一種用于檢測PRRSV缺失變異株的Taqman Real-time RT-PCR試劑盒及其使用方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及檢測豬繁殖與呼吸綜合征病毒技術領域，具體說是一種用于檢測豬繁 殖與呼吸綜合征缺失變異株病毒的Taqman Real-time RT-PCR試劑盒，本發明還包括該試 劑盒的使用方法。
【背景技術】
[0002]豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS) 自二十世紀八十年代末期開始流行，1992年國際獸醫局正式命名，主要感染豬，尤其是母 豬，該病嚴重影響其生殖功能。研究人員從流行毒株缺失變異和豬繁殖與呼吸綜合征發生 時間順序以及出現頻率推測，所有高致病性豬藍耳病均來源于CH-la。流行病學資料也表明 所有HP-PRRSV中國分離毒株均具有相同的來源。高志強等和王旭榮等進行流行病學分析 時發現，Nsp2序列各毒株間差異也不盡相同，HB-2(sh)/2002與VR-2332、BJ-4、CH-la同源 性為78. 3%~88. 9% ;Jiangxi-3與BJ-4、CH-la、HB-lJXAl、Henan-l同源性分別為77%、 88%、94. 7%、98. 5%、98.4%。田克恭等總結了區別于傳統毒株的高致病性流行毒株的特 點為：Nsp2基因第481位缺失"L"氨基酸，533~561位連續缺失29個氨基酸。基于上述 原因，有必要建立針對缺失變異毒株的病原檢測方法。本發明針對缺失變異毒株基因特點 設計、建立了Taqman Real-time RT-PCR(探針法實時定量反轉錄-聚合酶鏈反應）檢測方 法，優化并組裝成試劑盒。
[0003] 目前，國內外就PRRSV的檢測方法而言，已有復合式RT-PCR方法，普通RT-PCR方 法，熒光定量RT-PCR方法，但是上述方法都是通用型的，只能檢測是否PRRSV感染，無法區 分哪種毒株感染引起，國內也沒有針對缺失變異株的檢測方法，國外檢測試劑檢測一份樣 品的價格往往是幾十元甚至上百元人民幣，成本過高使業主無法接受。

【發明內容】

[0004] 本發明要解決的技術問題是克服目前生產實踐中沒有針對缺失變異株PRRSV的 檢測方法的不足，提供一種用于能夠快速、敏感、準確以及低成本地檢測豬繁殖與呼吸綜合 征病毒缺失變異株的Taqman Real-time RT-PCR試劑盒。本發明還提供該試劑盒的使用方 法，本試劑盒及使用方法還適用于檢測低微含量的豬繁殖與呼吸綜合征缺失變異株病毒。
[0005] 為解決上述問題，本發明采用了下述技術方案：
[0006] -種用于檢測豬繁殖與呼吸綜合征缺失變異株病毒的TaqmanReal-timeRT-PCR 試劑盒，所述試劑盒包含OneStepRT-PCRbuffer、酶混合物、陽性對照、無RNA酶水、序列 SEQIDN0:1和SEQIDN0:2的引物及SEQIDN0:3的探針引物的混合物。
[0007] 所述序列SEQIDNO: 1至SEQIDN0:2引物混合物的包括：
[0008] SEQIDN0:1 :上游引物AGCACCGCGTAGAACTGTGACAA
[0009] SEQIDN0:2 :下游引物CAAGGCCCGCCAGAGTCG
[0010] 探針引物序列為：
[0011] SEQIDN0:3：AACGCTGACGCACCAGGATGAGCC
[0012] 所述探針引物的5'端標記物為FAM報告熒光基團、3'端標記物為TAMRA淬滅熒光 基團。
[0013] SEQIDN0:1至SEQIDN0:2的由5'端向3'端延長的序列：
[0014] SEQIDN0:4(286bp)：
[0016] 所述陰性對照為無RNA酶水。
[0017] 所述陽性對照為含有PRRSV缺失變異株基因序列的陽性質粒pGM-286,其構建方 式如下：
[0018]a.PRRSV缺失變異株基因組RNA的提取按QIAGENRNeasyMiniKit說明書進行操 作。以提取的病毒RNA為模版進行反轉錄合成cDNA。以SEQIDNO: 1及SEQIDNO: 2作為 引物擴增，反應條件為94°C預變性5min;94°C變性50s，54°C退火40s，72°C延伸50s，共30 個循環；72°C再延伸8min，4°C5min。PCR產物于10g/L的瓊脂糖凝膠中進行電泳鑒定。
[0019] b.PCR產物的克隆及序列分析
[0020] PCR產物用TaKaRa公司的膠回收試劑盒回收，將回收產物與pGEM-TEasy載體連 接，轉化大腸桿菌感受態細胞JM109感受態細胞，涂布于含100mg/L氨芐青霉素的LB平板 上，37°C培養12~16h。經藍白斑篩選后，用質粒（小量）提取試劑盒提取質粒，將序列測定 正確的質粒命名PGM-286,應用Nanodrop2000核酸蛋白分光光度計測定質粒濃度為358ng/ ul，計算出其拷貝數為1. 13xlOn(copies/ul)，本發明的試劑盒利用1. 13xl07(copies/ul) 濃度的質粒作為陽性對照以及10倍梯度比稀釋后作為標準曲線。
[0021] 本發明還提供了所述試劑盒用于檢測豬繁殖與呼吸綜合征缺失變異株病毒的使 用方法，包括以下步驟：
[0022] 實時熒光定量RT-PCR，反應體系如下：
[0023]a.OneStepRT-PCRbuffer:12. 5 份；
[0024]b.弓丨物濃度均為lOpmol/μ1的三條引物混合液3份，其中286bp上游引物1份， 286bp下游引物1份，探針引物1份；
[0025] c.酶混合物1份；
[0026]d.無RNA/DNA酶水 5. 5 份；
[0027]e.提取樣品的RNA模板3份；
[0028]f.陽性對照pGM-286陽性質粒3份；
[0029]g.陰性對照無DNA酶水3份。
[0030] 實時熒光定量RT-PCR，擴增條件如下：
[0031] 42°(：反轉錄5!1^11;94°(：預變性21^11;94 1€2〇8，退火溫度541€3〇8,721€2〇8,40個 循環。
[0032] 根據擴增結果，判定標準為：
[0033] 在NTC沒有Ct值的情況下，Ct值〈35判為陽性；Ct值介于35-40為可疑，需重復 檢測。再次測定時該樣品Ct值〈35為陽性，Ct值多35為陰性。也可以依擴增得到的Ct值 根據標準曲線對樣品進行準確定量。
[0034] 本發明彌補了PRRSV缺失變異株檢測上的薄弱環節，與普通RT-PCR方法相比，本 發明省時、省力，成本較低，并且比普通PCR的靈敏度高，對模板濃度要求較低，可用于檢測 低微含量的藍耳病病毒；無需電泳就可直觀的反應檢測結果，避免了溴化乙錠對人體健康 的危害；本發明在檢測過程中將反轉錄和PCR擴增過程在一步反應中完成，使得檢測時間 由原來的4-5小時縮短到現在的1-2小時，從而有利于快速檢測。同時本發明使用了探針 法，只有探針引物特異的結合到擴增的靶序列上時才會產生有效的結果，因此具有高度特 異，敏感和簡單等特點。使該方法與普通PCR方法相比具有更高的準確性，有助于PRRSV 缺失變異株的防控和隱性帶毒動物的剔除，避免造成大范圍的傳染。所述熒光定量方法可 以看到整個擴增過程、擴增效率、溶解溫度，利用已知起始拷貝數的標準品直接得到標準曲 線，只要獲得未知樣品的CT值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數，對樣品中 病毒含量進行精確定量。本發明試劑盒及其使用方法適用于任何實驗室和基層各級防控單 位、獸醫站及大中小型養殖場等，具有較好的應用前景。
【附圖說明】
[0035] 圖1為本發明制作的標準曲線。
[0036] 圖2為本發明樣本檢測圖。
[0037]圖1中橫坐標代表起始拷貝數的對數。縱坐標代表CT值。
【具體實施方式】
[0038] 下面結合實施例對本發明進行進一步詳細敘述
[0039] 實施例1
[0040]1、引物的設計和制備
[0041] 參照GenBank(基因庫）查找PRRSV變異株毒株十株，經序列比對尋找變異株特定 區域中的保守區段，選取該片段并設計一對擴增引物，一條探針引物，序列如下：
[0042] 擴增引物序列為：
[0043]SEQ ID N0:1 :上游引物AGCACCGCGTAGAACTGTGACAA
[0044] SEQ ID N0:2 :下游引物CAAGGCCCGCCAGAGTCG
[0045] 探針引物序列為：
[0046] SEQ ID NO:3 ：AACGCTGACGCACCAGGATGAGCC
[0047] 上述引物由大連寶生物工程有限公司合成并進行標記。
[0048] 陽性對照：本發明試劑盒的陽性對照是由中國農業科學院蘭州獸醫研究所構建并 保存。
[0049]2、制作陽性對照及其對應標準曲線
[0050] 陽性對照為含有PRRSV缺失變異株基因序列的陽性質粒pGM-286,其構建方式如 下：
[0051] a. PRRSV缺失變異株基因組RNA的提取按QIAGEN RNeasy Mini Kit說明書進行操 作。以提取的病毒RNA為模板進行反轉錄合成CDNA。以SEQIDN0:1及SEQIDN0:2作為 引物擴增，反應條件為94°C預變性5min;94°C變性50s，54°C退火40s，72°C延伸50s，共30 個循環；72°C再延伸8min，4°C5min。PCR產物于10g/L的瓊脂糖凝膠中進行電泳鑒定。
[0052] b. PCR產物的克隆及序列分析
[0053]PCR產物用TaKaRa公司的膠回收試劑盒回收，將回收產物與pGEM-TEasy載體連 接，轉化大腸桿菌感受態細胞JM109感受態細胞，涂布于含100mg/L氨芐青霉素的LB平板 上，37°C培養12~16h。經藍白斑篩選后，用質粒（小量）提取試劑盒提取質粒，將序列測定 正確的質粒命名PGM-286,應用Nanodrop2000核酸蛋白分光光度計測定質粒濃度為358ng/ ul，并計算出拷貝數為1. 13X10n(C〇pies/Ul)，將其10倍倍比稀釋后按照標準曲線制作程 序制作標準曲線，依標準曲線將1. 13xl07(copies/ul)濃度的質粒作為陽性對照。
[0054] 3、制備用于檢測10頭份的試劑盒
[0055] 本試劑盒由以下組分組成：
[0056]a.OneStepRT-PCRbuffer：125μ1；
[0057] b.引物濃度均為lOpmol/ μ 1的三條引物混合液30 μ 1，其中286bp上游引物 10yl，286bp下游引物10μ1，探針引物10μ1 ;
[0058]c.酶混合物10 μ 1 ;
[0059]d.無RNA/DNA酶水100 μ 1 ;
[0060]e.陽性對照pGM-286陽性質粒30 μ 1。
[0061] 4、用本發明試劑盒檢測豬繁殖與呼吸綜合征缺失變異株病毒
[0062](1) PCR總體系為25 μ 1。分別將本發明試劑盒中One St印RT-PCR buffer : 12. 5 μ 1、三條引物共3 μ 1、酶混合物1 μ 1、無RNA/DNA酶水5. 5 μ 1、提取樣品的RNA模板 3 μ 1、陽性對照pGM-286陽性質粒3 μ 1、陰性對照無DNA酶水3 μ 1，加入到0. 2ml擴增管中。
[0063] (2)分別向上述擴增管中加入陽性對照3μ1、從具有高熱癥狀的流行豬