專利名稱：一種用于檢測鵝圓環病毒的引物和探針的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種用于檢測鵝圓環病毒的引物和探針。
背景技術：
圓環病毒為無囊膜、二十面體對稱的動物病毒，其結構簡單，復制需要依賴于旺盛 的宿主細胞活力，增殖速度快的淋巴細胞是圓環病毒侵染的主要宿主。因此，圓環病毒感染 往往導致機體免疫混亂、免疫力下降，進而引起多種條件性病原的二次感染。它主要侵害免 疫系統，會引起病毒誘導性淋巴組織損傷類似，使動物機體易遭受其它病原并發和繼發感
^fe ο鵝圓環病毒(GoCV)最早于1999年由德國學者Soike等從患病鵝病理組織中觀察 到。病鵝主要表現發育不良、體重下降、羽毛凌亂等，病理組織學檢查發現法氏囊、脾臟和胸 腺的淋巴細胞減少，其中法氏囊病變最明顯，甚至出現整個囊結構的破壞，并可觀察到嗜堿 性的包涵體。到目前為止，圓環病毒屬除PCV (PCV1和PCV2)可以在PK-15細胞中繁殖外，其余 成員均尚未能在細胞中培養成功，大大限制了對其進行深入研究，因而病原診斷方法相對 較少。已建立的診斷方法有電鏡法、核酸探針技術、聚合酶鏈式反應法等。熒光PCR是在普 通PCR的基礎上，在擴增反應體系中加入一對特異性引物的同時再加入一個特異性的熒光 探針，使用實時監測的熒光PCR檢測儀來檢測靶核苷酸序列的技術，具有特異性強、靈敏度 高、定量準確、適用性廣等優點。目前，國內外還沒有針對鵝圓環病毒檢測的熒光定量PCR 方法，但該屬其他類型病毒如豬圓環病毒和鴿圓環病毒均已經有相應的熒光定量PCR檢測 方法。本發明的建立可填補國內外相關領域空白。

發明內容
本發明的目的是提供一種用于檢測鵝圓環病毒的弓丨物和探針。為達到上述目的，本發明采用以下技術方案 用于檢測鵝圓環病毒的引物和探針包括
1、一種用于檢測鵝圓環病毒的引物，其特征在于，所述引物序列如下 PCR 上游引物5，-AGGTAATGGTTGCTTCTACTGTTAG -3，， PCR 下游引物5，-GTGGTATTCTACGGAATGGGTATG -3，。2、一種用于檢測鵝圓環病毒的探針，其特征在于，所述探針序列為 5' -ACAAGCCGAGGACACAGCAGCACC-3，。所使用的探針為兩端分別標記熒光報告基團(R)和熒光淬滅基團(Q)的寡核苷 酸。利用本發明的引物和探針可用于對鵝圓環病毒的相應基因進行檢測，尤其適用于 基于熒光定量PCR技術的檢測。通過對反應體系和反應條件的各種優化，建立一套可用于 檢測鵝圓環病毒的熒光定量PCR方法。
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具體操作方法如下
1、引物和探針設計參考GenBank中的鵝圓環病毒的全基因核苷酸序列，利用 Lasergene ν 7.1 DNAStar軟件進行同源性分析比較，利用01igo6. 0軟件，設計引物和探 針，探針合成同時進行兩端熒光標記，探針5’端標記的熒光報告基團是FAM，3’端標記的熒 光淬滅基團為Eclipse，采用BLAST工具進行檢索，初步驗證其特異性。2、反應體系的優化優化出的20 μ L最佳反應體系為SYBR Premix Ex Taq 10 μ L、上、下游引物(10 ymol/L)各 0.2 μ L、熒光探針(10 μ mol/L)0. 4 μ L、模板 2 μ L、水 補足至20 UL0最佳反應條件為95 °C, 2 min預變性；95 °C，15 s，65 V, 20 s，共40個 循環。3、陽性標準品的制備以提取的鵝圓環病毒DNA為模板，按照常規方法進行PCR擴 增，將擴增的產物回收、純化，連接到PMD18-T載體上，轉化，提取質粒，得到陽性標準品。4、標準曲線的建立以優化的反應體系進行PCR擴增，以拷貝數為橫坐標，以Ct值 為縱坐標建立標準曲線，判定陽性的標準。該方法可用于鵝圓環病毒的流行病學檢測，為疾病的早期預防控制奠定技術基 礎。同時，該方法的建立為研究該病原的復制動力學提供檢測平臺。本發明的有益效果
本發明根據GenBank登錄的所有鵝圓環病毒全基因序列，設計引物和探針，于國內外 首先建立鵝圓環病毒的熒光定量PCR方法，該方法靈敏度高，最低可檢測453copies，特異 性強，重復性好。


圖1鵝圓環病毒的熒光定量PCR方法的擴增曲線； 圖2為鵝圓環病毒的熒光定量PCR方法的標準曲線。
具體實施例方式實施例1鵝圓環病毒的熒光定量PCR方法的建立 一、材料
鵝圓環病毒(GenBank登錄號GU320569)
GPV, APMV-UGRV病毒保存于福建省農業科學院畜牧獸醫研究所。二、步驟
1、儀器與試劑Mastercycler ep realplex熒光定量PCR儀，購自印pendorf■公 司；PrimeScript RT-PCR Kit (Perfect Real Time)購自寶生物工程(大連)有限公司、 PrimeScript RT reagent Kit、pMD18_T 載體、DL2000 Marker 均購自寶生物工程(大連) 有限公司；膠回收試劑盒、質粒小量抽提試劑盒購自Omega Bio-Tek ；GoTaq Master Green Mix購自Promega ；熒光定量PCR管購自Axygen。2.引物和探針的特異性
引物和探針的特異性是本實驗所建立方法的最重要因素。根據GenBank登錄所有鵝圓 環病毒全基因序列，通過比對分析，設計引物和探針。3、陽性標準品的制備以常規方法提取鵝圓環病毒基因組DNA。用所設計的特異性引物(上游 5，-GGCAGGATGTGGTTGTGATGG-3，；下游5，-TCAGGAATCCCTGCA GGTGA-3，，擴增片段大小約 1400 nt，進行 PCR擴增后，擴增體系為 50μ L，其中 2XGoTaq Master Green Mix 25yL、上 下游引物(20yM/mL)各lyL、cDNAlyL、滅菌去離子水22 μ L。反應條件為94°C預變性 5min，隨后進行94°C 50s、54°C 35s、72°C 2min循環30個循環后，72°C延伸lOmin。反應 結束后，取PCR產物5 μ L，在1.0%瓊脂糖凝膠上電泳。將PCR產物經膠回收試劑盒純化后 與pMDIS-T載體連接，轉化DH5 α感受態細胞，用PCR和雙酶切方法鑒定重組質粒。陽性重 組質粒進行序列測定。測序結果表明，陽性重組質粒符合預期，即做為陽性標準品。4.反應條件的優化
采用 20 μL反應體系[PremixExTaq2X) 10 μ L，PCR上游引物(10 μ mol/L)0. 2 μ L， PCR下游引物(10 μ mol/L) 0. 2 μ L,熒光探針(10 μ mol/L) 0. 4 μ L，倍比稀釋后的陽性標準 品2 μ L，補水至終體積20 μ L，以出現最高的熒光值(Δ Rn)、最小的Ct值以及在熔解曲線 分析中不出現非特異性峰為指標，分別對退火溫度(55 68°C)和引物濃度(0. 2 1. 0 μ mol/L)進行優化。5、建立的標準曲線
用紫外分光光度計測定陽性標準品260 nm處光吸收值(A260)，計算DNA拷貝數，隨后 將陽性標準品進行連續10倍系列稀釋(KT1 10_7)，以優化的條件進行擴增，以拷貝數為 橫坐標，以Ct值為縱坐標建立標準曲線。對陽性標準品的擴增曲線和標準曲線顯示，熒光定量PCR方法對鵝圓環病毒的最 低檢測限為453拷貝數/反應，并且CT與拷貝數在4. 53X IO2 4. 53X IO7拷貝/反應范 圍內有很好的線性關系，相關系數為0. 993，擴增效率為106%。擴增曲線見圖1，標準曲線見 圖2。6特異性檢測
6. 1特異性檢測
用優化的條件分別檢測GPV、APMV-I、GRV病毒核酸樣品，進行檢測，對其特異性進行評 價。結果檢測均為陰性，熒光定量PCR產物也未見條帶。6. 2可重復性及再現性評估
對同一陽性標準品設4個重復管，用實時熒光定量RT-PCR進行檢測，評價其重復性， 計算組內變異系數；將陽性標準品置于一 20°C冰箱保存，分別于第7、14、21d重檢，評價其 再現性，計算其組間變異系數。計算得組內變異系數為0.56% 1.68%，組間變異系數為 0. 91% 2. 53%，可重復性好。
權利要求
一種用于檢測鵝圓環病毒的引物，其特征在于，所述引物序列如下上游引物5’ AGGTAATGGTTGCTTCTACTGTTAG 3’，下游引物5’ GTGGTATTCTACGGAATGGGTATG 3’。
2.一種用于檢測鵝圓環病毒的探針，其特征在于，所述探針序列為 5' -ACAAGCCGAGGACACAGCAGCACC-3，。
全文摘要
本發明提供了一種用于檢測鵝圓環病毒的引物和探針，所述引物序列為上游引物5’-AGGTAATGGTTGCTTCTACTGTTAG-3’，下游引物5’-GTGGTATTCTACGGAATGGGTATG-3’，所述探針序列為5’-ACAAGCCGAGGACACAGCAGCACC-3’。本發明根據GenBank登錄的所有鵝圓環病毒全基因序列，設計引物和探針，于國內外首先建立鵝圓環病毒的熒光定量PCR方法，該方法靈敏度高，最低可檢測453copies，特異性強，重復性好。
文檔編號C12N15/11GK101942528SQ20101051289
公開日2011年1月12日 申請日期2010年10月20日 優先權日2010年10月20日
發明者萬春和, 傅光華, 施少華, 林建生, 林芳, 程龍飛, 陳紅梅, 黃瑜 申請人:福建省農業科學院畜牧獸醫研究所