一種改良重組大腸桿菌生產9?癸烯醇的方法
【專利摘要】本發明公開了一種改良重組大腸桿菌生產9?癸烯醇的方法，所述重組大腸桿菌中的宿主菌株和表達質粒均被改造成能夠實現組成型表達。本發明制備9?癸烯醇的過程中，其產物的回收率高，可達95%，反應條件溫和，不使用重金屬及有機溶劑，對環境友好，同時對具有C=C的化合物的生物轉化具有重要意義，能夠很好的滿足工業化的生產需求。
【專利說明】
一種改良重組大腸桿菌生產9-癸烯醇的方法
技術領域
[0001] 本發明適用于生物化工領域，特別涉及一種改良重組大腸桿菌生產9-癸烯醇的方 法。
【背景技術】
[0002] 9-癸烯醇是一類具有玫瑰香味的不飽和脂肪醇，主要用途是作為日化香精配方的 原料和表面活性劑的成分。其具有廣闊的工業應用前景。
[0003] 目前，國內外還沒有采用生物制造方法來進行9-癸烯醇的生產，主要還是以一些 化學制備方法為主。采用化學合成的方法來制備9-癸烯醇，主要是由石油衍生而來的1，10-癸二醇進行脫水制備。美國Elevance可再生技術公司開發了一種以9-癸烯酸甲酯作為底 物，在各類催化劑和輔助試劑如2-乙基己酸鋅、硼氫化鈉、聚（二甲基硅氧烷）、氫氧化鉀等 的作用下合成9-癸烯醇。但是由于C = C不飽和雙鍵的存在，化學法制備9-癸烯醇需要用到 一些貴重的金屬催化劑，而且立體選擇性并不是很理想，不僅提高了制備成本還增加了后 期分離提取的難度。

【發明內容】

[0004] 本發明的目的是解決現有技術的不足，提供一種改良重組大腸桿菌生產9-癸烯醇 的方法。
[0005] 為達到上述目的，本發明采用的技術方案是:一種改良重組大腸桿菌生產9-癸烯 醇的方法，所述重組大腸桿菌中的宿主菌株和表達質粒均被改造成能夠實現組成型表達。
[0006] 優選地，所述宿主菌株的改造可以通過以下任一一種方式來實現：
[0007] 1)大腸桿菌中所有的編碼轉錄抑制蛋白的基因 IacI被敲除；
[0008] 2)大腸桿菌中所有的乳糖操縱基因 IacO被敲除。
[0009 ] 優選地，所述表達質粒的改造可以通過以下任一一種方式來實現：
[0010] 3)將參與9-癸烯醇生物轉化的羧酸還原酶、醛還原酶及脂肪酸甲酯水解酶三個酶 置于組成型啟動子T5之后；
[0011] 4)將強啟動子trc系列的誘導型表達質粒上的IacI基因去掉，再將上述3個酶置于 啟動子Trc之后。
[0012] 本發明采用的另一個技術方案為一種改良重組大腸桿菌生產9-癸烯醇的方法，所 述重組大腸桿菌中的脂肪酸甲酯水解酶的表達通過如下方法得到強化的：
[0013] a)通過蛋白質工程技術優化位于編碼脂肪酸甲酯水解酶基因起始密碼前的25位 核苷酸序列，優化得到的核苷酸序列為GTTAAATTTTTATAGGAGTTCAGTT;
[0014] b)對所述羧酸還原酶基因的第三個氨基酸，通過點突變技術將Ser突變為Arg，使 羧酸還原酶的蛋白表達量和活力與優化后的所述脂肪酸甲酯水解酶的活力相平衡。
[0015]本發明采用的另一個技術方案為一種改良重組大腸桿菌生產9-癸烯醇的方法，所 述大腸桿菌中的NADPH的供給通過以下一種或多種方式得到提高：
[0016] i)敲除葡萄糖代謝路徑中編碼6-磷酸果糖激酶的基因 pfkA;
[0017] ?? )敲除葡萄糖代謝路徑中編碼磷酸葡萄糖異構酶基因 pgi ;
[0018] iii )強化表達葡萄糖代謝路徑中編碼葡萄糖6-磷酸脫氫酶的基因 zwf。
[0019]優選地，強化表達葡萄糖代謝路徑中編碼葡萄糖6-磷酸脫氫酶的基因 zwf，其采用 的啟動子為T5。
[0020]由于上述技術方案的運用，本發明與現有技術相比具有下列優點：將本發明的改 良重組大腸桿菌菌株應用到9-癸烯醇的制備過程中，其產物的回收率高，反應條件溫和，不 使用重金屬及有機溶劑，對環境友好，同時對具有C = C的化合物的生物轉化具有重要意義。 且這里，對宿主基因組上相關基因進行改造，如轉錄抑制蛋白基因的敲出、修飾蛋白基因表 達利用強啟動子提高表達量，或是糖酵解路徑和磷酸戊糖途徑相關基因敲除或者過表達提 高NADPH供給等以提高產量;其次，將重組表達質粒上的基因進行點突變提高蛋白表達量， 或是蛋白質工程技術優化甲酯水解酶基因的RBS序列，以及將重組質粒由誘導型表達改為 組成型表達等等，不僅節約了成本，還大大提高了底物添加量和產物產量;將操縱子整合到 基因組上也具有有效發揮生物轉化的功能，改良后的生物轉化體系更好地滿足了工業化生 產需求。
【附圖說明】
[0021 ]附圖1為9-癸烯酸甲酯到9-癸烯醇轉化過程示意圖；
[0022]圖2為實施例3中改造宿主轉化相應質粒后搖瓶發酵比較圖；
[0023]圖3為實施例4中利用2%葡萄糖為碳源的重組菌W3110/pJ01發酵結果圖；
[0024]圖4為實施例4中利用2%甘油為碳源的重組菌WJ2/pJ02發酵結果圖；
[0025] 圖5為實施例5中ushA基因敲除對菌體生長的影響結果圖；
[0026] 圖6為實施例6中部分糖酵解和戊糖磷酸路徑及改造示意圖；
[0027] 圖7為實施例8中蛋白質工程構建脂肪酸甲酯水解酶RBS文庫篩選優勢重組菌株復 篩結果圖；
[0028] 圖8為實施例8中RBS文庫篩選菌株搖瓶發酵結果圖；
[0029] 圖9為GC檢測實施例11中組成型表達和MsCar基因突變重組菌株發酵比較結果圖；
[0030] 圖10為HPLC檢測實施例11中組成型表達和MsCar基因突變重組菌株發酵比較結果 圖；
[0031] 圖11為實施例12中的2個菌株發酵過程GC檢測結果圖；
[0032]圖12為實施例12中的2個菌株發酵過程HPLC檢測結果圖。
【具體實施方式】
[0033] 實施例lW3110(entDT5)宿主的構建
[0034] entD全名磷酸泛酰巰基乙胺基轉移酶，主要功能修飾載體蛋白，即將輔酶A上的 4'-磷酸泛酰巰基乙胺轉移到載體蛋白保守的絲氨酸殘基側鏈羥基上，使載體蛋白由無活 性的脫輔基(apo_)形式轉變為活性全蛋白（holo_)形式。作為修飾蛋白，entD的表達量不需 要很高，但是W3110基因組自身含有的entD基因表達又不夠，可能是啟動子較弱的原因，因 此將W3110基因組上的entD基因更換啟動子，強化其表達，減少質粒上操縱子的大小，提高 質粒的穩定性以及質粒表達給宿主帶來的壓力。
[0035] W3110(entDT5)菌株構建以Red重組法完成。
[0036] 首先，以pKD4質粒為模板，利用引物對T5-in-F/KD4-R(引物見表1)，PCR擴增得到 含上游同源臂的Kan-FRT片段;然后以含T5啟動子的質粒為模板，利用引物對T5-Fl/T5-in-R(引物見表1)，PCR擴增T5啟動子及RBS序列；最后將上述擴增得到的2個片段以等摩爾量進 行混合，利用引物對T5-in-F/T5-in-R進行重疊 PCR擴增得到兩端含同源臂的Kan-FRT-T5重 組片段。
[0037]然后，制備電轉化感受態細胞:將質粒pKD46轉入W3110，30°C過夜培養得到單克隆 W3110/pKD46接種于含100ng/mL Amp的LB試管。次日，按照1:100接種至30ml含100ng/mL 八!11?及2011111^阿拉伯糖的1^液體培養基，30°(：、200印111培養211左右006()() = 0.25時，補加1^-阿 拉伯糖20mM，繼續誘導培養Ih，使pKD46上的Exo、Bet和Gam三個蛋白充分表達，然后收集菌 體進行電轉感受態制備；電轉感受態制備過程：1)培養好的菌體冰上預冷IOmin，然后 4000rpm、4°C離心10min，棄上清；2)用預冷10 %甘油離心洗滌菌體，4000rpm、4°C離心 IOmin，棄上清;3)重復2)操作2次;4)加入10 %甘油濃縮100倍，分裝80ul/管。
[0038]最后，電轉化、驗證：1)電轉化:將上述擴增的Kan-FRT-T5片段約200ng加入要上述 感受態細胞，混勻，轉入〇. I cm電擊杯中，用電擊儀作電轉化。電擊條件:200Ω，25μΡ，電擊電 壓1.8kV，電擊時間為5ms，電擊后迅速加入1ml的LB，37°C，200rpm培養lh，之后涂于含50ng/ mL kan的LB平板，37°C過夜培養。2)轉化子驗證:電轉化得到的轉化子進行菌液PCR驗證，弓丨 物分別為T5-200-F/Kan-R、kan-F/T5-200-R，驗證正確的轉化子進行化轉感受態制備，并轉 化質粒PCP20,涂布含Amp抗性的平板。30°C過夜培養后得到的單克隆接種于含20ng/ml Cm 的LB試管，30°C培養4h后轉接到LB無抗性液體培養基試管繼續培養4h后升溫42°C，培養過 夜，然后進行涂布LB平板，得到的單克隆分別點板于LB+Amp、LB+Cm以及LB+Kan確認抗性片 段消除成功，最后通過引物T5-200-F/T5-200-R進行菌液PCR驗證，得到菌株W3110 (entDT5) 重組菌株，后續命名WJl (參見表4)。
[0039]實施例2W3110( Δ lacI，entDT5)宿主的構建
[0040] W3110基因組上的IacI基因編碼乳糖操縱子的DNA-binding轉錄抑制因子蛋白，重 組質粒PJOl為trc啟動子，質粒本身也帶有IacI基因。IacI基因表達產物是一種阻遏物，會 與IacO操縱基因結合，抑制后續結構基因的轉錄，若是在發酵過程添加誘導劑IPTG或乳糖， 它們會與阻遏物結合，改變其構型使其無法與操縱基因結合，后續結構基因可以正常轉錄 和翻譯。因此將基因組IacI基因進行敲除，可以在后續嘗試重組質粒由誘導型表達轉向組 成型表達，節省發酵過程誘導劑IPTG的成本。
[00411 W3110( Δ lacI，entDT5)以Red重組法完成構建，構建過程與上述WJl基本類似。
[0042] 首先，利用引物對lacI-K-F/lacI-K-R(引物見表1)以pKD4質粒為模板，擴增含敲 除IacI上下游同源臂的Kan-FRT重組片段，并進行純化回收；
[0043]然后，制備WJl/pKD46電轉化感受態細胞；
[0044] 最后，電轉化Kan-FRT片段約200ng到WJl/pKD46電轉化感受態細胞，涂布Kan抗性 平板，利用引物對lacI-200-F/Kan-R、kan-F/lacI-200-R(引物見表1)驗證轉化子，消抗后 的轉化子利用引物對lacI-200-F/lacI-200_R進行確認，最終構建得到W3110( Δ lacl， entDT5)重組菌株，此改造宿主后續命名WJ2(參見表4)。
[0045]采用WJ2菌株，加入到5L的發酵罐中進行發酵，期間采用流加的方式加入底物9-癸 烯酸甲酯達367g/L，發酵完全后，測得最終產物9-癸烯醇11Og/L，基本接近理論值。
[0046]表1基因敲除驗證引物表

[0049] 實施例3WJl/pJ02、WJ2/pJ02重組菌株搖瓶發酵比較
[0050] 上述構建的WJ1、WJ2菌株制備感受態細胞，轉化重組質粒pEZ07-MsCar-alrA-lcaE7(即pJ02)，分別涂布含lOOng/mL Spe抗性的LB平板，得到重組菌株WJl/pJ02和WJ2/ PJ02。將2個菌株連同對照菌株W3110/pJ01-起進行搖瓶發酵，比較entD基因在基因組上強 化表達和質粒上表達的差異以及IacI敲除對此轉化過程的影響，同時本發明中的搖瓶發酵 從原來的LB+1 %甘油培養基改為以葡萄糖為碳源的M9改良發酵培養基。具體發酵過程如 下：
[0051 ]首先，分別接種上述3個重組菌的3個不同轉化子接種于5mL添加 lOOng/mLSpe抗性 的LB培養基，于33°C、200rpm培養過夜。次日，分別取過夜培養的菌液IOOul加入到SmL^Spe 抗性的LB培養基，33 °C、200rpm培養3h左右，全部加入到20mL的改良M9發酵培養基中，改良 M9發酵培養基配方及微量元素 TM2母液成分詳見表2。然后，轉接過后于37°C、200rpm培養4-5h，每瓶加入誘導劑IPTG使其終濃度為ImM，同時加入300ul底物9-癸烯酸甲酯（約10g/L)， 繼續37°C、200rpm培養過夜。最后，發酵過夜后分別取出400uL發酵液于2mL離心管中，加入 1200uL的氯仿，將離心管置于渦旋振蕩器上劇烈震蕩，從發酵液中萃取出反應剩余的9-癸 烯酸甲酯，中間產物9-癸烯酸，9-癸烯醛和產物9-癸烯醇，震蕩5-10min后將離心管在 12000rpm離心lmin，吸取下層0.22um有機濾膜進行GC檢測，檢測底物轉化率以及各物質的 所占的比例，GC檢測結果見圖2。
[0052]從圖2中可看出，各重組菌株的比較：1)菌株WJl/pJ02和對照菌W3110/pJ01以葡萄 糖為碳源的改良培養基中發酵，發酵結束后殘留底物和生成產物面積百分比相差不大，但 是說明重組菌株WJl/pJ02發酵結束OD 6qq達8 · 0左右，而對照菌W31 ΙΟ/pJOl發酵結束OD6Q0達 6.5左右，說明IacI基因的敲除對9-癸烯酸甲酯的轉化影響不大，而且有助于提高菌體量， 較大的菌體量也是提高轉化率的一個有利因素;2)三個重組菌株的比較顯示WJ2/pJ02產物 9_癸烯醇比例最高，說明entD基因在基因組上強化表達可以有效的替代其在質粒上表達， 說明改造宿主WJ2效果較好。
[0053] 表2搖瓶發酵培養基配制及TM2母液成分如表2-1與2-2所示：
[0054]表2-1

[0058] 實施例4碳源對重組菌株WJ2/pJ02發酵生物轉化的影響
[0059] 在上述實施例3中以葡萄糖作為碳源進行搖瓶發酵，在之前的研究中采用的是LB+ 1%甘油作為發酵培養基進行，因此將上述實施例3中的WJ2/pJ02菌株置于不同碳源的改良 培養基進行發酵，比較不同碳源對重組菌株發酵生物轉化的影響。
[0060] 發酵菌株為W31 ΙΟ/pJOl和WJ2/PJ02，發酵培養基分別為2 %葡萄糖或2 %甘油為碳 源的發酵培養基，培養過程與實施例3基本一致，搖瓶發酵結果分別見圖3與圖4。
[0061] 用兩個重組菌株比較不同碳源對9-癸烯酸甲酯生物轉化的影響，圖3為W3110/ PJOl發酵結果，圖4為WJ2/pJ02發酵結果，結果顯示：相同底物濃度下，以甘油作為碳源，底 物9-癸烯酸甲酯殘留量基本明顯降低，WJ2/pJ02底物殘留2%左右，而且產物9-癸烯醇的比 例均有提高，達80%以上；而以葡萄糖作為碳源，底物9-癸烯酸甲酯均大部分未反應完全， 產物比例也僅在60%左右；而且與之前研究中采用LB+1 %甘油為發酵培養基相比，以這兩 兩種碳源的無機鹽培養基進行發酵，基本沒有9-癸烯酸可以檢測到，上述結果說明：1)無機 鹽培養基之前研究中采用的TB培養基或是LB+1%甘油發酵效果效果好很多;2)無機鹽培養 基以甘油作為碳源能有效的提高9-癸烯酸甲酯到9-癸烯醇的生物轉化效率，可能是葡萄糖 代謝較快，產酸過多等原因部分影響了轉化效率，因此后續搖瓶比較以甘油作為碳源，由于 葡萄糖作為碳源比甘油更為經濟，后續關于基因改造以葡萄糖作為碳源也會繼續進行研 究。
[0062] 實施例5W3110( Δ lad，entDT5, AushA)宿主的構建及搖瓶發酵
[0063] W3110基因組上有ushA基因，它編碼一種周質蛋白，有文獻報道此基因敲除可以適 當提高菌株在基本培養基的生長速度，提高率15%_25%左右，這對于我們上罐發酵利用葡 甸糖為碳源具有一定的優勢，可以在有效提尚菌體濃度的如提下提尚生物轉化率，因此在 WJ2宿主的基礎上進行ushA基因敲除的改造。
[0064] W3110( Δ lacI，entDT5, AushA)以Red重組法完成構建，構建過程與上述WJ2構建過 程IacI基因敲除基本類似。首先，利用引物對ushA-K-F/ushA-K-R(引物見表1)以pKD4質粒 為模板，擴增含敲除IacI上下游同源臂的Kan-FRT重組片段，并進行純化回收。然后，制備 WJ2/pKD46電轉化感受態細胞。最后，電轉化Kan-FRT片段約200ng到WJ2/pKD46電轉化感受 態細胞，涂布Kan抗性平板，利用引物對ushA-200-F/Kan-R、kan-F/ushA_200-R驗證轉化子， 消抗后的轉化子利用引物對ushA-200-F/ushA-200-R(引物見表1)進行確認，最終構建得到 W3110( Δ lacI，entDT5, AushA)重組菌株，后續命名WJ3(參見表4)。
[0065]宿主WJ3制備劃轉感受態細胞，轉化質粒pJ02,得到重組菌株WJ3/pJ02,以WJ2/ PJ02作為對照菌株，進行搖瓶發酵，發酵培養基以2%葡萄糖作為碳源。轉化率檢測發酵過 程與上述基本一致。生長曲線測定:重組菌株WJ3/pJ02、WJ2/pJ02分別接種試管培養過夜， 次日按照起始菌濃1轉接到20ml發酵培養基中，于37°C、200rpm培養，每間隔2.5h取樣進行 OD6m檢測，直到菌濃穩定。
[0066] 生長曲線測定結果見圖5,結果顯示ushA基因敲除沒有明顯提高菌體生長速率，反 而在前期菌體生長速率減慢，而且發酵結果后檢測底物和產物的結果顯示敲除前后基本沒 有差別，說明ushA基因的敲除在我們生物轉化過程中沒有起到積極的作用。
[0067]實施例6糖酵解路徑部分弱化或完全阻斷方式提高NADPH的供給 [0068] 9-癸烯酸甲酯到9-癸烯醇的生物轉化過程見圖1，其中MSCAR基因編碼的羧酸還原 酶是此轉化過程的關鍵限速酶，但是需要NADPH作為輔酶。在以葡萄糖作為碳源的微生物代 謝過程中，NADPH主要是通過戊糖磷酸途徑(PPP)生成，戊糖磷酸途徑是葡萄糖直接氧化脫 氫和脫羧，脫氫酶的輔酶不是NAD+而是NADP+，因此代謝過程會產生大量NADPH作為還原力 以供生物合成用，但在實際代謝過程中，葡萄糖通過糖酵解途徑(EMP)和PPP降解的比例分 另IJ55-70%和30-45%。因此，在需大量NADPH還原力的全細胞生物轉化過程中，使葡萄糖主 要通過磷酸戊糖途徑降解是一種主要的改進措施。文獻報道有通過敲除Pgi或者PfkA等基 因提高NADPH供給，部分EMP和PPP代謝路徑見圖6。
[0069] 首先采用部分弱化EMP路徑。W3110基因組上有pfkA基因，它編碼6-磷酸果糖激酶 基因，是葡萄糖代謝過程的關鍵限速酶之一，主要是催化6-磷酸果糖磷酸化生成1，6_二磷 酸果糖，據文獻報道此基因敲除可部分弱化EMP路徑，從而使PPP路徑的代謝增加，提高NADH 的積累。因此進行宿主改造，敲除PfkA基因，構建菌株W3110( Δ lacI，entDT5, ApfkA)。以 Red重組法完成構建，構建過程與上述WJ2構建過程IacI基因敲除基本類似。首先，利用引物 對pfkA-K-F/pfkA-K-R(引物見表1)以pKD4質粒為模板，擴增含敲除IacI上下游同源臂的 Kan-FRT重組片段，并進行純化回收。然后，制備WJ2/pKD46電轉化感受態細胞。最后，電轉化 Kan-FRT片段約200ng到WJ2/pKD46電轉化感受態細胞，涂布Kan抗性平板，利用引物對pf kA-200-F/Kan-R、kan-F/pfkA-200-R(引物見表1)驗證轉化子，消抗后的轉化子利用引物對 pfkA-200-F/pfkA-200-R進行確認，最終構建得到W3110( Δ IacI，entDT5, ApfkA)重組菌 株，后續命名WJ4(參見表4)。
[0070] 此外還可以用完全阻斷EMP路徑。W3110基因組上有pgi基因，編碼磷酸葡萄糖異構 酶，它可逆的催化6-磷酸葡萄糖與6-磷酸果糖的相互轉化，從而將葡萄糖降解推向EMP途 徑。而敲除Pgi將阻止葡萄糖EMP途徑降解，使葡萄糖通過PPP來降解，從而增加 NADPH的合 成。W3110( Δ lad，entDT5，Δ pgi)構建以Red重組法完成構建。首先，利用引物對pgi-K-F/ Pgi-K-R(引物見表1)以pKD4質粒為模板，擴增含敲除IacI上下游同源臂的Kan-FRT重組片 段，并進行純化回收。然后，制備WJ2/pKD46電轉化感受態細胞。最后，電轉化Kan-FRT片段約 200ng到WJ2/pKD46電轉化感受態細胞，涂布Kan抗性平板，利用引物對pgi-200-F/Kan-R、 kan-F/pgi-200-R驗證轉化子，消抗后的轉化子利用引物對pgi-200-F/pgi-200-R進行確 認，最終構建得到W3110( Δ lad，entDT5，Δ pgi)重組菌株，后續命名WJ5(參見表4)。
[0071] WJ4和WJ5分別制備感受態細胞，轉化質粒pJ02,得到重組菌株WJ4/pJ02和WJ5/ PJ02，并以WJ2/pJ02作為對照菌株進行搖瓶發酵，以葡萄糖為碳源。發酵結果顯示WJ2/pJ02 菌濃達7.5，WJ4/pJ02和WJ5/pJ02的菌濃分別為6.0和4.3，說明pgi基因的敲除對菌體生長 有很大影響，可能是Pgi基因敲除可能導致6-磷酸葡萄糖積累，從而影響ptsG(Fused glucose-specific PTS enzyme IIBC components)mRNA的穩定性，最終減慢葡萄糖進入細 胞的速率;此外三個菌株均沒有檢測到9-癸烯酸，WJ2/pJ02產物比例72%，WJ4/pJ02和WJ5/ PJ02的產物9-癸烯醇分別為67%和49%。這些結果若按照IOD的菌量轉化率計算，兩個基因 敲除后均有助于提高以葡萄糖為碳源進行的9-癸烯酸甲酯的生物轉化，說明無論是磷酸葡 萄糖異構酶基因 Pgi的敲除還是6-磷酸果糖激酶基因的敲除都可以有效的減弱或是阻斷 EMP路徑，有助于使葡萄糖更多的流向PPP途徑，從而提高細胞NADPH積累。說明后續葡萄糖 為碳源可以進行此相關的宿主改造。
[0072]實施例7強化表達基因組上葡萄糖6-磷酸脫氫酶zwf基因 [0073]由實施例6結果可以看出，基因 pgj敲除菌株雖然產物得率有一定程度提高，說明 PPP途徑NADPH的積累對提高MSCAR的活性比較積極的促進作用，但是菌體生長速度減慢太 多，不能有效的提高生物轉化速率。W3110基因組上有zwf基因是編碼葡萄糖6-磷酸脫氫酶， 催化葡萄糖6-磷酸轉化為6-磷酸葡萄糖酸-δ-內酯，高度嚴格的以NADPH+作為電子受體，是 PPP途徑的關鍵酶之一，有研究報道zwf基因過表達有助于增大PPP路徑葡萄糖流量。因此， 構建W3110( Δ IacI，entDT5, Δ pgi，zwfPtrc)菌株十分必要，一方面是強化葡萄糖6-磷酸脫 氫酶zwf基因表達來降低6-磷酸葡萄糖的積累，另一方面也直接增加葡萄糖更多的通過PPP 進行代謝。
[0074] W3110( Δ lacI，entDT5, Apgi，zwfPtrc)的構建也是Red重組法完成，與實施例1構 建過程類似。首先構建基礎質粒，將Kan-FRT與Trc啟動子放在一個質粒上，命名pKan-Trc。 利用引物對pKD4-Nde I-F/pKD4-R將含Frt位點的Kan-Frt片段擴增下來，同時利用引物對將 Trc啟動子利用引物對Trc-F/Trc-HindII I-R從質粒pTrc99A上擴增下來，然后將pEZIO克隆 質粒進行Ndel/Hindll I雙酶切和切膠回收，得到的酶切載體與回收后Kan-Frt和Trc片段混 合后進行EZ重組，最終得到質粒pKan-Trc。然后進行基因組zwf基因啟動子敲除同時敲入含 啟動子Kan-FRT-Ptrc片段。利用引物對pTrc-K-F/pTrc-K-R(引物見表1)擴增得到含同源臂 的Kan-FRT-Ptrc同源敲除片段，并進行純化回收。然后，制備WJ5/pKD46電轉化感受態細胞。 最后，電轉化Kan-FRT-Ptrc片段約200ng到WJ5/pKD46電轉化感受態細胞，涂布Kan抗性平 板，利用引物對zwf-200-F/Kan-R、kan-F/zwf-200-R驗證轉化子，消抗后的轉化子利用引物 對進行確認，最終構建得到W3110( Δ IacI，entDT5，Δ pgi，zwfPto)重組菌株，后續命名WJ6 (參見表4)。制備感受態細胞，轉化質粒pJ02，得到重組菌株WJ6/pJ02。
[0075]按照上述搖瓶發酵過程，將重組菌株WJ6/pJ02進行發酵，WJ5/pJ02作為對照菌株， 葡萄糖為碳源。搖瓶結果顯示重組菌株WJ5/pJ02發酵結束后，底物9-癸烯酸甲酯殘留20% 左右，產物9-癸烯醇65 %左右;而重組菌株WJ6/pJ02發酵結束后底物殘留15 %左右，產物增 加值70%，副產物不變，而且菌濃液稍微有所增加。上述結果說明強化基因組上zwf基因的 表達有助于提高轉化率，可能是zwf基因的表達使葡萄糖向PPP路徑的速度提高，說明基因 組上一些基因的敲除和過表達對以葡萄糖為碳源進行發酵有促進作用。
[0076] 實施例8蛋白質工程優化羧酸還原酶和甲酯水解酶的表達
[0077] 脂肪酸甲酯到脂肪醇的生物轉化過程見圖1，整個過程涉及3個酶:脂肪酸甲酯水 解酶、羧酸還原酶以及醛還原酶。羧酸還原酶是整個反應過程的一個限速酶，主要是還原甲 酯水解酶催化產物脂肪酸;但甲酯水解酶也有可能表現酯合成或者酯交換的功能，在羧酸 還原酶活未及時將脂肪酸還原成脂肪醛的情況下可能會造成一些副產物的形成，因此平衡 酯還原酶和羧酸還原酶的表達對提高底物轉化率和純度尤為重要。
[0078] 通過蛋白質工程技術，使甲酯水解酶在不同的RBS序列下控制酯水解酶的表達，通 過檢測產物9-癸烯酸甲酯和副產物含量，比較獲得能顯著提高底物產量的重組菌株。
[0079] 首先，制備WJ2電轉化感受態細胞:挑取重組菌株單克隆WJ2到LB液體試管，37°C過 夜培養。次日，按照1:100接種至50ml無抗性LB液體培養基，37°C、200rpm培養2.5h左右至 0D600 = 0.8時，制備電轉化感受態細胞：1)培養好的菌體冰上預冷IOmin，然后4000rpm、4°C 離心10min，棄上清;2)用預冷10 %甘油離心洗滌菌體，4000rpm、4 °C離心10min，棄上清;3) 重復2)操作2次;4)加入10 %甘油濃縮100倍，分裝80ul/管。
[0080] 然后，準備 pEZ07-MsCar-alrA-RBSx-lcaE7 酶連片段：利用引物對 LcaE7-EcoRI-F/ LcaE7-HinIII-R(引物見表3)擴增兩邊分別帶EcoR I/Hind III酶切位點的含不同RBS序列 的的酯水解酶片段RBSx-lcaE7,純化回收后與載體pEZ07-MsCar-alrA-起進行EcoR 1/ Hind III雙酶切，分別回收后，利用T4 DNA連接酶于22°C進行連接，連接體系20ul，然后進 行過柱回收。最后向上述電轉化感受態細胞加入5ul純化后的連接液體，進行電轉化，并涂 布含100ng/mL Spe的抗性平板，若平板轉化子個數超過90個，則進行孔板篩選實驗。
[0081] 最后進行孔板初篩實驗：1)預培養：用牙簽分別挑取上述電轉化后的單克隆于含 IOOul的LB+Spe的96-微孔板，其中6個為positive control和6個negative control，1 個為 空白不挑菌，透氣膜封口。于96-孔板搖床30 °C、250rpm，75 %濕度過夜培養，一般培養16-20h即可達到飽和；2)轉接:過夜培養的孔板菌液吹打混勻，然后取IOul轉接至190ul TB+ Spe的96-淺孔板，30°(：、250印111，75%濕度培養2.511;3)誘導：加入16111稀釋的1?了6加入到96 淺孔板，至終濃為0.411^，25°(：、250印111，75%濕度誘導培養311，每個孔添加10111底物9-癸烯 酸甲酯(終濃度8g/L)，繼續培養過夜，18h進行制樣檢測;4)樣品制備：向反應微孔板直接加 入乙腈(稀釋8倍），用槍吹打混勻，移到深孔板，4000rpm離心10min，取上清加入到過濾板中 離心，然后進行GC檢測。結果見圖7。
[0082]圖7中GC結果顯示的是初篩得到的10株較好的重組菌株。首先，這10個孔的轉化基 本都有底物殘留，基本都比對照多一半，雖然也有酸殘留，但是比例比對照少了一半，關于 脂肪酸的比例較大，有可能是文獻報道的發酵過程采用TB培養基，營養過于豐富，使酯酶的 表達或是酶活得以提高；而且，產物比例基本上比對照菌株高出15%到24%;此外，脂肪酸 的比例也減少了很多，脂肪酸含量的減少一方面降低了對細胞的毒性，另一方面結果也顯 示了副產物的含量明顯降低。這些結果說明RBS文庫的構建和篩選一定程度上使脂肪酸甲 酯水解酶的活力得到了一些下調，以便于更好的匹配酸還原酶的活力。
[0083]對上述復篩得到的10個孔的重組菌株搖瓶發酵比較，以以上述M9改良培養基作為 發酵培養基，2 %甘油作為碳源，發酵過程ImM IPTG誘導，并添加底物9-癸烯酸甲酯300ul (約l〇g/L)，發酵結束后進行HPLC檢測產物9-癸烯醇的含量，結果見8。圖7結果顯示，從9-癸 烯醇的含量測定結果可以看出，初篩得到的10株重組菌株中WJ2/pEZ07-M SCar-alrA-lcaE7-A4、WJ2/pEZ07-MsCar-alrA-lcaE7-A9、WJ2/pEZ07-MsCar-alrA-lcaE7-A12 以及 WJ2/ pEZ07-MsCar-alrA-lcaE7-B2等得到的產物含量相差不大，分別為4.38g/L、4.13g/L、 4.12g/L、4.16g/L，后續分別命名為其中町2/?幾3^2/?幾4^2/?幾5^2/?幾6。后續重 組質粒的構建在以上基礎上進行深入研究。
[0084] 表3質粒構建引物表
[0087]實施例9羧酸還原酶基因定點突變重組質粒的構建
[0088]有文獻報道，羧酸還原酶基因 MsCar的第3位氨基酸由絲氨酸突變為精氨酸可以有 效提高羧酸還原酶的蛋白表達量，可能也會有效的提高9-癸烯酸甲酯到9-癸烯醇的轉化 率，因此構建重組質粒 pEZ07-MsCar3-alrA-lcaE7-A9,即 pJ07。
[0089] 首先，以 pJ04 質粒為模板，利用引物對 MsCar3-NcoI-F/MsCAR-XhoI-R、AlrA-XhoI-F/AlrA-EcoRI-R 和 LcaE7-32-EcoRI-F/LcaE7-R-HindIII (引物見表 3)，分別擴增兩端帶有 酶切位點的MsCAR、AlrA以及LcaE7片段，PCR產物進行回收后分別利用引物中帶有的酶切位 點進行雙酶切，得到NcoI-MsCAR-XhoI、XhoI-AlrA-EcoRI 以及 EcoRI-lcaE7-HindII I。然后， 將NcoI-MsCAR3-XhoI與Ncol/Xhol雙酶切的pEZ07進行連接，轉化TGl感受態細胞，得到 pEZ07-MsCAR3,然后將pEZ07-MsCAR3用Xho I和Hind III進行雙酶切后，與兩片段XhoI-alrA-EcoRI、EcoRI-lcaE7-HindIII-起進行連接轉化，最終將轉化子提取質粒，酶切驗證 和測序確認構建成功重組質粒P J07。最后將構建得到的重組質粒p J07轉化WJ2感受態細胞， 得到重組菌株WJ2/pJ07。
[0090] 實施例10組成型表達重組質粒的構建
[0091]上述構建的重組菌株在發酵過程都需要添加 IPTG或者乳糖作為誘導劑，一方面提 高了生產成本，另一方面誘導劑的添加使工業生產操作更為繁瑣，而且增大了染菌的可能 性，因此讓重組質粒由誘導型轉變為組成型，既可以節約成本，也能簡化實際工業化的操作 過程。
[0092]首先，構建組成型基礎重組質粒，利用擴環自連接的方式進行構建。分別在pEZ07 質粒IacI基因兩端設計引物對pEZ08-F/pEZ08-R，引物5'端分別帶有EcoRV的GAT和ATC堿 基。利用引物對pEZ08-F/pEZ08-R以質粒pEZ07為模板擴增得到片段，將PCR產物加入DpnI進 行模板消化，然后進行回收，得到的產物利用T4DNA連接酶進行連接，后轉化TGl感受態細 胞。挑取得到的克隆進行質粒提取和酶切驗證，正確的轉化子質粒送樣測序，測序引物08-YZ-F，最終構建得到無 IacI基因的基礎質粒pEZ08。
[0093]然后，構建重組質粒 pEZOS-MsCar-alrA-lcaETHpEZOS-MsCarf-alrA-lcaET-Ag， 即 pJ08 和 pJ09。 以 pJ04 質粒為模板 ，利用 引物對 MsCAR-NcoI-F/MsCAR-XhoI-R、MsCAR3-NcoI-F/MsCAR-XhoI-R、alrA-XhoI-F/LcaE7-R-HindIII，分別擴增兩端帶有酶切位點的 MsCAR、MsCAR3、以及alrA-lcaE7片段，3個PCR產物進行回收后分別利用引物中帶有的酶切 位點進行雙酶切，得到NcoI-MsCAR-XhoI、NcoI-MsCAR3-XhoI 以及XhoI-AlrA-lcaE7-HindIII。首先將 NcoI-MsCAR-XhoI 和 NcoI-MsCAR3-XhoI 分別與 Ncol/Xhol 雙酶切的 pEZ08 進 行連接和轉化，得到 pEZ08-MsCAR 和 pEZ08-MsCAR3,然后將 pEZ08-MsCAR 和 pEZ08-MsCAR3 分 別用XhoI和HindIII進行雙酶切后，并分別與片段XhoI-alrA-lcaE7-HindIII-起進行連接 轉化大腸桿菌TGl感受態細胞，最終得到的轉化子提取質粒后進行酶切驗證，確認構建得到 重組質粒PJ08和pJ09。
[0094]最后將構建得到的重組質粒p J08和pJ09分別轉化WJ2感受態細胞，得到重組菌株 WJ2/pJ08、WJ2/pJ09。
[0095]表4重組質粒或改造宿主索引表

[0098]實施例11誘導型表達、組成型表達及基因突變重組菌株搖瓶發酵比較 [0099] 將實施例9和實施例10中構建的重組菌株WJ2/pJ07、WJ2/pJ08、WJ2/pJ09進行搖瓶 發酵，同時以WJ2/pJ04作為對照菌株。4個菌株分別接種于5mL添加 100ng/ml Spe抗性的LB 培養基，于33°C、200rpm培養過夜。次日，分別取過夜培養的菌液IOOul加入到2mL含Spe抗性 的LB培養基，33°C、200rpm培養3h左右，全部加入到20mL的改良以2 %甘油作為碳源的M9發 酵培養基中，每個菌株挑取3個不同的轉化進行搖瓶發酵比較。轉接后于37°C、200rpm培養 4-5h，WJ2/pJ04、WJ2/pJ07等重組菌株搖瓶中加入誘導劑IPTG使其終濃度為ImM，誘導一系 列基因的表達，同時加入300ul底物9-癸烯酸甲酯（約12g/L); WJ2/pJ08、WJ2/pJ09重組菌株 為組成型質粒表達，因此不添加誘導劑，直接加入底物300ul;均置于37°C、200rpm發酵過 夜。次日，發酵搖瓶每瓶分別取出400uL發酵液于2mL離心管中，加入1.2mL的氯仿，萃取樣品 離心后過膜進行GC檢測；同時取樣Iml發酵液漩渦震蕩均勻，加入IOul甲酸溶液，準確量取 IOOuL發酵液加入900uL無水乙醇，漩渦震蕩3min后超聲15min，過0.22um有機濾膜進行HPLC 檢測，測定產物9-癸烯醇的含量。
[0100] 檢測結果見圖9和圖10。圖9為GC檢測結果，結果顯示發酵結束后四個菌株的產物 9_癸稀醇比例基本都在90 %左右，底物殘留3 %左右，副廣物基本在8 %左右，這些結果基本 可以顯示組成型表達可以有效替代誘導型表達，但是無論是組成型表達還是誘導型表達重 組菌株，MsCar點突變前后的差別不是很大，僅副產物的比例稍微有些波動。圖10為HPLC檢 測結果，確認9-癸烯醇的含量，從結果可以看出4個菌株的9-癸烯醇含量基本都在5.Og/L左 右，但是相對MsCar點突變重組菌株中9-癸烯醇的含量而言，無論是組成型表達還是誘導型 表達都比沒有突變的稍高一點，但是高出的幅度不是很明顯，可能在上罐條件下才能較好 的確認。
[0101] 上述發酵結果顯示：DMsCar基因3S-3R點突變可能對生物轉化效率的提高有一定 的作用，但是還需要罐上放大確認;2)組成型表達可以替代誘導型表達，不僅節約誘導劑的 成本，也能避免誘導劑對菌體的毒性，對于后面發酵放大也提供了便利。
[0102] 實施例12組成型和誘導型表達重組菌株5L罐發酵比較
[0103]種子培養基:LB培養基（蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化鈉10g/L、自來水定容2L， 自然pH)，滅菌鍋內121°C，20-30分鐘。
[0104] 發酵培養基：甘油25g/L、（NH4)2S〇4 20g/L、KH2P〇4 2g/L、NaCl lg/L、MgS〇4 · 7H20 1區凡、檸檬酸鐵0.0948/1丄&(：1*2!120 0.148/1、211(：120.018/1、微量元素了12 11^(母液配 方見表1)。
[0105] 補料成分:甘油、氨水、磷酸氫二鉀
[0106]分別挑取活化的單菌落WJ2/pJ04和WJ2/pJ08接入含100mg/L壯觀霉素的LB試管 中，200rpm，30°C培養過夜;次日，按照1 %的量轉接到含壯觀霉素的IOOmL LB搖瓶中，33°C， 200rpm培養4h左右，以5%接種量將搖瓶種子液接入含2L發酵培養基的5L發酵罐中。發酵參 數控制為:溫度33 °C，通過氨水維持發酵過程pH 6.8，溶氧30 %，通風量8L/min，攪拌轉速開 始200,后與溶氧偶聯。發酵開始4h后加入，WJ2/pJ04發酵罐加入IPTG至發酵終濃度為ImM， 進行誘導，WJ2/pJ08發酵罐不用添加 IPTG誘導。轉接發酵罐后第5個小時開始添加底物9-癸 烯酸甲酯，發酵8h開始補加甘油，控制發酵液甘油0.6-lg/L左右。發酵過程中定時取樣進行 GC檢測，通過底物殘留量以及9-癸烯酸的殘留量調整底物的添加速率，通過轉化率的變化 以及副產物含量波動決定發酵是否結束。此外，前期發酵罐優化過程發現，在發酵過程中， 通過添加磷酸氫二鉀增加菌體活力，可以有效延長發酵時間。發酵48h左右，2罐均出現轉速 下降現象，每罐中添加磷酸氫二鉀lmL，以增加菌體活力，隨后在WJ2/pJ04菌株發酵罐在 50h、56h、66h再進行補加，發酵67h轉化率下降，低于90 %，發酵結束，共添加底物353g，此時 罐體體積2.4L;WJ2/pJ04菌株發酵罐在50h、56h、64h等分別添加一定量的磷酸氫二鉀，68h 轉化率下降，低于90 %，發酵結束，共添加底物367g，此時罐體體積2.52L。
[0107] 兩個菌株發酵過程GC和HPLC檢測結果見圖11和圖12。如圖11兩個菌株發酵過程GC 監測結果顯示，整體比例和趨勢基本一致：1)整個發酵過程產物9-癸烯醇的含量基本維持 在90%以上，菌株WJ2/pJ04發酵66h轉化率降至90%，發酵結束，而菌株WJ2/pJ08發酵到68h 轉化率降至90%，發酵結束;2)底物9-癸烯酸甲酯的含量基本在1 %以內，中間產物9-癸烯 酸的比例基本都1 %左右;3)發酵過程中副產物的含量都是小幅度波動，但是整體上是一個 上升趨勢，在發酵快結束時副產物含量明顯提高至7 %左右，兩個菌株基本類似，為保證產 物純度，在監測到產物轉化率下降的情況下及時停止底物添加。如圖12兩個菌株發酵過程 HPLC檢測產物9-癸烯醇含量，兩個菌株發酵過程隨著時間延長，產物含量在持續增加，直到 發酵結束，最終WJ2/pJ04發酵結束時9-癸烯醇達105g/L，WJ2/pJ08發酵結束時9-癸烯醇達 110g/L〇
[0108] 上述GC和HPLC結果與之前的搖瓶比較結果一致，說明構建的組成新表達重組菌株 可以有效的取代誘導性表達，在菌株生長和轉化效率上基本不會有影響，而且還有可能會 更好，而且考慮到工業生產的操作便利性和成本，組成型表達重組菌株WJ2/pJ08更有優勢。
[0109] 實施例12操縱子整合到基因組重組菌株的構建及搖瓶發酵
[0110] 作為工業生產菌株，重組質粒在發酵過程中穩定性及表達量對基因轉化水平和菌 體生長速率的影響都是重要考慮的因素。作為質粒表達的重組菌株，首先在發酵過程中需 要添加抗生素維持質粒的穩定，但在工業生產上，抗生素的添加不僅增加成本，而且使操作 更加麻煩;其次，質粒表達過程啟動子的強弱、拷貝數的高低以及目標蛋白的過表達都會影 響會對菌體生長速率以及轉錄水平產生抑制，從而對生產有一定的影響。但是文獻報道，操 縱子整合到基因組上表達對菌體生長和基因轉錄水平基本沒有影響，而且基因組上的表達 更為穩定和方便。因此，操縱子整合到基因組上進行表達是工業菌株的一個發展趨勢。
[0111] 大腸桿菌基因組上有fhuA基因，編碼蛋白作為高鐵色素的轉運蛋白，而且還是噬 菌體T5、T1和UC-I等的受體，因此此基因的敲除可能會有效的菌株感染噬菌體的幾率，在工 業生產過程也是很有必要的。
[0112] 本專利中利用Red重組的方法將操縱子Ptrc-MsCar-alrA_lcaE7整合到改造菌株 WJ2基因組上。
[0113] 首先，構建pEZ08-MsCar-alrA-lcaE7-KanFRT，即pJ10。首先利用引物對Kan-HindII I-F/Kan-Sal I-R以質粒pKD4為模板，擴增兩端分別帶同源臂的Kan-FRT片段，直接進 行過柱純化后與HindII I/Sal I雙酶切的pJ04質粒進行無縫克隆重組，然后進行感受態細胞 轉化，得到的轉化子提取質粒后進行酶切驗證，構建成功質粒pEZ08-MsCar-alrA-lcaE7-KanFRT，即pJ10。
[0114] 然后，利用引物fhuA-Kin-F/fhuA-Kin-R，以質粒pJlO為模板，擴增兩端分別帶有 50bp同源臂的敲入片段Ptrc-MsCar-alrA-lcaE7-KanFRT，進行純化后約200ng片段加入 WJ2/pKD46電轉化感受態細胞，混勻，轉入0.1 cm電擊杯中，用電擊儀作電轉化。復蘇后涂于 含50ng/mL kan的LB平板，37°C過夜培養。
[0115] 最后，將得到的轉化子利用兩端引物fhuA-200-F/TRC-R、K2/fhuA-200-R進行驗證 轉化子驗證，驗證正確的轉化子進行化轉感受態制備，并轉化質粒PCP20，涂布含Cm抗性的 平板。30°C過夜培養后得到的單克隆接種于含20ng/ml Cm的LB試管，30°C培養4h后轉接到 LB無抗性液體培養基試管繼續培養4h后升溫42 °C，培養過夜，然后進行涂布LB平板，得到的 單克隆分別點板于LB+Amp、LB+Cm以及LB+Kan確認抗性片段消除成功，最后通過引物fhuA-200-F/TRC-R進行菌液PCR驗證，得到菌株W3110( Δ IacI，entDT5, Δ fhuA: :Ptrc-MsCar-alrA-lcaE7)重組菌株，后續命名WJ7。
[0116] 將WJ7和對照菌株WJ2/pJ08進行搖瓶發酵，按照實施例3的搖瓶發酵過程進行。碳 源為20g/L甘油，底物9-癸烯酸甲酯濃度12g/L，發酵時間20h。發酵結束后，WJ7和對照菌株 WJ2/pJ08兩菌株進行菌濃測定，分別為10.4和9.5，整合到基因組的偏好。此外GC檢測底物 轉化情況，產物9-癸烯醇的比例分別為89%和93%，副產物比例都是5%左右，而且HPLC結 果顯示，WJ7和對照菌株WJ2/pJ08最終得到的9-癸烯醇含量分別為4.56g/L和4.7g/L，這些 結果說明操縱子整合到基因組上可以正常表達和實現生物轉化，而且生物轉化的效率與質 粒表達相比相差不大，但是從穩定定和便利性上考慮，整合到基因組上更為有價值。
[0117] 上述實施例只為說明本發明的技術構思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術的人 士能夠了解本發明的內容并加以實施，并不能以此限制本發明的保護范圍，凡根據本發明 精神實質所作的等效變化或修飾，都應涵蓋在本發明的保護范圍內。
【主權項】
1. 一種改良重組大腸桿菌生產9-癸烯醇的方法，其特征在于，所述重組大腸桿菌中的 宿主菌株和表達質粒均被改造成能夠實現組成型表達。2. 根據權利要求1所述的改良重組大腸桿菌生產9-癸烯醇的方法，其特征在于，所述宿 主菌株的改造可以通過以下任一一種方式來實現： 1) 大腸桿菌中所有的編碼轉錄抑制蛋白的基因 lacl被敲除； 2) 大腸桿菌中所有的乳糖操縱基因 lacO被敲除。3. 根據權利要求1所述的改良重組大腸桿菌生產9-癸烯醇的方法，其特征在于，所述表 達質粒的改造可以通過以下任一一種方式來實現： 3) 將參與9-癸烯醇生物轉化的羧酸還原酶、醛還原酶及脂肪酸甲酯水解酶三個酶置于 組成型啟動子T5之后； 4) 將強啟動子trc系列的誘導型表達質粒上的lacl基因去掉，再將上述3個酶置于啟動 子Trc之后。4. 一種改良重組大腸桿菌生產9-癸烯醇的方法，其特征在于，所述重組大腸桿菌中的 脂肪酸甲酯水解酶的表達通過如下方法得到強化的： a) 通過蛋白質工程技術優化位于編碼脂肪酸甲酯水解酶基因起始密碼前的25位核苷 酸序列，優化得到的核苷酸序列為GTTAAATTTTTATAGGAGTTCAGTT; b) 對所述羧酸還原酶基因的第三個氨基酸，通過點突變技術將Ser突變為Arg，使羧酸 還原酶的蛋白表達量和活力與優化后的所述脂肪酸甲酯水解酶的活力相平衡。5. -種改良重組大腸桿菌生產9-癸烯醇的方法，其特征在于，所述大腸桿菌中的NADPH 的供給通過以下一種或多種方式得到提高： i)敲除葡萄糖代謝路徑中編碼6-磷酸果糖激酶的基因 pfkA; ? )敲除葡萄糖代謝路徑中編碼磷酸葡萄糖異構酶基因 pgi; iii)強化表達葡萄糖代謝路徑中編碼葡萄糖6-磷酸脫氫酶的基因 zwf。6. 根據權利要求5所述的改良重組大腸桿菌生產9-癸烯醇的方法，其特征在于，強化表 達葡萄糖代謝路徑中編碼葡萄糖6-磷酸脫氫酶的基因 zwf，其采用的啟動子為T5。
【文檔編號】C12N15/53GK106086082SQ201610377698
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月1日
【發明人】江君君, 田鋒, 平增強, 李曉輝, 胡志浩
【申請人】蘇州華賽生物工程技術有限公司