鴨短喙長舌綜合征納米pcr檢測試劑盒及其檢驗方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及鴨短喙長舌綜合征的檢測技術領域。
【背景技術】
[0002] 2014年11月份以來，我國江蘇、安徽、山東、江西、河南、河北等省份，商品肉鴨群 發生了不明原因的以雛鴨發育遲緩，上下喙萎縮，舌頭外伸、腫脹、向下彎曲為特征的疾病。 根據其臨床表現，該病暫定名為"鴨短喙長舌綜合征"。該病的發病率為10-30%，嚴重時可 達50%以上，給我國養鴨業造成了巨大的經濟損失。目前已證實，該病的病原為新型鴨源細 小病毒，也稱為鴨短喙長舌綜合征病毒。
[0003] 鴨短喙長舌綜合征的檢測方法主要包括病毒分離、聚合酶鏈式反應（PCR)等，這些 方法在病毒檢測中發揮了重要作用。其中PCR檢測方法由于操作簡單，靈敏性高、重復性好 等優點被廣泛應用。但在實際應用中，PCR技術存在諸多局限性，例如對復雜體系的擴增會 出現非特異性產物擴增以及擴增效率不夠高等問題。為解決以上問題，尋找可以提高PCR 特異性和效率的添加劑顯得極其重要。
[0004] 納米PCR技術是一種新型的PCR技術，其原理是把粒徑為lnm~100nm的固相納 米金屬顆粒懸浮在液體中形成納米流體。由于納米材料具有良好的熱傳導性，因此在添加 了納米金顆粒的PCR循環體系中，PCR反應會更快地達到目標溫度，減少了在非目標溫度的 停留時間，進而縮短整個體系達到溫度平衡所用的時間，減少非特性擴增，提高特異性擴增 產量。因此，目前亟需建立一種能夠快速、特異的檢測鴨短喙長舌綜合征的納米PCR檢測手 段。
【發明內容】
[0005] 本發明針對上述現有技術的不足，提供了一種用于鴨短喙長舌綜合征檢測的納米 PCR試劑盒及其應用，該試劑盒能夠快速、特異的檢測鴨短喙長舌綜合征。
[0006] 本發明所采取的技術方案是：一種用于鴨短喙長舌綜合征檢測的納米PCR試劑 盒，包括蛋白酶K，裂解液，醋酸鈉，飽和酚：氯仿：異戊醇，無水乙醇，無菌蒸餾水，其特征在 于所述試劑盒還包括2XNan〇PCRMix、上游引物和下游引物；所述上游引物的序列為SEQ IDNo. 1所示，所述下游引物的序列為SEQIDNo. 2所示。
[0007] 引物是根據GenBank公布的鴨短喙長舌綜合征病毒序列，在其Rep與VP1基因保 守序列區域設計的一對特異性引物。
[0008] 優選的，2XNanoPCRMix由DNA聚合酶、2XNanoPCRbuffer和dNTPMixture組 成。
[0009] 優選的，所述試劑盒還包括DNA提取試劑：蛋白酶K，裂解液，醋酸鈉，飽和酚：氯仿 :異戊醇，無水乙醇，無菌蒸餾水。
[0010] 優選的，所述試劑盒還包括陽性對照。
[0011] 其中，陽性對照可為將鴨短喙長舌綜合征病毒接種9-11日齡鴨胚后，收集96~ 144小時感染鴨胚的尿囊液。
[0012] 本發明還提出了所述的試劑盒在制備檢測待測樣品中是否含有鴨短喙長舌綜合 征病毒的產品中的應用。
[0013] 應用所述試劑盒檢測待測樣品中是否含有鴨短喙長舌綜合征病毒的方法，包括如 下步驟： 1、病毒DNA的提取 取300yL經過預處理的待測樣品置于1.5mL離心管中，加入10mg/ml蛋白酶K10μL，裂解液300μL，50°C孵育2h后加入610μLtris飽和酚，充分震蕩5min，12000rpm 離心10min;將上清轉移至新1. 5mL離心管中加等體積酸：氯仿：異戊醇（1 :24 :25)，充分 混勾12000rpm離心10min;取上清，加酸：氯仿：異戊醇重復抽提一次；抽提后將上清轉移 至新1. 5mL離心管中，加入2倍體積冰浴后無水乙醇，1/10體積3mol/L醋酸鈉，-20°C沉 淀45min后12000rpm離心10min，棄上清，真空干燥箱干燥5min，用20μL無菌蒸餾水 溶解沉淀，-20 °C貯存備用。
[0014] 待測樣品可為鴨脾臟、肝臟等組織。其中，待測樣品預處理的方法為：將待測樣品 剪碎后，按照1:5的質量體積比加入生理鹽水并研磨均勻，3000~5000rpm離心5~10 min后取上清，之后再進行DNA的提取。
[0015] 2、納米PCR反應 在反應管中加入10yL2XNanoPCR Mix、lyL上述DNA溶液、0.5yL1〇μΜ的上游引 物（SEQIDNo.1)、0. 5yL1〇μΜ的下游引物（SEQIDNo.2)，最后加入無核酸酶水至總體 積為20μL。
[0016] 混勻后按如下反應程序進行：94°C3min，l個循環；94°C 10s，55°C 40 s，72°C 20 s，共30個循環；72°C 5min1個循環。反應結束后，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR擴 增產物，若出現659 bp大小的條帶則待測樣品含有鴨短喙長舌綜合征病毒。
[0017] 本發明提供了一對檢測鴨短喙長舌綜合征病毒的特異性引物，利用其制成的納米 PCR試劑盒，能夠快速、特異的檢測鴨短喙長舌綜合征病毒。本發明可使PCR反應更快地達 到目標溫度，減少了在非目標溫度的停留時間，進而縮短整個體系達到溫度平衡所用的時 間，大大提高了鴨短喙長舌綜合征的檢測效率，并有效提高了鴨短喙長舌綜合征病毒的特 異性擴增產量，減少了非特異性擴增，具有很好的應用前景。
【附圖說明】
[0018] 圖1為鴨短喙長舌綜合征納米PCR檢測結果； M:DL2000Marker ;1:陽性對照；2:陰性對照； 圖2為鴨短喙長舌綜合征納米PCR敏感性檢測結果； M: DL2000 Marker ;1~6依次為10°~105倍比稀釋病毒核酸的擴增產物；7:陰性對 昭. ， 圖3為鴨短喙長舌綜合征納米PCR特異性檢測結果。
[0019] M:DL2000 Marker ;1:鴨短U彖長舌綜合征病毒；2:鴨痕病毒；3:鴨肝炎病毒；4: 新城疫病毒；5 :禽流感病毒；6 :陰性對照。
【具體實施方式】
[0020] 下面參照附圖并結合實施例對本發明作進一步詳細描述。但是本發明不限于所 給出的例子。下述實施例中所使用的實驗方法，如無特別說明，均為常規方法。下述實施例 中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0021] 實施例1一種檢測鴨短喙長舌綜合征的納米PCR試劑盒最佳實施例 本實施例試劑盒包括：（1)鴨短喙長舌綜合征DNA提取試劑：蛋白酶K，裂解液，醋酸 鈉，飽和酚：氯仿：異戊醇，無水乙醇，無菌蒸餾水。
[0022](2)納米PCR反應試劑：2XNanoPCRMix、上游引物、下游引物；（4)其他：陽 性對照和無核酸酶水。其中，2XNanoPCRMix由DNA聚合酶、2XNan