(yong)定點突變方法(fa)將(jiang)678位ndei限制性內切酶位點消除。

以合(he)成的(de)cdna第(di)一鏈為(wei)模(mo)板，擴增(zeng)引物為(wei)：galdh1:5’-atgactatccactactctgtcg-3’（seqidno.69所示(shi)）galdh2:5’-ttaggactgctggataccagaag-3’（seqidno.70所示(shi)）。pcr反應條件(jian)：98℃預變(bian)性(xing)3min；94℃變(bian)性(xing)30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，30個循(xun)環；72℃保溫(wen)10min。pcr結(jie)束后(hou)，采用(yong)酚：氯仿抽提，再加入(ru)2倍體(ti)積的(de)無水(shui)(shui)乙醇進行沉淀(dian)。沉淀(dian)用(yong)30μl水(shui)(shui)溶(rong)解，取1μl為(wei)模(mo)板。

678位(wei)xhoi限(xian)制性內(nei)切酶位(wei)突變引(yin)物：678z：ctttaggaattttcacatatgt（seqidno.71所(suo)示(shi)）；678f：acatatgtgaaaattcctaaag（seqidno.72所(suo)示(shi)）。

以(yi)引(yin)物galdh1和678f；678z和galdh2進(jin)(jin)行pcr擴(kuo)(kuo)增(zeng)，擴(kuo)(kuo)增(zeng)條件(jian)為(wei)(wei)：94℃預熱(re)1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min。共(gong)25個循(xun)環，pcr結束后(hou)，dna片(pian)(pian)(pian)斷用10%丙烯(xi)酰(xian)胺膠回收，將(jiang)上述(shu)8個回收片(pian)(pian)(pian)斷取(qu)10-100ng為(wei)(wei)模板混合，以(yi)galdh1和galdh2為(wei)(wei)引(yin)物將(jiang)上述(shu)片(pian)(pian)(pian)斷拼接，擴(kuo)(kuo)增(zeng)條件(jian)為(wei)(wei)：94℃預熱(re)1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，2min。共(gong)25個循(xun)環。pcr結束后(hou)，dna柱回收pcr片(pian)(pian)(pian)斷。將(jiang)片(pian)(pian)(pian)段進(jin)(jin)行ta克隆，獲得質粒(li)t9，并(bing)將(jiang)質粒(li)t9高效轉化到大腸桿菌dh5α感受(shou)態細胞中。

10、構(gou)建改造的草莓l-半乳(ru)糖脫氫酶(mei)（gldh）基因fvgldh。

從草莓克隆l-半乳(ru)糖脫(tuo)氫酶基因(yin)并(bing)利用定點(dian)突變方法將12和263位(wei)(wei)(wei)(wei)saci限制(zhi)(zhi)性(xing)內(nei)(nei)切(qie)(qie)酶位(wei)(wei)(wei)(wei)點(dian)；340位(wei)(wei)(wei)(wei)xhoi限制(zhi)(zhi)性(xing)內(nei)(nei)切(qie)(qie)酶位(wei)(wei)(wei)(wei)點(dian)；602位(wei)(wei)(wei)(wei)ecori限制(zhi)(zhi)性(xing)內(nei)(nei)切(qie)(qie)酶位(wei)(wei)(wei)(wei)點(dian)；611和1625位(wei)(wei)(wei)(wei)psti限制(zhi)(zhi)性(xing)內(nei)(nei)切(qie)(qie)酶位(wei)(wei)(wei)(wei)點(dian)；1320位(wei)(wei)(wei)(wei)bgii限制(zhi)(zhi)性(xing)內(nei)(nei)切(qie)(qie)酶位(wei)(wei)(wei)(wei)點(dian)；1419位(wei)(wei)(wei)(wei)hindiii限制(zhi)(zhi)性(xing)內(nei)(nei)切(qie)(qie)酶位(wei)(wei)(wei)(wei)點(dian)消(xiao)除。

以(yi)合(he)成的cdna第一鏈為(wei)模板，擴(kuo)增(zeng)引物為(wei)：gldhz:5’-atgcaacgagcactgactctgaag-3’（seqidno.73所(suo)示）gldhf:5’-ttagatggtgtcagaggatggga-3’（seqidno.74所(suo)示）。pcr反應(ying)條(tiao)件：98℃預變性3min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸120s，30個循環；72℃保溫10min。pcr結(jie)束后，采(cai)用(yong)酚(fen)：氯仿抽提，再(zai)加入2倍體積的無(wu)水乙醇進(jin)行(xing)沉淀。沉淀用(yong)30μl水溶(rong)解，取1μl為(wei)模板。

263位(wei)saci限制性內(nei)切酶位(wei)突變引物：263z：gagttccacaccgtctctaac（seqidno.75所示）；263f：gttagagacggtgtggaactc（seqidno.76所示）。

340位(wei)xhoi限制性內(nei)切(qie)酶位(wei)突變引物：340z：gagctggagaaagtggtcaag（seqidno.77所(suo)示）；340f：cttgaccactttctccagctc（seqidno.78所(suo)示）。

602位(wei)ecori限(xian)制性內切酶位(wei)突變引物：602z：gaactctgcaggttggtgcacatggtac（seqidno.79所(suo)示(shi)(shi)）；602f：gtaccatgtgcaccaacctgcagagttc（seqidno.80所(suo)示(shi)(shi)）。

1320位bglii限(xian)制性(xing)內(nei)切酶位突變引物：1320z：agttctaaaacagctaatag（seqidno.81所示(shi)）；1320f：ctattagctgttttagaact（seqidno.82所示(shi)）。

1419位(wei)bglii限制性內切(qie)酶位(wei)突變引物(wu)：1419z：aaggttaaaggaggatgatata（seqidno.83所示）；1419f：tatatcatcctcctttaacctt（seqidno.84所示）。

1625位(wei)psti限制性內切酶位(wei)突變引物(wu)：1625z：caaagaacagcttaccactctgaag（seqidno.85所示(shi)）；1625f：cttcagagtggtaagctgttctttg（seqidno.86所示(shi)）。

以引(yin)物(wu)gldhz和(he)(he)263f；263z和(he)(he)340f；340z和(he)(he)602f；602z和(he)(he)1320f；1320z和(he)(he)1419f；1419z和(he)(he)1625f；1625z和(he)(he)gldhf進行pcr擴增(zeng)，擴增(zeng)條件(jian)為(wei)：94℃預熱(re)1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min。共(gong)25個循環，pcr結束(shu)(shu)后，dna片(pian)斷(duan)用(yong)10%丙烯(xi)酰胺膠回(hui)(hui)收，將(jiang)上述8個回(hui)(hui)收片(pian)斷(duan)取10-100ng為(wei)模(mo)板混合，以gldhz和(he)(he)gldhf為(wei)引(yin)物(wu)將(jiang)上述片(pian)斷(duan)拼接，擴增(zeng)條件(jian)為(wei)：94℃預熱(re)1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，2min。共(gong)25個循環。pcr結束(shu)(shu)后，dna柱回(hui)(hui)收pcr片(pian)斷(duan)。將(jiang)片(pian)段進行ta克(ke)隆，獲得質粒(li)t10，并將(jiang)質粒(li)t10高效轉化到大腸桿菌dh5α感受態細胞中。

11、構建改造的草(cao)莓脫氫抗壞(huai)血酸(suan)還原酶（dhar）基因fvdhar。

從草(cao)莓中克隆脫氫抗壞血酸還原酶基因并利用定(ding)點突變方法將33位(wei)(wei)psti限(xian)制性(xing)內切酶位(wei)(wei)點；339位(wei)(wei)bamhi限(xian)制性(xing)內切酶位(wei)(wei)點；453和521位(wei)(wei)hindiii限(xian)制性(xing)內切酶位(wei)(wei)點消(xiao)除。

以合成的cdna第一(yi)鏈為(wei)模板，擴增引物(wu)為(wei)：dharz:5’-atggctcttgaggttgctgccaaggctgctggag-3’（seqidno.87所(suo)示(shi)）dharf:5’-ttacttaggattgaccttaggttc-3’（seqidno.88所(suo)示(shi)）。pcr反應(ying)條件(jian)：98℃預變(bian)(bian)性(xing)3min；94℃變(bian)(bian)性(xing)30s，60℃退(tui)火30s，72℃延伸60s，30個循環(huan)；72℃保溫(wen)10min。pcr結束后，采用酚(fen)：氯仿抽提，再加入2倍體(ti)積的無水(shui)乙(yi)醇進行(xing)沉(chen)(chen)淀。沉(chen)(chen)淀用30μl水(shui)溶解，取1μl為(wei)模板。

339位bamhi限制性內切酶位突變引物：339z：gacattcctcaagagcaaggaacc（seqidno.89所(suo)示(shi)）；339f：ggttccttgctcttgaggaatgtc（seqidno.90所(suo)示(shi)）。

453位hindiii限制(zhi)性內切酶位突(tu)變引物：453z：gtcactgctgctgatctaaccttg（seqidno.91所示）；453f：caaggttagatcagcagcagtgac（seqidno.92所示）。

521位hindiii限制性內切酶位突變引物：521z：ctaaaggtttgacccattaccat（seqidno.93所(suo)示(shi)）；521f：atggtaatgggtcaaacctttag（seqidno.94所(suo)示(shi)）。

以引物dharz和(he)(he)339f；339z和(he)(he)453f；453z和(he)(he)521f；521z和(he)(he)dharf進(jin)行pcr擴(kuo)(kuo)增，擴(kuo)(kuo)增條件為(wei)(wei)(wei)：94℃預熱(re)1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min。共25個循環(huan)，pcr結束(shu)后，dna片(pian)斷用10%丙烯酰胺膠回(hui)(hui)收(shou)(shou)，將(jiang)上(shang)述8個回(hui)(hui)收(shou)(shou)片(pian)斷取10-100ng為(wei)(wei)(wei)模(mo)板混合，以dharz和(he)(he)dharf為(wei)(wei)(wei)引物將(jiang)上(shang)述片(pian)斷拼接，擴(kuo)(kuo)增條件為(wei)(wei)(wei)：94℃預熱(re)1min；94℃，30s，60℃，30s，72℃，2min。共25個循環(huan)。pcr結束(shu)后，dna柱回(hui)(hui)收(shou)(shou)pcr片(pian)斷。將(jiang)片(pian)段進(jin)行ta克隆，獲得質粒t11，并(bing)將(jiang)質粒t11高效轉化(hua)到大腸桿(gan)菌dh5α感(gan)受(shou)態細胞中。

實施例1，構建葡萄糖合成(cheng)維生素c原核(he)表達載體(ti)。

將上(shang)述11個改造的維(wei)生(sheng)素c合成基(ji)(ji)因(yin)(yin)全部使(shi)用t7啟(qi)動(dong)子和終止(zhi)子控制，構(gou)(gou)(gou)建基(ji)(ji)因(yin)(yin)表(biao)達(da)元件。首(shou)先，我們利(li)用“重疊延伸pcr技術”構(gou)(gou)(gou)建維(wei)生(sheng)素c合成所有11個基(ji)(ji)因(yin)(yin)的表(biao)達(da)盒(he)。啟(qi)動(dong)子、基(ji)(ji)因(yin)(yin)和終止(zhi)子之間不含限(xian)制性(xing)內(nei)切(qie)酶位點。構(gou)(gou)(gou)建的大腸(chang)桿菌表(biao)達(da)單元為：t7fvhxk1s、t7fvpgis、t7fvpmis、t7fvpmms、t7fvvtc1s、t7fvgmes、t7fvvtc2s、t7fvvtc4s、t7fvgaldhs、t7fvgldhs、t7fvdhars。

t7啟動子序(xu)列(lie)為：gaattcctcgagcgatcccgcgaaattaatacgactcactataggggaattgtgagcggataacaattcccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacc（seqidno.95所(suo)示(shi)）。

t7終止子序列為(wei)：ctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttggtcgacggtgacgttgagcatggtaagctt（seqidno.96所示(shi)）。

構(gou)建的表達單元(yuan)在puc18載(zai)體上兩(liang)兩(liang)拼接，完(wan)成(cheng)(cheng)后消除內(nei)在的酶切位點，然后依次插入(ru)載(zai)體pcambia-1301，最(zui)終(zhong)構(gou)建成(cheng)(cheng)大腸桿菌維生素c合成(cheng)(cheng)載(zai)體pyb2130。

實施例(li)2，葡萄(tao)糖合成維生素c原核(he)表達載體(ti)pyb2130大腸桿菌轉化

1)大腸桿菌感受態細胞制備。

大腸桿菌(jun)(jun)(jun)菌(jun)(jun)(jun)株為bl21（de3），或bl21-ai等(deng)含有t7rna聚合酶的(de)菌(jun)(jun)(jun)株。挑取單菌(jun)(jun)(jun)在(zai)25mllb培養(yang)(yang)(yang)基37℃培養(yang)(yang)(yang)過夜(ye)，取5ml菌(jun)(jun)(jun)液轉(zhuan)接(jie)到(dao)100mllb培養(yang)(yang)(yang)基，培養(yang)(yang)(yang)至(zhi)od600=0.7-0.8，菌(jun)(jun)(jun)液冰上放置10分(fen)鐘(zhong)，5000rpm離(li)心10min，4℃，收集菌(jun)(jun)(jun)體，加入100ml無菌(jun)(jun)(jun)雙蒸(zheng)水清洗(xi)兩次。加入4ml10%甘油懸浮菌(jun)(jun)(jun)體，轉(zhuan)到(dao)50ml離(li)心管。5500rpm離(li)心10min，4℃。收集菌(jun)(jun)(jun)體，加入500μl10%甘油懸浮菌(jun)(jun)(jun)體，轉(zhuan)到(dao)1.5ml離(li)心管。

2）維(wei)生素c原核表達載體yb2130經電擊法導人(ren)大腸(chang)桿菌中。

取(qu)70μl農(nong)桿菌感受態細(xi)胞(bao)，加入1μl表達載體pyb2130。混勻(yun)，轉到(dao)0.1cm電(dian)擊(ji)杯中。電(dian)擊(ji)參數：200ω，1.7kv，2.5f，電(dian)擊(ji)后立即加入800μlsoc培(pei)養(yang)(yang)(yang)液。培(pei)養(yang)(yang)(yang)1小時(shi)后，取(qu)100μl涂50μg/l卡(ka)那霉素抗性板篩選轉化子，37℃培(pei)養(yang)(yang)(yang)。篩選生長良好的菌落(luo)培(pei)養(yang)(yang)(yang)后-70℃甘油(you)管凍存。

3）驗證大腸桿菌利用葡萄糖(tang)合成維生(sheng)素c。

將(jiang)在-70℃甘油管凍存的(de)工程菌接(jie)種(zhong)(zhong)于裝有所需培(pei)養基的(de)小試(shi)管中，接(jie)種(zhong)(zhong)含卡那(nei)霉素(su)（kmp，30mg／l）的(de)3mllb試(shi)管，在30℃培(pei)養過(guo)夜，過(guo)夜菌再(zai)以2％接(jie)種(zhong)(zhong)50ml含抗生(sheng)素(su)的(de)lb搖(yao)瓶，在30℃培(pei)養2-6h后，加入iptg或iptg+0.2%阿(a)拉伯糖誘(you)導培(pei)養24-72小時，轉速(su)均為200r/min。加入葡萄糖終(zhong)濃度10mg/ml。測定發酵終(zhong)止液(ye)的(de)菌體光密(mi)度值和維生(sheng)素(su)c的(de)含量。

4）維生素c含量hplc檢測。

取10ml發(fa)酵(jiao)菌液，離心收(shou)集菌體(ti)，液氮研磨，加0.1%草酸1ml，冰浴1小時，超聲(sheng)處理5min。10000rpm離心10min，取上(shang)清，過(guo)0.45μm濾膜。發(fa)酵(jiao)上(shang)清樣(yang)品用等(deng)體(ti)積0.2%草酸稀釋，過(guo)0.45μm濾膜。

高效液(ye)相(xiang)(hplc)條件:色譜柱(zhu)(zhu):symmetryshieldrp18柱(zhu)(zhu)(5μm，150x4.6mm)。流動相(xiang)為甲醇(chun):0.1%草酸=5:95，檢測波長245nm，柱(zhu)(zhu)溫(wen)為30℃，流速(su)1.0ml/min，外標法(fa)定量。樣(yang)品每次(ci)進(jin)樣(yang)10μl，將與標品相(xiang)同(tong)保留時間處(chu)的(de)峰的(de)峰面積代入(ru)標準曲線方程，計算樣(yang)品中(zhong)維生素c的(de)含量。

色譜圖(tu)結果表明：大腸桿菌誘導培養3天后(hou)，可以檢測到維生素c，維生素c的含量(liang)為(wei)0.5-1μg/ml。

序列表

<110>上海市農業(ye)科學院

<120>一種利(li)用植(zhi)物維生素c合(he)成途徑構建生產維生素c大腸(chang)桿菌(jun)菌(jun)株的方法

<130>2017

<160>96

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

atggggaaggtggcggtgggt21

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工(gong)序列

<400>2

ttaggagtcctcgacaccaag21

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

gagattgaaaagcttgagga20

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(lie)

<400>4

tcctcaagcttttcaatctc20

<210>5

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

agcaagcctaagatgctcatcag23

<210>6

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

ctgatgagcatcttaggcttgct23

<210>7

<211>22

<212>dna

<213>人(ren)工序列

<400>7

cagagttcaccaaatcagtgga22

<210>8

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(lie)

<400>8

tccactgatttggtgaactctg22

<210>9

<211>60

<212>dna

<213>人工序列(lie)

<400>9

aggtaacacaatccgcatgt20

<210>10

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

acatgcggattgtgttacct20

<210>11

<211>22

<212>dna

<213>人工(gong)序列(lie)

<400>11

agaactttgagaagattatttc22

<210>12

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>12

gaaataatcttctcaaagttct22

<210>13

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(lie)

<400>13

gaaggatatcttagagacct20

<210>14

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>14

aggtctctaagatatccttc20

<210>15

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>15

ctgggattctgggagtcctta21

<210>16

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>16

taaggactcccagaatcccag21

<210>17

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(lie)

<400>17

atggcatctatctctggtatctgttc26

<210>18

<211>25

<212>dna

<213>人(ren)工序(xu)列

<400>18

taggagtacagtgcatcgacgttgc25

<210>19

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<400>19

tcttgactggctgtaccagcacaaggagttcg32

<210>20

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<400>20

cgaactccttgtgctggtacagccagtcaaga32

<210>21

<211>23

<212>dna

<213>人工(gong)序列(lie)

<400>21

ggaaccaaggatatggttgttct23

<210>22

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>22

agaacaaccatatccttggttcc23

<210>23

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>23

ggagcacggatcagcttgca20

<210>24

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(lie)

<400>24

tgcaagctgatccgtgctcc20

<210>25

<211>21

<212>dna

<213>人工序(xu)列

<400>25

gaagaagtaacacctagaact21

<210>26

<211>21

<212>dna

<213>人工序(xu)列

<400>26

agttctaggtgttacttcttc21

<210>27

<211>26

<212>dna

<213>人(ren)工序列

<400>27

atggagaagtccatgatcgagaagtc26

<210>28

<211>26

<212>dna

<213>人工(gong)序(xu)列

<400>28

ttatggcagctggaagaacatggagt26

<210>29

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>29

ctcaactatgtcaaggtt18

<210>30

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(lie)

<400>30

aaccttgacatagttgag18

<210>31

<211>76

<212>dna

<213>人工序列

<400>31

ggttcctcccaccttttgacgagtttgaggtcgatcggtgccatcttccccagggagaat60

cagtggaatttcctgaag78

<210>32

<211>78

<212>dna

<213>人工(gong)序列

<400>32

cttcaggaaattccactgattctccctggggaagatggcaccgatcgacctcaaactcgt60

caaaaggtgggaggaacc78

<210>33

<211>18

<212>dna

<213>人工序列

<400>33

cttttcgtgcctgaaggt18

<210>34

<211>18

<212>dna

<213>人工(gong)序列

<400>34

accttcaggcacgaaaag18

<210>35

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<400>35

atggctgtcatgaagcctggtgtc25

<210>36

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<400>36

ttaggaagagaagaacagagccttaac27

<210>37

<211>22

<212>dna

<213>人工(gong)序列

<400>37

cagtgggcattgttggaggaac22

<210>38

<211>22

<212>dna

<213>人(ren)工序列

<400>38

ggttcctccaacaatgcccactg22

<210>39

<211>23

<212>dna

<213>人工序(xu)列

<400>39

gatatgctttgatgtttttcctc23

<210>40

<211>37

<212>dna

<213>人工(gong)序(xu)列

<400>40

gaggaaaaacatcaaagcatatc23

<210>41

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>41

atgaaggcactgattctggtcgg23

<210>42

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>42

ttacatgacgatctcaggcttct23

<210>43

<211>20

<212>dna

<213>人工(gong)序列

<400>43

tggattccataaatcccatg20

<210>44

<211>20

<212>dna

<213>人(ren)工序列

<400>44

catgggatttatggaatcca20

<210>45

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>45

tcggatcaagaagcttgcttg21

<210>46

<211>21

<212>dna

<213>人工(gong)序列

<400>46

caagcaagcttcttgatccga21

<210>47

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>47

atgggttctgctggtgagtctg22

<210>48

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>48

ttactccttaccatcagcagcac23

<210>49

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>49

gagttccatcttgtggatctcag23

<210>50

<211>23

<212>dna

<213>人(ren)工序列

<400>50

ctgagatccacaagatggaactc23

<210>51

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>51

ctgaagaaaggctctcacatccac24

<210>52

<211>24

<212>dna

<213>人工序列(lie)

<400>52

gtggatgtgagagcctttcttcag24

<210>53

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>53

atgatgctgaagatcaagcgtg22

<210>54

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>54

ttactggagaaccagacactcct23

<210>55

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>55

gcttgcagaaagggctatttc21

<210>56

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>56

gaaatagccctttctgcaagc21

<210>57

<211>22

<212>dna

<213>人工(gong)序列

<400>57

gaaaccttcttgcttgcacttc22

<210>58

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(lie)

<400>58

gaagtgcaagcaagaaggtttc22

<210>59

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>59

caccacatgtccactaatttc21

<210>60

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>60

gaaattagtggacatgtggtg21

<210>61

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>61

gaggaaccagatgtcaatcctc22

<210>62

<211>22

<212>dna

<213>人工(gong)序(xu)列

<400>62

gaggattgacatctggttcctc22

<210>63

<211>44

<212>dna

<213>人工序列

<400>63

atggctgaaaatgattcgcttgctctgttcttggcctctgcagt44

<210>64

<211>21

<212>dna

<213>人(ren)工序列

<400>64

ttaggagtcctcgacaccaag21

<210>65

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>65

gagttcatatttaatcatctca22

<210>66

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>66

tgagatgattaaatatgaactc22

<210>67

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(lie)

<400>67

gtggaacccctggatggcac20

<210>68

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>68

gtgccatccaggggttccac20

<210>69

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(lie)

<400>69

atgactatccactactctgtcg22

<210>70

<211>23

<212>dna

<213>人工(gong)序列

<400>70

ttaggactgctggataccagaag23

<210>71

<211>22

<212>dna

<213>人工(gong)序列

<400>71

ctttaggaattttcacatatgt22

<210>72

<211>22

<212>dna

<213>人(ren)工序列(lie)

<400>72

acatatgtgaaaattcctaaag22

<210>73

<211>24

<212>dna

<213>人工(gong)序(xu)列

<400>73

atgcaacgagcactgactctgaag24

<210>74

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(lie)

<400>74

ttagatggtgtcagaggatggga23

<210>75

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(lie)

<400>75

gagttccacaccgtctctaac21

<210>76

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>76

gttagagacggtgtggaactc21

<210>77

<211>21

<212>dna

<213>人工(gong)序列

<400>77

gagctggagaaagtggtcaag21

<210>78

<211>21

<212>dna

<213>人工(gong)序列

<400>78

cttgaccactttctccagctc21

<210>79

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<400>79

gaactctgcaggttggtgcacatggtac28

<210>80

<211>28

<212>dna

<213>人工(gong)序列

<400>80

gtaccatgtgcaccaacctgcagagttc28

<210>81

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>81

agttctaaaacagctaatag20

<210>82

<211>20

<212>dna

<213>人工(gong)序列

<400>82

ctattagctgttttagaact20

<210>83

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>83

aaggttaaaggaggatgatata22

<210>84

<211>22

<212>dna

<213>人工序(xu)列

<400>84

tatatcatcctcctttaacctt22

<210>85

<211>25

<212>dna

<213>人工序(xu)列

<400>85

caaagaacagcttaccactctgaag25

<210>86

<211>25

<212>dna

<213>人(ren)工序列

<400>86

cttcagagtggtaagctgttctttg25

<210>87

<211>34

<212>dna

<213>人工序(xu)列(lie)

<400>87

atggctcttgaggttgctgccaaggctgctggag34

<210>88

<211>24

<212>dna

<213>人工序(xu)列

<400>88

ttacttaggattgaccttaggttc24

<210>89

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>89

gacattcctcaagagcaaggaacc24

<210>90

<211>24

<212>dna

<213>人工序(xu)列(lie)

<400>90

ggttccttgctcttgaggaatgtc24

<210>91

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>91

gtcactgctgctgatctaaccttg24

<210>92

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>92

caaggttagatcagcagcagtgac24

<210>93

<211>23

<212>dna

<213>人(ren)工序(xu)列

<400>93

ctaaaggtttgacccattaccat23

<210>94

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>94

atggtaatgggtcaaacctttag23

<210>95

<211>113

<212>dna

<213>人工序(xu)列

<400>95

gaattcctcgagcgatcccgcgaaattaatacgactcactataggggaattgtgagcgga60

taacaattcccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatatacc113

<210>24

<211>78

<212>dna

<213>人工序列

<400>96

ctagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttggtcgacggtgac60

gttgagcatggtaagctt78